Name: Autor destacado: Avance de la investigación en la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo de imágenes
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Research in Microbial Auto Aggregation Using Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Israelí para la Ciencia (Subvención 119/16) y la subvención IMoh (3-15656) al IKG. R.S. con el apoyo de la beca Kreitman.

El archivo .ast, con la plantilla para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como ejemplo, se proporciona en el Archivo de codificación suplementaria 1.
1. Preparación de los medios
<ol><li>Prepare el caldo Lactobacili MRS siguiendo las instrucciones del fabricante (55 g en 1 L de agua desionizada) y las placas de agar Lactobacilli MRS con agar al 1,5% (p/v) (ver Tabla de Materiales). Después de la esterilización en autoclave, e...

Análisis cuantitativo de la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota.">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268 (2021).</li><li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92.">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li><li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+&amp;#34;Dried+Ossban&amp;#34;.">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &amp;#34;Dried Ossban&amp;#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus&lt;/em&gt;+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production.">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus&lt;/em&gt; GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

La citometría de flujo es un método ampliamente utilizado para cuantificar las intensidades de fluorescencia en las células eucariotas, pero es posible que no proporcione mediciones precisas para las células bacterianas debido a su mayor tamaño o pequeños agregados. Estos factores pueden tener un impacto significativo en la cuantificación precisa de la autoagregación y el nivel basal de formación de agregados en diferentes condiciones. Para abordar esto, se empleó la citometría de flujo por imágenes (IFC) par...

La autoagregación bacteriana se considera un paso primordial en la formación de biopelículas. En este proceso (a veces también llamado autoaglutinación o floculación), las bacterias del mismo tipo forman grupos multicelulares que eventualmente se asientan en el fondo de los tubos de cultivo o se adhieren a su tejidoo superficie objetivo.
La autoagregación es un fenómeno ampliamente observado y se ha demostrado hasta ahora en patógenos gramnegativos como el patógeno oportunista Acinetobacter baumannii2, el patógeno dental Aggregobacter actinomycetemcomitans3 y el patógeno emergente Burkholderia pseudomallei4. La autoagregación también se ha descrito en varias cepas grampositivas probióticas 5,6,7,8. En Lactobacillus (L.) acidophilus, la autoagregación fue parcialmente mediada por proteínas de la capa S y se correlacionó con una adhesión al xilano7. Del mismo modo, encontramos una correlación entre la autoagregación dependiente de glucosa y la inducción de las propiedades adhesivas (a juzgar por la adhesión a la mucina) de las especies probióticas Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei y Lactiplantibacillus plantarum5. Lo más probable es que el aumento de la autoagregación reflejara cambios en la expresión de adhesinas celulares en respuesta a la glucosa y sus catabolitos9. Si bien los mecanismos moleculares de la autoagregación aún no se han determinado, se ha demostrado que este proceso altera el fenotipo de las bacterias agregadas y les otorga una mayor tolerancia a los factores de estrés ambiental1, así como una mayor sensibilidad a las moléculas de detección de quórum10.
Se han utilizado varios enfoques para medir la autoagregación; Un enfoque experimental consiste en dejar que los cultivos permanezcan estáticos en tubos de cultivo estrechos durante un tiempo determinado. Los cultivos de control permanecen turbios, mientras que los cultivos de autoagregación se asentarán en el fondo del tubo. Un enfoque más cuantitativo mide la autoagregación por sedimentación o ensayo de sedimentación11.
La citometría de flujo también se ha empleado cada vez más en los últimos años para investigar la autoagregación bacteriana. Este método es apropiado para analizar partículas de entre 0,5 y 1000 μm de tamaño aproximado. La bacteria individual o los agregados formados se suspenden en el fluido, se introducen en una corriente y se pueden detectar uno por uno11. El registro de la luz dispersada hacia adelante permite medir el tamaño relativo de la célula o agregado. Es relativamente rápido y sencillo, pero no puede detectar varios parámetros, como el tamaño del agregado o el número promedio de celdas en los agregados. Por lo tanto, este enfoque puede complementarse microscópicamente, permitiendo verificar más parámetros12. Sin embargo, la microscopía tradicional requiere mucho tiempo y, por lo tanto, limita el número de muestras analizadas y el poder estadístico del análisis. En general, la citometría de flujo por imágenes proporciona varias características en comparación con la citometría de flujo tradicional, como el análisis simultáneo de la morfología y el fenotipo celular, la realización de análisis basados en imágenes, la detección de eventos raros y la validación de los datos de citometría de flujo13. Estas ventajas mejoran las capacidades de la citometría de flujo y facilitan un examen más detallado de las poblaciones celulares.
Este estudio proporciona un protocolo valioso para la obtención de imágenes de citometría de flujo para monitorear la autoagregación en bacterias de ácido láctico (BAL). Estos bastones Gram-positivos son anaerobios facultativos y pertenecen al grupo LAB. Estos eficientes fermentadores de glucosa generan ácido láctico como su principal producto final del metabolismo de los carbohidratos14. Estas bacterias son miembros centrales beneficiosos del microbioma y se encuentran naturalmente en el tracto gastrointestinal (TGI) de humanos y animales, así como en el tracto urogenital de lasmujeres. Por lo tanto, la caracterización exacta de sus propiedades de autoagregación es de alto interés biotecnológico y clínico.
Nuestros hallazgos previos indicaron que el nivel basal de autoagregación difiere entre las diferentes cepas probióticas. Esta heterogeneidad se ve afectada por los diferentes hidratos de carbono utilizados como fuente de carbono5. Para superar esta propiedad fundamental de las bacterias probióticas, se monitorizaron los efectos de los hidratos de carbono de la dieta sobre la autoagregación a nivel unicelular mediante IFC. Este enfoque basado en IFC combina la potencia y la velocidad de los citómetros de flujo tradicionales con la resolución del microscopio. Por lo tanto, permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una forma fenotípicamente definida16,17. Este enfoque puede extenderse a otras bacterias probióticas y patógenas, combinadas con reporteros fluorescentes para monitorear la expresión génica y cepas marcadas con fluorescencia para monitorear la presencia y abundancia de especies bacterianas específicas en agregados heterogéneos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

Las bacterias beneficiosas y probióticas desempeñan un papel esencial en sus huéspedes, proporcionando diversos beneficios para la salud, incluida la inmunidad a las enfermedades infecciosas. La familia Lactobacillaceae está formada por bacterias grampositivas con propiedades probióticas confirmadas. Este estudio utiliza especies de Lactobacillaceae como modelo para demostrar la efectividad del análisis de alto rendimiento de una sola célula en el estudio de la agregación celular. El objetivo es analizar la respuesta de estas especies beneficiosas a los hidratos de carbono simples de la dieta.
El estudio muestra cómo la citometría de flujo por imágenes (IFC) puede superar las diferencias fundamentales en el ensamblaje de bacterias probióticas en presencia y ausencia de carbohidratos. IFC combina la potencia y la velocidad de la citometría de flujo convencional con la resolución espacial de la microscopía, lo que permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una manera fenotípicamente definida en una biblioteca de cepas y condiciones bacterianas beneficiosas. Este protocolo proporciona información sobre la autoagregación de las especies de Lactobacillaceae y arroja luz sobre su respuesta a los carbohidratos de la dieta, lo que contribuye a comprender los mecanismos detrás de los efectos beneficiosos de estas bacterias probióticas.

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

Autor destacado: Avance de la investigación en la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo de imágenes

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

This study utilized Lactobacillus species as a model to demonstrate the effectiveness of imaging flow cytometry analysis in studying microbial autoaggregation. The focus is on analyzing the response of autoaggregation of Lactobacillus species to simple carbohydrates from the diet. The most used methods for measuring autoaggregation are spectral photometry, which measures microbial suspensions, turbidity, or optical density, and traditional microscopy techniques, such as bright field, phase contrast, and fluorescent microscopy.When talking about hight-throughput imaging, one major experimental challenge is single event segmentation. In this protocol, it is a single aggregate. Imaging flow cytometry addresses this challenge elegantly and give researchers a powerful tool for studying autoaggregation.

Los resultados demuestran que este método puede medir fácilmente las diferencias en la autoagregación en respuesta a los azúcares de la dieta en las bacterias BAL. Al separar los individuos de los agregados, el método permite calcular el porcentaje de la población de los eventos de agregación de todos los eventos en respuesta a azúcares fermentables o no fermentables de la dieta. Además, fue posible medir si existen diferencias en el tamaño medio de la población agregada entre tratamientos.
<p class="jove_...

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Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Este estudio utilizó especies de Lactobacillus como modelo para demostrar la efectividad del análisis de citometría de flujo por imágenes en el estudio de la autoagregación microbiana. El objetivo es analizar la respuesta de la autoagregación de las especies de Lactobacillus a los carbohidratos simples de la dieta. Los métodos más utilizados para medir la autoagregación son la fotometría espectral, que mide las suspensiones microbianas, la turbidez o la densidad óptica, y las técnicas de microscopía tradicionales, como el campo claro, el contraste de fase y la microscopía fluorescente.Cuando se habla de imágenes de alto rendimiento, un desafío experimental importante es la segmentación de un solo evento. En este protocolo, es un solo agregado. La citometría de flujo por imágenes aborda este desafío con elegancia y brinda a los investigadores una herramienta poderosa para estudiar la autoagregación.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Investigación

Biología

Lactobacillaceae Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Start by inoculating five milliliters of lactobacilli MRS broth with a single colony of the lactobacilli strain, incubated at 37 degrees Celsius under static conditions overnight. Dilute the cell culture in a one-to-100 ratio in three milliliters of 50%supplemented tryptic soy broth, vortex the culture, and incubate it. Then invert the tube to mix the cells in the medium before transferring 200 to 300 microliters of the sample into a 1.5 milliliter micro centrifuge tube.

Lactobacillaceae Preparación de muestras para el análisis por citometría de flujo

Flow Cytometric Data Acquisition of Microbial Aggregates

To begin the flow cytometric analysis, first set the 785-nanometer laser to a power of five milliwatts for dark field measurements. Use a 60X lens with a numerical aperture of 0.9. Then select the high-sensitivity setting and set the speed to low.To ensure calibration bead stability, press the Play button in the fluidics box and examine the bead images, which should appear sharp and clear. Generate a new scatterplot in the workspace box by selecting New Scatterplot. Then select the area in the Brightfield channel that corresponds to the SSC channel intensity and exclude the calibration beads that are running concurrently within the sample.Next, press the Load button and position a tube containing the Lactobacilli sample in the holder. In the Acquisition Settings box, enter the sample name and specify the location for data storage. Set the number of events to be collected, typically within the range of 10, 000 to 20, 000 events.Now, begin the acquisition process by clicking the Record button located in the Acquisition box. The process will halt after reaching the specified volume of events. Press the Return button to unload the tube and remove it from the holder as prompted in the popup window.After repeating the process for all samples, save the template to maintain data acquisition uniformity. For data analysis, to load the raw file into the analysis software, click on File and open the rif file. In the opened window, select Use Acquisition Analysis and then click OK.Next, to create a histogram of the gradient root mean square, click the New Histogram button and choose the population from the acquisition to analyze.Under the X Axis feature, select Gradient RMS of the Brightfield channel. Next, place a gate to exclude non-focused events by clicking the Create Line Region button in the analysis area. Create a scatterplot of the area versus the aspect ratio by clicking the New Scatterplot button in the analysis area.Select the focused population in the New Scatterplot window. Then select the area of the Brightfield channel for the X-Axis feature. Choose the aspect ratio for the Y-Axis feature.Draw a gate on the scatterplot using the Create Rectangle button based on the area value for the aggregate events population. Similarly, draw another gate for the singles and small aggregates population. Save your data analysis as a template by clicking the File tab, choosing Save As Template ast, and then open the next sample file under the same template to create the data analysis file.To measure the aggregate size distribution, start by plotting a histogram of the area of the aggregation events population. Save the data analysis by clicking on the file and selecting the Save As Template option. After saving, open the next sample file under the same template for the data analysis file.Single cells, small aggregates, large aggregates, and chains were observed in LGG and L.paracasei but it was not possible to distinguish between chains and larger aggregates. Significant variations in the aggregation characteristics of different LAB strains were observed in response to fermentable or non-fermentable sugars.