Name: लेखक स्पॉटलाइट: इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके माइक्रोबियल ऑटोएग्रीगेशन में अनुसंधान को आगे बढ़ाना
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Research in Microbial Auto Aggregation Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

इस काम को इज़राइली साइंस फाउंडेशन (ग्रांट 119/16) और आईएमओएच ग्रांट (3-15656) द्वारा आईकेजी को समर्थित किया गया था। आर.एस. क्रेटमैन फैलोशिप द्वारा समर्थित।

उदाहरण के रूप में Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) के लिए टेम्पलेट के साथ .ast फ़ाइल, पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में प्रदान की गई है।
1. मीडिया की तैयारी
<ol><li>निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए लैक्टोबै?...

इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके माइक्रोबियल ऑटोएग्रीगेशन का मात्रात्मक विश्लेषण

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells.">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars.">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).</li><li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota.">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268 (2021).</li><li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92.">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li><li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+&amp;#34;Dried+Ossban&amp;#34;.">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &amp;#34;Dried Ossban&amp;#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus&lt;/em&gt;+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production.">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus&lt;/em&gt; GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

फ्लो साइटोमेट्री यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, लेकिन यह उनके बड़े आकार या छोटे समुच्चय के कारण बैक्टीरिया ?...

बैक्टीरियल ऑटोएग्रीगेशन को बायोफिल्म निर्माण में एक प्राथमिक कदम माना जाता है। इस प्रक्रिया में (कभी-कभी ऑटोग्लूटिनेशन या फ्लोक्यूलेशन भी कहा जाता है), एक ही प्रकार के बैक्टीरिया बहुकोशिकीय गुच्छों का निर्माण करते हैं जो अंततः संस्कृति ट्यूबों के तल पर बस जाते हैं या उनके लक्ष्य ऊतक या सतह1 से जुड़ते हैं।
ऑटोएग्रीगेशन एक व्यापक रूप से देखी गई घटना है और अब तक ग्राम-नकारात्मक रोगजनकों जैसे अवसरवादी रोगज़नक़ एसिनेटोबैक्टर बाउमानी2, दंत रोगज़नक़ एग्रेगोबैक्टर एक्टिनोमाइसेटेमकोमिटन्स3, और उभरते रोगज़नक़ बर्कहोल्डरिया स्यूडोमैली4 में दिखाया गया है। ऑटोएग्रीगेशन को कई प्रोबायोटिक ग्राम-पॉजिटिवउपभेदों 5,6,7,8में भी वर्णित किया गया है। लैक्टोबैसिलस (एल) एसिडोफिलस में, ऑटोएग्रीगेशन आंशिक रूप से एस-लेयर प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता किया गया था और जाइलन7 के लिए एक आसंजन के साथ सहसंबद्ध था। इसी तरह, हमें ग्लूकोज-निर्भर ऑटोएग्रीगेशन और चिपकने वाले गुणों के प्रेरण के बीच एक संबंध मिला (जैसा कि म्यूसिन के आसंजन द्वारा निर्णय लिया गया है) प्रोबायोटिक प्रजातियों लैक्टिकेसिबैसिलस रमनोसस जीजी, लैक्टिकेसिबैसिलस केसी, एल. एसिडोफिलस, लैक्टिकेसिबैसिलस पैराकेसी, और लैक्टिप्लांटिबैसिलस प्लांटरम5. वृद्धि हुई autoagagation सबसे अधिक संभावना ग्लूकोज और उसके catabolites9 के जवाब में सेलुलर आसंजनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन परिलक्षित होता है. जबकि स्वत: एकत्रीकरण के आणविक तंत्र निर्धारित किया जा करने के लिए रहते हैं, यह दिखाया गया है कि इस प्रक्रिया एकत्रित बैक्टीरिया के फेनोटाइप बदल जाता है और उन्हें पर्यावरण तनाव1, साथ ही कोरम संवेदन अणुओं10 के लिए वृद्धि हुई संवेदनशीलता के लिए बढ़ाया सहिष्णुता अनुदान.
ऑटोएग्रीगेशन को मापने के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है; एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण संस्कृतियों एक निश्चित समय के लिए संकीर्ण संस्कृति ट्यूबों में स्थिर खड़े जाने के लिए है. नियंत्रण संस्कृतियां अशांत रहती हैं, जबकि ऑटोएग्रीगेशन संस्कृतियां ट्यूब के निचले भाग में बस जाएंगी। एक अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोण अवसादन या परख11 निपटाने से स्वत: एकत्रीकरण उपायों.
बैक्टीरियल ऑटोएग्रीगेशन की जांच के लिए हाल के वर्षों में फ्लो साइटोमेट्री को भी तेजी से नियोजित किया गया है। यह विधि आकार में लगभग 0.5 और 1000 माइक्रोन के बीच कणों का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है। एकल जीवाणु या गठित समुच्चय तरल पदार्थ में निलंबित कर रहे हैं, एक धारा में खिलाया, और एक11 के द्वारा एक पता लगाया जा सकता है. आगे बिखरे हुए प्रकाश रिकॉर्डिंग सेल या कुल के सापेक्ष आकार को मापने की अनुमति देता है. यह अपेक्षाकृत तेज़ और सीधा है लेकिन कई मापदंडों का पता नहीं लगा सकता है, जैसे कि कुल आकार या समुच्चय में कोशिकाओं की औसत संख्या। इसलिए, इस दृष्टिकोण को सूक्ष्म रूप से पूरक किया जा सकता है, जिससे अधिक मापदंडों को12 की जांच की जा सकती है। हालांकि, पारंपरिक माइक्रोस्कोपी समय लेने वाली है और इस तरह परीक्षण किए गए नमूनों की संख्या और विश्लेषण की सांख्यिकीय शक्ति को सीमित करती है। सामान्य में, इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में कई विशेषताएं प्रदान करती है, जैसे सेल आकृति विज्ञान और फेनोटाइप का एक साथ विश्लेषण, छवि-आधारित विश्लेषण का संचालन, दुर्लभ घटनाओं का पता लगाना और प्रवाह साइटोमेट्री डेटा13को मान्य करना। ये लाभ प्रवाह साइटोमेट्री की क्षमताओं को बढ़ाते हैं और सेल आबादी की अधिक विस्तृत परीक्षा की सुविधा प्रदान करते हैं।
यह अध्ययन लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया (एलएबी) में ऑटोएग्रीगेशन की निगरानी के लिए इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री के लिए एक मूल्यवान प्रोटोकॉल प्रदान करता है। ये ग्राम-पॉजिटिव रॉड फैकल्टी एनारोबेस हैं और एलएबी समूह से संबंधित हैं। ये कुशल ग्लूकोज किण्वक कार्बोहाइड्रेट चयापचय14 के अपने मुख्य अंत उत्पाद के रूप में लैक्टिक एसिड उत्पन्न. ये बैक्टीरिया माइक्रोबायोम के लाभकारी कोर सदस्य हैं और स्वाभाविक रूप से मनुष्यों और जानवरों के जठरांत्र संबंधी मार्ग (जीआईटी) में पाए जाते हैं, साथ ही महिलाओं के मूत्रजननांगी पथ में15. इसलिए, उनके ऑटोएग्रीगेशन गुणों का सटीक लक्षण वर्णन उच्च जैव प्रौद्योगिकी और नैदानिक रुचि का है।
हमारे पिछले निष्कर्षों ने संकेत दिया कि ऑटोएग्रीगेशन का बेसल स्तर विभिन्न प्रोबायोटिक उपभेदों के बीच भिन्न होता है। यह विषमता कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न कार्बोहाइड्रेट से प्रभावित होतीहै 5. प्रोबायोटिक बैक्टीरिया की इस मौलिक संपत्ति को दूर करने के लिए, आहार से कार्बोहाइड्रेट के प्रभाव IFC का उपयोग कर एकल कोशिका स्तर पर autoaggregation पर नजर रखी गई. यह IFC आधारित दृष्टिकोण शक्ति और माइक्रोस्कोप के संकल्प के साथ पारंपरिक प्रवाह cytometers की गति को जोड़ती है. इसलिए, यह एक फेनोटाइपिक रूप से परिभाषित तरीके16,17 में उच्च दर जटिल morphometric माप की अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण को अन्य प्रोबायोटिक और रोगजनक बैक्टीरिया तक बढ़ाया जा सकता है, जीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ संयुक्त, और विषम समुच्चय में विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति और प्रचुरता की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले उपभेद।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

लाभकारी और प्रोबायोटिक बैक्टीरिया अपने मेजबानों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं, संक्रामक रोगों के लिए प्रतिरक्षा सहित विभिन्न स्वास्थ्य लाभ प्रदान करते हैं। लैक्टोबैसिलेसी परिवार में प्रोबायोटिक गुणों की पुष्टि के साथ ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया होते हैं। यह अध्ययन सेलुलर एकत्रीकरण का अध्ययन करने में एकल-कोशिका उच्च थ्रूपुट विश्लेषण की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए एक मॉडल के रूप में लैक्टोबैसिलेसी प्रजातियों का उपयोग करता है। आहार से सरल कार्बोहाइड्रेट के लिए इन लाभकारी प्रजातियों की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
अध्ययन से पता चलता है कि इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (आईएफसी) कार्बोहाइड्रेट की उपस्थिति और अनुपस्थिति में प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के संयोजन में मूलभूत अंतर को कैसे दूर कर सकता है। IFC माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प के साथ पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की शक्ति और गति को जोड़ती है, लाभकारी जीवाणु उपभेदों और स्थितियों के पुस्तकालय में एक फेनोटाइपिक रूप से परिभाषित तरीके से उच्च दर जटिल मॉर्फोमेट्रिक माप को सक्षम करती है। यह प्रोटोकॉल लैक्टोबैसिलेसी प्रजातियों के ऑटोएग्रीगेशन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और आहार कार्बोहाइड्रेट के प्रति उनकी प्रतिक्रिया पर प्रकाश डालता है, इन प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के लाभकारी प्रभावों के पीछे तंत्र को समझने में योगदान देता है।

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

लेखक स्पॉटलाइट: इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके माइक्रोबियल ऑटोएग्रीगेशन में अनुसंधान को आगे बढ़ाना

इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री माइक्रोबियल ऑटोएग्रीगेशन का अध्ययन करने के लिए

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

परिणाम बताते हैं कि यह विधि एलएबी बैक्टीरिया में आहार शर्करा के जवाब में ऑटोएग्रीगेशन में अंतर को आसानी से माप सकती है। समुच्चय से व्यक्तियों को अलग करके, विधि आहार से किण्वित या गैर-किण्वित शर्करा के ?...

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यह प्रोटोकॉल इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके माइक्रोबियल ऑटोएग्रीगेशन को मापने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करता है।

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

इस अध्ययन ने माइक्रोबियल ऑटोएग्रीगेशन का अध्ययन करने में इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए एक मॉडल के रूप में लैक्टोबैसिलस प्रजातियों का उपयोग किया। आहार से सरल कार्बोहाइड्रेट के लिए लैक्टोबैसिलस प्रजातियों के ऑटोएग्रीगेशन की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है। ऑटोएग्रीगेशन को मापने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधियां वर्णक्रमीय फोटोमेट्री हैं, जो माइक्रोबियल निलंबन, मैलापन, या ऑप्टिकल घनत्व, और पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तकनीकों, जैसे उज्ज्वल क्षेत्र, चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को मापती हैं।जब hight-throughput इमेजिंग के बारे में बात कर रहे हैं, एक प्रमुख प्रयोगात्मक चुनौती एकल घटना विभाजन है. इस प्रोटोकॉल में, यह एक एकल समुच्चय है। इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री इस चुनौती को सुरुचिपूर्ण ढंग से संबोधित करती है और शोधकर्ताओं को ऑटोएग्रीगेशन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण देती है।

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Start by inoculating five milliliters of lactobacilli MRS broth with a single colony of the lactobacilli strain, incubated at 37 degrees Celsius under static conditions overnight. Dilute the cell culture in a one-to-100 ratio in three milliliters of 50%supplemented tryptic soy broth, vortex the culture, and incubate it. Then invert the tube to mix the cells in the medium before transferring 200 to 300 microliters of the sample into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube.

लैक्टोबैसिलेसी फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

To begin the flow cytometric analysis, first set the 785-nanometer laser to a power of five milliwatts for dark field measurements. Use a 60X lens with a numerical aperture of 0.9. Then select the high-sensitivity setting and set the speed to low.To ensure calibration bead stability, press the Play button in the fluidics box and examine the bead images, which should appear sharp and clear. Generate a new scatterplot in the workspace box by selecting New Scatterplot. Then select the area in the Brightfield channel that corresponds to the SSC channel intensity and exclude the calibration beads that are running concurrently within the sample.Next, press the Load button and position a tube containing the Lactobacilli sample in the holder. In the Acquisition Settings box, enter the sample name and specify the location for data storage. Set the number of events to be collected, typically within the range of 10, 000 to 20, 000 events.Now, begin the acquisition process by clicking the Record button located in the Acquisition box. The process will halt after reaching the specified volume of events. Press the Return button to unload the tube and remove it from the holder as prompted in the popup window.After repeating the process for all samples, save the template to maintain data acquisition uniformity. For data analysis, to load the raw file into the analysis software, click on File and open the rif file. In the opened window, select Use Acquisition Analysis and then click OK.Next, to create a histogram of the gradient root mean square, click the New Histogram button and choose the population from the acquisition to analyze.Under the X Axis feature, select Gradient RMS of the Brightfield channel. Next, place a gate to exclude non-focused events by clicking the Create Line Region button in the analysis area. Create a scatterplot of the area versus the aspect ratio by clicking the New Scatterplot button in the analysis area.Select the focused population in the New Scatterplot window. Then select the area of the Brightfield channel for the X-Axis feature. Choose the aspect ratio for the Y-Axis feature.Draw a gate on the scatterplot using the Create Rectangle button based on the area value for the aggregate events population. Similarly, draw another gate for the singles and small aggregates population. Save your data analysis as a template by clicking the File tab, choosing Save As Template ast, and then open the next sample file under the same template to create the data analysis file.To measure the aggregate size distribution, start by plotting a histogram of the area of the aggregation events population. Save the data analysis by clicking on the file and selecting the Save As Template option. After saving, open the next sample file under the same template for the data analysis file.Single cells, small aggregates, large aggregates, and chains were observed in LGG and L.paracasei but it was not possible to distinguish between chains and larger aggregates. Significant variations in the aggregation characteristics of different LAB strains were observed in response to fermentable or non-fermentable sugars.