Name: Pleins feux sur l’auteur : Évaluation du flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques à l’aide d’approches complémentaires efficaces et robustes
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

E.L-D. reconnaît le soutien des NIH (T32-AI007413 et T32-AG000114). SAS reconnaît le soutien de la FRDJ (COE-2019-861), du NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), du ministère des Anciens Combattants (I01 BX004444), de la famille Brehm et de la famille Anthony.

Les études animales présentées dans ce protocole ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. Des souris mâles C57BL/6J âgées de vingt semaines, soumises à un régime régulier de 15 semaines en graisses (RFD) ou à un régime riche en graisses (HFD), ont été utilisées pour cette étude.
1. Évaluation de la mitophagie par l’approche MtPhagy à base de colorant (Méthode 1)</stro...

Analyse quantitative de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques murines

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+&#946;-cell+mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates &#946;-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+mitophagy.">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo.">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li><li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy.">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li><li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver.">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li><li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+protects+&#946;+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes.">Mitophagy protects &#946; cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).</li><li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy.">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li><li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+&#946;-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets.">Imaging &#946;-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).</li><li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule.">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).</li><li>Klein, B., W&#246;rndl, K., L&#252;tz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+intracellular+K(+)+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes.">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+&#946;+cells+in+diet-induced+obesity.">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic &#946; cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li><li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry.">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li><li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC.">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li><li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry.">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li></ol>

Ce protocole décrit deux méthodes complémentaires pour quantifier le flux de mitophagie dans les îlots primaires dissociés de souris. À l’aide de la méthode mt-Keima, une augmentation de la mitophagie a été quantifiée comme une augmentation du rapport entre les cellules acides (561 nm) et neutres (405 nm), tandis que dans la méthode MtPhago, l’augmentation du flux de mitophagie a été quantifiée comme une augmentation de la populationde cellules à faible TMREà haute teneur en...

Les cellules β pancréatiques produisent et sécrètent de l’insuline pour répondre aux demandes métaboliques, et le dysfonctionnement des cellules β est responsable de l’hyperglycémie et de l’apparition du diabète dans les diabètes de type 1 et de type 2. Les β-cellules couplent le métabolisme du glucose avec la sécrétion d’insuline via l’énergétique mitochondriale et la production métabolique, qui dépendent d’une réserve de masse mitochondriale fonctionnelle 1,2,3. Pour maintenir une fonction optimale des β cellules, les cellules β s’appuient sur des mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale pour éliminer les mitochondries âgées ou endommagées et préserver la masse mitochondriale fonctionnelle4. L’autophagie mitochondriale sélective, également connue sous le nom de mitophagie, est un élément clé de la voie de contrôle de la qualité mitochondriale.
Les évaluations de la mitophagie dans les cellules vivantes reposent souvent sur les changements du pH mitochondrial qui se produisent au cours de la mitophagie. Les mitochondries ont un pH légèrement alcalin et les mitochondries saines résident normalement dans le cytosol au pH neutre. Au cours de la mitophagie, les mitochondries endommagées ou dysfonctionnelles sont sélectivement incorporées dans les autophagosomes et finissent par être éliminées dans les lysosomes acides5. Plusieurs modèles murins rapporteurs de mitophagie transgénique in vivo, tels que mt-Keima6, mitoQC7 et CMMR8, ainsi que des sondes de mitophagie transfécondables, telles que le plasmide Cox8-EGFP-mCherry9, utilisent ce changement de pH pour fournir des évaluations quantitatives de la mitophagie. L’utilisation de souris transgéniques exprimant la sonde métrique à double rapport d’excitation sensible au pH mt-Keima a été optimisée pour les évaluations de mitophagie dans les îlots pancréatiques et les cellules β par cytométrie en flux10,11. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres (le rapport entre l’excitation acide de 561 nm et l’excitation neutre de 480 nm) peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie 6,12.
Ce protocole décrit une approche optimisée pour évaluer le flux de mitophagie dans les îlots primaires et les cellules β isolées de souris transgéniques mt-Keima10,11. Bien que mt-Keima soit une sonde très sensible, elle nécessite soit des schémas de sélection animale compliqués, soit la transfection de cellules, ce qui peut souvent être difficile lorsqu’on travaille en combinaison avec d’autres modèles génétiques ou avec des îlots humains primaires. De plus, l’utilisation de plusieurs lasers et détecteurs à fluorescence pour identifier les populations cellulaires neutres et acides peut limiter l’utilisation combinatoire d’autres rapporteurs fluorescents.
Pour surmonter ces défis, ce protocole décrit également une méthode complémentaire, à canal fluorescent unique, à base de colorant, pour une détection robuste de la mitophagie dans les cellules β provenant d’îlots de souris isolés. Cette approche, connue sous le nom de méthode MtPhagogy, utilise une combinaison de trois colorants perméables aux cellules pour sélectionner les cellules β, quantifier les populations cellulaires subissant activement la mitophagie et évaluer simultanément le potentiel de membrane mitochondriale (MMP ou Δψm).
Le premier de ces colorants est le Fluozin-3-AM, un indicateur de Zn2+ perméable aux cellules avec un Ex/Em 494/516 nm13. Les îlots de souris comprennent une population hétérogène de cellules fonctionnellement distinctes, y compris des cellules α, β, δ et PP. Les cellules β comprennent environ 80 % des cellules de l’îlot de souris et se distinguent des autres types de cellules d’îlots en raison de leur concentration élevée en Zn2+ dans les granules d’insuline14,15, ce qui permet d’identifier les cellules β comme étant la populationélevée de Fluozin-3-AM. Le colorant MtPhago, un colorant sensible au pH qui est immobilisé sur les mitochondries via une liaison chimique et émet une faible fluorescence, est également utilisé dans ce protocole16. Lors de l’induction de la mitophagie, les mitochondries endommagées sont incorporées dans le lysosome acide et le colorant MtPhagy augmente son intensité de fluorescence dans l’environnement à faible pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
De plus, la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE), est utilisée pour évaluer la MMP. Le TMRE est un colorant chargé positivement perméable aux cellules (Ex/Em 552/575 nm) qui est séquestré par les mitochondries saines en raison de la charge négative relative maintenue par leur potentiel membranaire17. Les mitochondries endommagées ou malsaines dissipent leur potentiel membranaire, ce qui entraîne une diminution de la capacité à séquestrer l’ERM. En utilisant ces colorants ensemble, les cellules β subissant une mitophagie peuvent être identifiées comme la populationà haute teneur enFluozine à haute teneur en TMREparcytométrie en flux. Étant donné que la mitophagie est un processus dynamique plutôt que statique, ce protocole a été optimisé pour évaluer le flux de mitophagie à l’aide de la valinomycine, un ionophore K+ qui induit la mitophagie après dissipation de MMP18. La comparaison de la mitophagie en présence et en absence de valinomycine permet d’évaluer le flux de mitophagie dans différents groupes d’échantillons.
La nature colorante de l’approche actuelle permet de l’extrapoler aux îlots humains et à d’autres types de cellules difficiles à transfecter et de contourner la nécessité de schémas de sélection animale compliqués, contrairement au protocole mt-Keima. L’objectif principal de ce protocole est de quantifier la mitophagie dans les cellules β au niveau de la cellule unique via deux méthodes indépendantes basées sur la cytométrie en flux. Pris ensemble, ce protocole décrit deux méthodes puissantes et complémentaires qui permettent à la fois précision et flexibilité dans l’étude quantitative du contrôle de la qualité mitochondriale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 &#181;g/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>F24195</td>
			<td>100 &#956;g Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 &#956;L DMSO and 51 &#956;L Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td>TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 &#956;M stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary approaches to interrogate mitophagy flux in pancreatic &#946;-cells

La mitophagie est un mécanisme de contrôle de la qualité nécessaire au maintien d’une fonction mitochondriale optimale. Une mitophagie dysfonctionnelle à β cellules entraîne une libération insuffisante d’insuline. Les évaluations quantitatives avancées de la mitophagie nécessitent souvent l’utilisation de rapporteurs génétiques. Le modèle murin mt-Keima, qui exprime une sonde à double rapport d’excitation sensible au pH ciblant les mitochondries pour quantifier la mitophagie par cytométrie en flux, a été optimisé dans les cellules β. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie. Cependant, l’utilisation de rapporteurs de mitophagie génétique peut être difficile lorsque l’on travaille avec des modèles murins génétiques complexes ou des cellules difficiles à transfecter, telles que les îlots humains primaires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode complémentaire à base de colorants pour quantifier la mitophagie à cellules β dans les îlots primaires à l’aide de MtPhagy. MtPhagy est un colorant sensible au pH et perméable aux cellules qui s’accumule dans les mitochondries et augmente son intensité de fluorescence lorsque les mitochondries se trouvent dans des environnements à faible pH, tels que les lysosomes pendant la mitophagie. En combinant le colorant MtPhagy avec la fluozine-3-AM, un indicateur de Zn2+ qui sélectionne les cellules β, et la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE) pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale, le flux de mitophagie peut être quantifié spécifiquement dans les cellules β par cytométrie en flux. Ces deux approches sont très complémentaires, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’évaluation du contrôle de la qualité mitochondriale dans de nombreux modèles β cellules.

Pancreatic &#946;-cells produce and secrete insulin to meet metabolic demands, and &#946;-cell dysfunction is responsible for hyperglycemia and diabetes onset in both type 1 and type 2 diabetes. &#946;-Cells couple glucose metabolism with insulin secretion via mitochondrial energetics and metabolic output, which depend on a reserve of functional mitochondrial mass1,2,3. To maintain optimal &#946;-cell function, &#946;-cells rely on mitochondrial quality control mechanisms to remove aged or damaged mitochondria and preserve functional mitochondrial mass4. Selective mitochondrial autophagy, also known as mitophagy, is a key component of the mitochondrial quality control pathway.
Assessments of mitophagy in live cells often rely on changes in mitochondrial pH that occur during mitophagy. Mitochondria have a slightly alkaline pH, and healthy mitochondria normally reside in the pH-neutral cytosol. During mitophagy, damaged or dysfunctional mitochondria are selectively incorporated into autophagosomes and eventually cleared within acidic lysosomes5. Several in vivo transgenic mitophagy reporter mouse models, such as mt-Keima6, mitoQC7, and CMMR8, as well as transfectable mitophagy probes, such as the Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, utilize this pH change to provide quantitative assessments of mitophagy. Use of transgenic mice expressing the mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe has been optimized for mitophagy assessments in islets and &#946;-cells via flow cytometry10,11. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions (the ratio of acidic 561 nm to neutral 480 nm excitation) can be used to robustly quantify mitophagy6,12.
This protocol describes an optimized approach to assess mitophagy flux in primary islets and &#946;-cells isolated from mt-Keima transgenic mice10,11. While mt-Keima is a highly sensitive probe, it requires either complicated animal breeding schemes or the transfection of cells, which can often be challenging when working in combination with other genetic models or with primary human islets. Additionally, the use of multiple fluorescence lasers and detectors to identify neutral and acidic cell populations can limit the combinatorial use of other fluorescent reporters.
To overcome these challenges, this protocol also describes a complementary, single fluorescent channel, dye-based method for robust detection of mitophagy in &#946;-cells from isolated mouse islets. This approach, referred to as the MtPhagy method, utilizes a combination of three cell-permeable dyes to select for &#946;-cells, quantify the cell populations actively undergoing mitophagy, and assess mitochondrial membrane potential (MMP or &#916;&#968;m) simultaneously.
The first of these dyes is Fluozin-3-AM, a cell-permeable Zn2+ indicator with an Ex/Em 494/516 nm13. Mouse islets comprise a heterogeneous population of functionally distinct cells, including &#945;-, &#946;-, &#948;-, and PP cells. &#946;-Cells comprise approximately 80% of cells within the mouse islet and can be distinguished from other islet cell types due to their high Zn2+ concentration within insulin granules14,15, allowing for identification of &#946;-cells as the Fluozin-3-AMhigh population. The MtPhagy dye, a pH-sensitive dye that is immobilized on mitochondria via a chemical bond and emits weak fluorescence, is also utilized in this protocol16. Upon mitophagy induction, damaged mitochondria are incorporated into the acidic lysosome, and the MtPhagy dye increases its fluorescence intensity within the low pH environment (Ex/Em 561/570-700 nm).
Additionally, Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), is used to assess MMP. TMRE is a cell-permeable positively charged dye (Ex/Em 552/575 nm) that is sequestered by healthy mitochondria due to the relative negative charge upheld by their membrane potential17. Damaged or unhealthy mitochondria dissipate their membrane potential, resulting in decreased ability to sequester TMRE. Utilizing these dyes together, &#946;-cells undergoing mitophagy can be identified as the FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flow cytometry. Since mitophagy is a dynamic rather than static process, this protocol was optimized to assess mitophagy flux using valinomycin, a K+-ionophore that induces mitophagy following dissipation of MMP18. Comparison of mitophagy in the presence and absence of valinomycin allows for assessment of mitophagy flux in different sample groups.
The dye-based nature of the current approach allows it to be extrapolated to human islets and other difficult-to-transfect cell types and circumvents the need for complicated animal breeding schemes, unlike the mt-Keima protocol. The overarching goal of this protocol is to quantify mitophagy in &#946;-cells at the single-cell level via two independent flow cytometry-based methods. Taken together, this protocol describes two powerful and complementary methods that allow for both precision and flexibility in the quantitative study of mitochondrial quality control.

Pleins feux sur l’auteur : Évaluation du flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques à l’aide d’approches complémentaires efficaces et robustes 

Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques

Our protocol describes two complementary methods to study beta-cell mitophagy flux at the single-cell resolution via flow cytometry. The mt-Keima protocol utilizes a genetic mitophagy reporter, whereas the MtPhagy protocol combines three fluorescent dyes, which makes it easy to extrapolate to difficult-to-transfect cells in human samples. Assessments of mitophagy using traditional biochemical approaches and imaging approaches are both time consuming and challenging.Thus, it's important to develop new, robust, and effective methods to study mitophagy flux in beta-cells. Both the mt-Keima and MtPhagy method are quantitative assessments that are efficient for studying mitophagy flux in pancreatic beta cells. So, the Soleimanpour lab focuses on the different mechanisms that drive pancreatic beta-cell failure and diabetes.And we specifically focus on the different aspects of mitochondrial lifecycle, including mitophagy, to understand how defects in mitochondrial function drive the development of diabetes.

Évaluation de la mitophagie via l’approche MtPhagy à base de colorants Cette approche basée sur les colorants a été optimisée pour analyser le flux de mitophagie dans les cellules β primaires de souris sans avoir besoin d’un rapporteur génétique, en utilisant Fluozin-3-AM, TMRE et MtPhagy ainsi que DAPI pour exclure les cellules mortes. En associant ces colorants à la valinomycine pour induire la mitophagie, ce protocole décrit une méthode à base de colorants pour mesurer sélectiveme...

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Ce protocole décrit deux méthodes pour l’analyse quantitative de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques : premièrement, une combinaison de colorants spécifiques aux mitochondries perméables aux cellules, et deuxièmement, un rapporteur de mitophagie génétiquement codé. Ces deux techniques sont complémentaires et peuvent être déployées en fonction de besoins spécifiques, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’adressage quantitatif du contrôle de la qualité mitochondriale.

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Notre protocole décrit deux méthodes complémentaires pour étudier le flux de mitophagie des cellules bêta à la résolution d’une seule cellule par cytométrie en flux. Le protocole mt-Keima utilise un rapporteur de mitophagie génétique, tandis que le protocole MtPhagy combine trois colorants fluorescents, ce qui facilite l’extrapolation à des cellules difficiles à transfecter dans des échantillons humains. Les évaluations de la mitophagie à l’aide d’approches biochimiques traditionnelles et d’approches d’imagerie sont à la fois longues et difficiles.Il est donc important de développer de nouvelles méthodes robustes et efficaces pour étudier le flux de mitophagie dans les cellules bêta. Les méthodes mt-Keima et MtPhagy sont toutes deux des évaluations quantitatives efficaces pour étudier le flux de mitophagie dans les cellules bêta pancréatiques. Ainsi, le laboratoire Soleimanpour se concentre sur les différents mécanismes qui conduisent à l’insuffisance des cellules bêta pancréatiques et au diabète.Et nous nous concentrons spécifiquement sur les différents aspects du cycle de vie mitochondrial, y compris la mitophagie, pour comprendre comment les défauts de la fonction mitochondriale conduisent au développement du diabète.

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Research

JoVE Journal

Biology

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Recherche

Biologie

Single-Cell Dissociation of Murine Islets for Flow Cytometric Analysis of &#946;-Cell Mitophagy

Begin by culturing the eyelet samples isolated from regular fat diet or high fat diet mice overnight at 37 degrees Celsius. Design the desired experimental conditions for the study. For each experimental condition, using a pipette, pick 100 eyelets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of eyelet medium.To induce Mitophagy, treat the eyelets in the appropriate Petri dishes with two microliters of 250 nano molar Valinomycin stock for three hours. Isolate the eyelets and using a pipette, transfer the eyelets from each Petri dish to a separate micro centrifuge tube. Then, spin the eyelets at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius and using a pipette, discard the supernatant.Wash the obtained sample twice with one milliliter of PBS. Between the washes, spin the sample and discard the supernatant as demonstrated previously. To dissociate eyelets into single cells, add 500 microliters of 0.05%Trypsin prewarmed to 37 degrees celsius, to one sample tube.Pipette the contents of the tube up and down repeatedly until the eyelets are visibly dispersed. Immediately add one milliliter of prewarmed eyelet medium to neutralize trypsin. Spin the samples at 500 G for five minutes at 10 degrees Celsius.Remove the supernatant carefully without disturbing the pellet. Then, wash the samples two times with eyelet flow medium. The cell samples are now ready to be stained for flow cytometric analysis of beta cell mitophagy.

Dissociation unicellulaire d’îlots murins pour l’analyse par cytométrie en flux de la mitophagie β cellules

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using MtPhagy Dye

Proceed to perform flow cytometric analysis of beta cell mitophagy, with a single cell suspension of about 100 isolated mirroring islets prepared, corresponding to each desired experimental condition to be studied. First, resuspend the islet samples for each condition in 500 microliters of islet flow medium. Add 0.25 microliters of MtPhagy stock to tubes designated to receive the MtPhagy dye.Similarly, add 0.25 microliters of TMRE stock and fluozin-3-AM stock to the respective designated tubes. Wrap the tubes in aluminum foil and vortex each tube at low speed for five seconds to mix the contents. Then incubate the tubes at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Halfway through incubation, vortex each sample at low speed for five to 10 seconds. After incubation, centrifuge the tubes at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant.And resuspend the samples in 500 microliters of islet flow medium. Add DAPI to the microcentrifuge tubes containing samples that require DAPI treatment. Centrifuge again and discard the supernatant as demonstrated previously.Resuspend the residue in 500 microliters of islet flow medium. Finally, place the samples on ice and then proceed with flow cytometry. Adjust the voltages for forward scatter or FSC and side scatter or SSC to ensure cell populations are at the center of the scatter plot.To exclude multiplets, at a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSC width. Adjust voltages and compensation for DAPI to filter for live beta cells. Set fluorescence gates for each fluorophore used based on the unstained RFD sample.Once gates are established, collect 10, 000 events per sample. Beta cells with high utilization of mitophagy were defined as the fluozin high MtPhagy high TMRE low population in quadrant three or Q3.Basal and valinomycin-induced mitophagy levels were characterized in both RFD and HFD islets.

Analyse par cytométrie en flux de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques murines à l’aide du colorant MtPhagy

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using the Genetically Encoded mt-Keima Reporter

To assess mitophagy in murine pancreatic beta cells using the genetically encoded mitophagy reporter, culture pancreatic islets isolated from wild type and Mt-Keima mice overnight at 37 degrees Celsius. The following day, add 100 islets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of islet medium for each experimental condition used in this protocol. Next, to dissociate the eyelets into single cells and stain with FluoZin-3-AM and DAPI as demonstrated previously for the Mt-Phagy dye based approach.Then proceed with the flow cytometric analysis of the samples. Adjust the forward scatter or FSC and side scatter or SSC voltages to attain an even distribution of cells on an SSCA versus FSCA plot. To select single cells and exclude multiplets, add a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSE width.The multiplets are excluded due to their higher width signal values. Then set up a DAPI negative gate to exclude dead cells. After that, set up FluoZin-3-AM positive gates to filter for live beta cells.Set up a triangle gating scheme using the Mt-Keima positive sample to identify acidic and neutral cell populations. Once the primary and fluorescence gates were established, assess mitophagy flux using basal and valinomycin-induced changes in Mt-Keima fluorescence.