Name: 저자 스포트라이트: Advancing Research in Microbial Autoaggregation Using Imaging Flow Cytometry (이미징 유세포분석을 사용한 미생물 자가응집 연구의 발전)
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00
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이 연구는 이스라엘 과학 재단(보조금 119/16)과 IMoh 보조금(3-15656)의 지원을 받아 IKG에 지원되었습니다. R.S. Kreitman 펠로우십의 지원을 받습니다.

예를 들어 LGG(Lacticaseibacillus rhamnosus GG)에 대한 템플릿이 포함된 .ast 파일은 보충 코딩 파일 1에 제공됩니다.
1. 미디어 준비
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 락토바실러스 MRS 육수(탈이온수 1L에 55g)를 준비하고 1.5%(w/v) 한천이 있는 락토바실러스 MRS 한천 플레이트를 준비합니다( 재료 표 참조). 오토클레이브 멸균 후 배지는 직접 사용...

Imaging Flow Cytometry를 사용한 미생물 autoaggregation의 정량 분석

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells.">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars.">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).</li><li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota.">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268 (2021).</li><li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92.">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li><li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+&amp;#34;Dried+Ossban&amp;#34;.">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &amp;#34;Dried Ossban&amp;#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus&lt;/em&gt;+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production.">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus&lt;/em&gt; GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

유세포 분석은 진핵 세포의 형광 강도를 정량화하는 데 널리 사용되는 방법이지만, 크기가 크거나 응집체가 작기 때문에 박테리아 세포에 대한 정확한 측정을 제공하지 못할 수 있습니다. 이러한 요인은 자동 응집체의 정확한 정량화와 다양한 조건에서 응집체 형성의 기초 수준에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 이미징 유세포 분석(IFC)을 사용하여 탄수화물이 프로바?...

박테리아 자가응집은 생물막 형성의 주요 단계로 간주됩니다. 이 과정(자가응집 또는 응집이라고도 함)에서 동일한 유형의 박테리아는 다세포 덩어리를 형성하여 결국 배양관의 바닥에 가라앉거나 표적 조직 또는 표면1에 부착됩니다.
자가응집은 널리 관찰되는 현상으로, 기회주의적 병원체인 Acinetobacter baumannii2, 치과 병원체인 Aggregobacter actinomycetemcomitans3 및 신흥 병원체인 Burkholderia pseudomallei4와 같은 그람 음성 병원체에서 지금까지 나타났습니다. 자가응집은 또한 여러 프로바이오틱 그람 양성 균주 5,6,7,8에서 설명되었습니다. 락토바실러스(L.) 애시도필러스(Lactobacillus (L.) acidophilus)에서 자가응집(autoaggregation)은 S층 단백질에 의해 부분적으로 매개되었으며 자일란7에 대한 접착력과 상관관계가 있었습니다. 이와 유사하게, 프로바이오틱 종인 락티카세이바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus) GG, 락티카실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei), L. 애시도필러스(L. acidophilus), 락티카실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei) 및 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)5의 접착 특성(뮤신에 대한 접착력으로 판단)의 포도당 의존성 자가응집과 유도 사이의 상관관계를 발견했습니다. 증가된 자가응집은 포도당과 그 이화물질에 대한 반응으로 세포 부착체의 발현 변화를 반영했을 가능성이 가장 높다9. 자가응집의 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았지만, 이 과정은 응집된 박테리아의 표현형을 변화시키고 환경 스트레스 요인1에 대한 내성을 향상시키고 쿼럼 감지 분자(10)에 대한 민감도를 증가시키는 것으로 나타났습니다.
자동 집계를 측정하기 위해 몇 가지 접근 방식이 사용되었습니다. 한 가지 실험적 접근 방식은 배양액을 주어진 시간 동안 좁은 배양관에 정적으로 서 있게 하는 것입니다. 대조군 배양은 혼탁한 상태로 유지되는 반면, 자동 응집 배양은 튜브 바닥에 가라앉습니다. 보다 정량적인 접근법은 침강 또는 침강 분석에 의한 자동 응집을 측정합니다11.
또한 최근 몇 년 동안 박테리아 자가응집을 조사하기 위해 유세포 분석이 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 방법은 크기가 약 0.5μm에서 1000μm 사이인 입자를 분석하는 데 적합합니다. 단일 박테리아 또는 형성된 응집체는 유체에 부유하여 하천으로 공급되며 하나씩 검출할 수 있습니다11. 전방 산란광을 기록하면 셀 또는 응집체의 상대적 크기를 측정할 수 있습니다. 비교적 빠르고 간단하지만 응집체 크기 또는 응집체의 평균 셀 수와 같은 여러 매개 변수를 감지할 수 없습니다. 따라서 이 접근법은 현미경으로 보완할 수 있어 더 많은 매개변수를 확인할 수 있다12. 그러나 기존의 현미경 검사는 시간이 많이 걸리기 때문에 테스트된 샘플의 수와 분석의 통계적 검증력이 제한됩니다. 일반적으로 이미징 유세포 분석은 세포 형태 및 표현형의 동시 분석, 이미지 기반 분석 수행, 희귀 이벤트 검출 및 유세포 분석 데이터 검증과 같은 기존 유세포 분석에 비해 여러 기능을 제공합니다13. 이러한 장점은 유세포 분석의 기능을 향상시키고 세포 집단에 대한 보다 자세한 검사를 용이하게 합니다.
이 연구는 젖산균(LAB)의 자가응집을 모니터링하기 위한 유세포 분석을 이미징하기 위한 유용한 프로토콜을 제공합니다. 이 그람 양성 간상체는 통성 혐기성 미생물이며 LAB 그룹에 속합니다. 이러한 효율적인 포도당 발효기는 탄수화물 대사의 주요 최종 산물로 젖산을 생성합니다14. 이 박테리아는 마이크로바이옴의 유익한 핵심 구성원이며 인간과 동물의 위장관(GIT)과 여성의 비뇨생식기에서 자연적으로 발견됩니다15. 따라서 자동 응집 특성의 정확한 특성화는 생명 공학 및 임상적 관심이 높습니다.
우리의 이전 연구 결과는 자가응집의 기초 수준이 서로 다른 프로바이오틱스 균주 간에 다르다는 것을 보여주었습니다. 이러한 이질성은 탄소원으로 사용되는 다양한 탄수화물에 의해 영향을 받는다5. 프로바이오틱 박테리아의 이러한 근본적인 특성을 극복하기 위해, IFC를 사용하여 단세포 수준에서 자가응집에 대한 식단의 탄수화물의 영향을 모니터링했습니다. 이 IFC 기반 접근 방식은 기존 유세포 분석기의 성능 및 속도와 현미경의 해상도를 결합합니다. 따라서, 이는 표현형적으로 정의된 방식(16,17)으로 고속의 복잡한 형태학적 측정을 허용한다. 이 접근법은 유전자 발현을 모니터링하기 위한 형광 리포터와 결합한 다른 프로바이오틱 및 병원성 박테리아로 확장될 수 있으며, 이종 응집체에서 특정 박테리아 종의 존재 및 풍부도를 모니터링하기 위해 형광 라벨링된 균주와 결합될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

유익한 프로바이오틱 박테리아는 숙주에서 필수적인 역할을 하여 전염병에 대한 면역을 포함한 다양한 건강상의 이점을 제공합니다. 락토바실러스과(Lactobacillaceae)는 프로바이오틱스 특성이 확인된 그람 양성 박테리아로 구성되어 있습니다. 이 연구는 세포 응집 연구에서 단세포 고처리량 분석의 효과를 입증하기 위한 모델로 Lactobacillaceae 종을 활용합니다. 초점은 식단의 단순 탄수화물에 대한 이러한 유익한 종의 반응을 분석하는 것입니다.
이 연구는 이미징 유세포 분석(IFC)이 탄수화물의 존재와 부재에서 프로바이오틱 박테리아 조립의 근본적인 차이를 극복할 수 있는 방법을 보여줍니다. IFC는 기존 유세포 분석의 성능 및 속도와 현미경의 공간 해상도를 결합하여 유익한 박테리아 균주 및 조건 라이브러리에서 표현형으로 정의된 방식으로 복잡한 형태 측정 속도를 높일 수 있습니다. 이 프로토콜은 락토바실러스과(Lactobacillaceae) 종의 자가응집에 대한 통찰력을 제공하고 식이 탄수화물에 대한 반응을 밝혀 이러한 프로바이오틱 박테리아의 유익한 효과 뒤에 숨겨진 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

저자 스포트라이트: Advancing Research in Microbial Autoaggregation Using Imaging Flow Cytometry (이미징 유세포분석을 사용한 미생물 자가응집 연구의 발전)

미생물 자가응집(microbial autoaggregation)을 연구하기 위한 이미징 유세포분석(Imaging flow cytometry)

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

결과는 이 방법이 LAB 박테리아의 식이 당에 대한 반응으로 자동 응집의 차이를 쉽게 측정할 수 있음을 보여줍니다. 집합체에서 개체를 분리함으로써, 이 방법은 식단에서 발효성 또는 비발효성 설탕에 대한 반응으로 모든 이벤트에서 집계 이벤트의 개체군의 백분율을 계산할 수 있습니다. 또한, 처리 간에 응집체 모집단의 평균 크기에 차이가 있는지 측정할 수 있었습니다.
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Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Research in Microbial Auto Aggregation Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

이 프로토콜은 이미징 유세포 분석을 사용하여 미생물 자가응집을 측정하기 위한 정량적 접근 방식을 설명합니다.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

이 연구는 미생물 자가응집 연구에서 이미징 유세포 분석의 효과를 입증하기 위해 락토바실러스 종을 모델로 활용했습니다. 초점은 식단의 단순 탄수화물에 대한 락토바실러스 종의 자동 응집 반응을 분석하는 것입니다. 자동 응집을 측정하는 데 가장 많이 사용되는 방법은 미생물 현탁액, 탁도 또는 광학 밀도를 측정하는 스펙트럼 측광법과 명시야, 위상차 및 형광 현미경과 같은 기존 현미경 기술입니다.hight-throughput 이미징에 대해 이야기할 때 주요 실험 과제 중 하나는 단일 이벤트 세분화입니다. 이 프로토콜에서는 단일 집계입니다. 이미징 유세포 분석은 이러한 문제를 우아하게 해결하고 연구자에게 자가응집을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

연구

생물학

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Start by inoculating five milliliters of lactobacilli MRS broth with a single colony of the lactobacilli strain, incubated at 37 degrees Celsius under static conditions overnight. Dilute the cell culture in a one-to-100 ratio in three milliliters of 50%supplemented tryptic soy broth, vortex the culture, and incubate it. Then invert the tube to mix the cells in the medium before transferring 200 to 300 microliters of the sample into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube.

락토바실러스과(Lactobacillaceae) 유세포 분석을 위한 시료 전처리

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

To begin the flow cytometric analysis, first set the 785-nanometer laser to a power of five milliwatts for dark field measurements. Use a 60X lens with a numerical aperture of 0.9. Then select the high-sensitivity setting and set the speed to low.To ensure calibration bead stability, press the Play button in the fluidics box and examine the bead images, which should appear sharp and clear. Generate a new scatterplot in the workspace box by selecting New Scatterplot. Then select the area in the Brightfield channel that corresponds to the SSC channel intensity and exclude the calibration beads that are running concurrently within the sample.Next, press the Load button and position a tube containing the Lactobacilli sample in the holder. In the Acquisition Settings box, enter the sample name and specify the location for data storage. Set the number of events to be collected, typically within the range of 10, 000 to 20, 000 events.Now, begin the acquisition process by clicking the Record button located in the Acquisition box. The process will halt after reaching the specified volume of events. Press the Return button to unload the tube and remove it from the holder as prompted in the popup window.After repeating the process for all samples, save the template to maintain data acquisition uniformity. For data analysis, to load the raw file into the analysis software, click on File and open the rif file. In the opened window, select Use Acquisition Analysis and then click OK.Next, to create a histogram of the gradient root mean square, click the New Histogram button and choose the population from the acquisition to analyze.Under the X Axis feature, select Gradient RMS of the Brightfield channel. Next, place a gate to exclude non-focused events by clicking the Create Line Region button in the analysis area. Create a scatterplot of the area versus the aspect ratio by clicking the New Scatterplot button in the analysis area.Select the focused population in the New Scatterplot window. Then select the area of the Brightfield channel for the X-Axis feature. Choose the aspect ratio for the Y-Axis feature.Draw a gate on the scatterplot using the Create Rectangle button based on the area value for the aggregate events population. Similarly, draw another gate for the singles and small aggregates population. Save your data analysis as a template by clicking the File tab, choosing Save As Template ast, and then open the next sample file under the same template to create the data analysis file.To measure the aggregate size distribution, start by plotting a histogram of the area of the aggregation events population. Save the data analysis by clicking on the file and selecting the Save As Template option. After saving, open the next sample file under the same template for the data analysis file.Single cells, small aggregates, large aggregates, and chains were observed in LGG and L.paracasei but it was not possible to distinguish between chains and larger aggregates. Significant variations in the aggregation characteristics of different LAB strains were observed in response to fermentable or non-fermentable sugars.