Name: Autor im Rampenlicht: Bewertung des Mitophagieflusses in Pankreas-β-Zellen unter Verwendung effektiver und robuster komplementärer Ansätze
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

E.L-D. dankt der Unterstützung durch die NIH (T32-AI007413 und T32-AG000114). SAS bedankt sich für die Unterstützung durch die JDRF (COE-2019-861), die NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), das Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), die Familie Brehm und die Familie Anthony.

Die in diesem Protokoll vorgestellten Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan geprüft und genehmigt. Für diese Studie wurden zwanzig Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die entweder eine 15-wöchige normale Fettdiät (RFD) oder eine fettreiche Diät (HFD) erhielten.
1. Beurteilung der Mitophagie mit dem farbstoffbasierten MtPhagy-Ansatz (Methode 1)
<ol><li>Aufbereitung und Behandlung von Mäuseinseln<ol><l...

Quantitative Analyse der Mitophagie in murinen Pankreas-β-Zellen

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+&#946;-cell+mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates &#946;-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+mitophagy.">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo.">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li><li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy.">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li><li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver.">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li><li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+protects+&#946;+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes.">Mitophagy protects &#946; cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).</li><li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy.">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li><li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+&#946;-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets.">Imaging &#946;-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).</li><li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule.">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).</li><li>Klein, B., W&#246;rndl, K., L&#252;tz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+intracellular+K(+)+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes.">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+&#946;+cells+in+diet-induced+obesity.">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic &#946; cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li><li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry.">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li><li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC.">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li><li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry.">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li></ol>

Dieses Protokoll beschrieb zwei komplementäre Methoden zur Quantifizierung des Mitophagieflusses in dissoziierten primären Mausinseln. Mit der mt-Keima-Methode wurde ein Anstieg der Mitophagie als erhöhtes Verhältnis von sauren (561 nm) / neutralen (405 nm) Zellen quantifiziert, während in der MtPhagy-Methode ein erhöhter Mitophagiefluss als Anstieg der niedrigen Zellpopulation mit Fluozin-hohemMtPhagy-hohem TMRE-Wert quantifiziert wurde. Diese Methoden ermöglichen eine schnelle, q...

β-Zellen der Bauchspeicheldrüse produzieren und sezernieren Insulin, um den Stoffwechselbedarf zu decken, und β-Zell-Dysfunktion ist für Hyperglykämie und das Auftreten von Diabetes sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetes verantwortlich. β-Zellen koppeln den Glukosestoffwechsel mit der Insulinsekretion über die mitochondriale Energetik und die Stoffwechselleistung, die von einer Reserve an funktioneller mitochondrialer Masse abhängen 1,2,3. Um eine optimale β-Zell-Funktion aufrechtzuerhalten, verlassen sich β-Zellen auf mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen, um gealterte oder beschädigte Mitochondrien zu entfernen und die funktionelle mitochondriale Masse zu erhalten4. Die selektive mitochondriale Autophagie, auch bekannt als Mitophagie, ist eine Schlüsselkomponente des mitochondrialen Qualitätskontrollwegs.
Die Beurteilung der Mitophagie in lebenden Zellen beruht oft auf Veränderungen des mitochondrialen pH-Werts, die während der Mitophagie auftreten. Mitochondrien haben einen leicht alkalischen pH-Wert, und gesunde Mitochondrien befinden sich normalerweise im pH-neutralen Zytosol. Während der Mitophagie werden beschädigte oder dysfunktionale Mitochondrien selektiv in Autophagosomen eingebaut und schließlich in sauren Lysosomen abgebaut5. Mehrere in vivo transgene Mitophagie-Reportermausmodelle, wie mt-Keima6, mitoQC7 und CMMR8, sowie transfektierbare Mitophagiesonden, wie das Cox8-EGFP-mCherry-Plasmid9, nutzen diese pH-Änderung, um quantitative Bewertungen der Mitophagie zu ermöglichen. Die Verwendung transgener Mäuse, die die pH-sensitive ratiometrische Sonde mt-Keima exprimieren, wurde für die Beurteilung der Mitophagie in Inselzellen und β-Zellen mittels Durchflusszytometrie optimiert10,11. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen (das Verhältnis von saurer 561 nm zu neutraler 480 nm Anregung) kann verwendet werden, um die Mitophagie robust zu quantifizieren 6,12.
Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Ansatz zur Bestimmung des Mitophagieflusses in primären Inselzellen und β-Zellen, die aus mt-Keima-transgenen Mäusen isoliert wurden10,11. Obwohl mt-Keima eine hochempfindliche Sonde ist, erfordert sie entweder komplizierte Tierzuchtschemata oder die Transfektion von Zellen, was in Kombination mit anderen genetischen Modellen oder mit primären menschlichen Inseln oft eine Herausforderung darstellen kann. Darüber hinaus kann die Verwendung mehrerer Fluoreszenzlaser und -detektoren zur Identifizierung neutraler und saurer Zellpopulationen die kombinatorische Verwendung anderer fluoreszierender Reporter einschränken.
Um diese Herausforderungen zu meistern, beschreibt dieses Protokoll auch eine komplementäre, farbstoffbasierte Methode mit einem einzigen fluoreszierenden Kanal für den robusten Nachweis von Mitophagie in β-Zellen von isolierten Mäuseinseln. Dieser Ansatz, der als MtPhagy-Methode bezeichnet wird, verwendet eine Kombination aus drei zellpermeablen Farbstoffen, um nach β-Zellen zu selektieren, die Zellpopulationen zu quantifizieren, die aktiv der Mitophagie unterzogen werden, und gleichzeitig das mitochondriale Membranpotenzial (MMP oder Δψm) zu bewerten.
Der erste dieser Farbstoffe ist Fluozin-3-AM, ein zelldurchlässigerZn2+-Indikator mit einem Ex/Em 494/516 nm13. Mäuseinseln bestehen aus einer heterogenen Population funktionell unterschiedlicher Zellen, darunter α-, β-, δ- und PP-Zellen. β-Zellen umfassen etwa 80% der Zellen innerhalb der Mausinsel und können von anderen Inselzelltypen durch ihre hoheZn2+-Konzentration in Insulingranula14,15 unterschieden werden, was die Identifizierung von β-Zellen als Fluozin-3-AM-Population mit hohem Fluozin-3-AM-Gehalt ermöglicht. Der MtPhagy-Farbstoff, ein pH-empfindlicher Farbstoff, der über eine chemische Bindung auf Mitochondrien immobilisiert wird und schwache Fluoreszenz emittiert, wird ebenfalls in diesem Protokoll verwendet16. Bei der Induktion der Mitophagie werden beschädigte Mitochondrien in das saure Lysosom eingebaut, und der MtPhagy-Farbstoff erhöht seine Fluoreszenzintensität in der Umgebung mit niedrigem pH-Wert (Ex/Em 561/570-700 nm).
Darüber hinaus wird Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE), zur Beurteilung von MMP verwendet. TMRE ist ein zellpermeabler, positiv geladener Farbstoff (Ex/Em 552/575 nm), der von gesunden Mitochondrien aufgrund der relativen negativen Ladung, die durch ihr Membranpotential aufrechterhalten wird, sequestriert wird17. Beschädigte oder ungesunde Mitochondrien lösen ihr Membranpotenzial auf, was zu einer verminderten Fähigkeit zur Sequestrierung von TMRE führt. Durch die gemeinsame Verwendung dieser Farbstoffe können β-Zellen, die einer Mitophagie unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie als Fluozin-Populationmit hohemMtPhagy-hohemTMRE-Gehalt identifiziert werden. Da es sich bei der Mitophagie um einen dynamischen und nicht um einen statischen Prozess handelt, wurde dieses Protokoll optimiert, um den Mitophagiefluss mit Valinomycin zu bestimmen, einem K+-Ionophor, der die Mitophagie nach Dissipation von MMP18 induziert. Der Vergleich der Mitophagie in Gegenwart und Abwesenheit von Valinomycin ermöglicht die Beurteilung des Mitophagieflusses in verschiedenen Probengruppen.
Die farbstoffbasierte Natur des derzeitigen Ansatzes ermöglicht die Extrapolation auf menschliche Inseln und andere schwer zu transfizierende Zelltypen und umgeht im Gegensatz zum mt-Keima-Protokoll die Notwendigkeit komplizierter Tierzuchtschemata. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Quantifizierung der Mitophagie in β-Zellen auf Einzelzellebene durch zwei unabhängige, auf Durchflusszytometrie basierende Methoden. Zusammengenommen beschreibt dieses Protokoll zwei leistungsstarke und komplementäre Methoden, die sowohl Präzision als auch Flexibilität bei der quantitativen Untersuchung der mitochondrialen Qualitätskontrolle ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 &#181;g/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>F24195</td>
			<td>100 &#956;g Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 &#956;L DMSO and 51 &#956;L Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td>TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 &#956;M stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary approaches to interrogate mitophagy flux in pancreatic &#946;-cells

Die Mitophagie ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der für die Aufrechterhaltung einer optimalen Mitochondrienfunktion erforderlich ist. Eine dysfunktionale β-Zell-Mitophagie führt zu einer unzureichenden Insulinausschüttung. Fortgeschrittene quantitative Bewertungen der Mitophagie erfordern oft den Einsatz genetischer Reporter. Das mt-Keima-Mausmodell, das eine auf die Mitochondrien abzielende pH-sensitive ratiometrische Sonde mit doppelter Erregung zur Quantifizierung der Mitophagie mittels Durchflusszytometrie exprimiert, wurde in β-Zellen optimiert. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen kann zur robusten Quantifizierung der Mitophagie verwendet werden. Die Verwendung genetischer Mitophagie-Reporter kann jedoch eine Herausforderung darstellen, wenn mit komplexen genetischen Mausmodellen oder schwer zu transfizierenden Zellen, wie z. B. primären menschlichen Inseln, gearbeitet wird. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige komplementäre farbstoffbasierte Methode zur Quantifizierung der β-Zell-Mitophagie in primären Inselzellen mittels MtPhagy. MtPhagy ist ein pH-empfindlicher, zelldurchlässiger Farbstoff, der sich in den Mitochondrien anreichert und ihre Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sich Mitochondrien in Umgebungen mit niedrigem pH-Wert befinden, wie z. B. Lysosomen während der Mitophagie. Durch die Kombination des MtPhagy-Farbstoffs mit Fluozin-3-AM, einemZn2+ -Indikator, der für β-Zellen selektiert, und Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) zur Beurteilung des mitochondrialen Membranpotenzials kann der Mitophagiefluss in β-Zellen mittels Durchflusszytometrie spezifisch quantifiziert werden. Diese beiden Ansätze ergänzen sich in hohem Maße und ermöglichen Flexibilität und Präzision bei der Beurteilung der mitochondrialen Qualitätskontrolle in zahlreichen β-Zell-Modellen.

Pancreatic &#946;-cells produce and secrete insulin to meet metabolic demands, and &#946;-cell dysfunction is responsible for hyperglycemia and diabetes onset in both type 1 and type 2 diabetes. &#946;-Cells couple glucose metabolism with insulin secretion via mitochondrial energetics and metabolic output, which depend on a reserve of functional mitochondrial mass1,2,3. To maintain optimal &#946;-cell function, &#946;-cells rely on mitochondrial quality control mechanisms to remove aged or damaged mitochondria and preserve functional mitochondrial mass4. Selective mitochondrial autophagy, also known as mitophagy, is a key component of the mitochondrial quality control pathway.
Assessments of mitophagy in live cells often rely on changes in mitochondrial pH that occur during mitophagy. Mitochondria have a slightly alkaline pH, and healthy mitochondria normally reside in the pH-neutral cytosol. During mitophagy, damaged or dysfunctional mitochondria are selectively incorporated into autophagosomes and eventually cleared within acidic lysosomes5. Several in vivo transgenic mitophagy reporter mouse models, such as mt-Keima6, mitoQC7, and CMMR8, as well as transfectable mitophagy probes, such as the Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, utilize this pH change to provide quantitative assessments of mitophagy. Use of transgenic mice expressing the mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe has been optimized for mitophagy assessments in islets and &#946;-cells via flow cytometry10,11. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions (the ratio of acidic 561 nm to neutral 480 nm excitation) can be used to robustly quantify mitophagy6,12.
This protocol describes an optimized approach to assess mitophagy flux in primary islets and &#946;-cells isolated from mt-Keima transgenic mice10,11. While mt-Keima is a highly sensitive probe, it requires either complicated animal breeding schemes or the transfection of cells, which can often be challenging when working in combination with other genetic models or with primary human islets. Additionally, the use of multiple fluorescence lasers and detectors to identify neutral and acidic cell populations can limit the combinatorial use of other fluorescent reporters.
To overcome these challenges, this protocol also describes a complementary, single fluorescent channel, dye-based method for robust detection of mitophagy in &#946;-cells from isolated mouse islets. This approach, referred to as the MtPhagy method, utilizes a combination of three cell-permeable dyes to select for &#946;-cells, quantify the cell populations actively undergoing mitophagy, and assess mitochondrial membrane potential (MMP or &#916;&#968;m) simultaneously.
The first of these dyes is Fluozin-3-AM, a cell-permeable Zn2+ indicator with an Ex/Em 494/516 nm13. Mouse islets comprise a heterogeneous population of functionally distinct cells, including &#945;-, &#946;-, &#948;-, and PP cells. &#946;-Cells comprise approximately 80% of cells within the mouse islet and can be distinguished from other islet cell types due to their high Zn2+ concentration within insulin granules14,15, allowing for identification of &#946;-cells as the Fluozin-3-AMhigh population. The MtPhagy dye, a pH-sensitive dye that is immobilized on mitochondria via a chemical bond and emits weak fluorescence, is also utilized in this protocol16. Upon mitophagy induction, damaged mitochondria are incorporated into the acidic lysosome, and the MtPhagy dye increases its fluorescence intensity within the low pH environment (Ex/Em 561/570-700 nm).
Additionally, Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), is used to assess MMP. TMRE is a cell-permeable positively charged dye (Ex/Em 552/575 nm) that is sequestered by healthy mitochondria due to the relative negative charge upheld by their membrane potential17. Damaged or unhealthy mitochondria dissipate their membrane potential, resulting in decreased ability to sequester TMRE. Utilizing these dyes together, &#946;-cells undergoing mitophagy can be identified as the FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flow cytometry. Since mitophagy is a dynamic rather than static process, this protocol was optimized to assess mitophagy flux using valinomycin, a K+-ionophore that induces mitophagy following dissipation of MMP18. Comparison of mitophagy in the presence and absence of valinomycin allows for assessment of mitophagy flux in different sample groups.
The dye-based nature of the current approach allows it to be extrapolated to human islets and other difficult-to-transfect cell types and circumvents the need for complicated animal breeding schemes, unlike the mt-Keima protocol. The overarching goal of this protocol is to quantify mitophagy in &#946;-cells at the single-cell level via two independent flow cytometry-based methods. Taken together, this protocol describes two powerful and complementary methods that allow for both precision and flexibility in the quantitative study of mitochondrial quality control.

Autor im Rampenlicht: Bewertung des Mitophagieflusses in Pankreas-β-Zellen unter Verwendung effektiver und robuster komplementärer Ansätze 

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Our protocol describes two complementary methods to study beta-cell mitophagy flux at the single-cell resolution via flow cytometry. The mt-Keima protocol utilizes a genetic mitophagy reporter, whereas the MtPhagy protocol combines three fluorescent dyes, which makes it easy to extrapolate to difficult-to-transfect cells in human samples. Assessments of mitophagy using traditional biochemical approaches and imaging approaches are both time consuming and challenging.Thus, it's important to develop new, robust, and effective methods to study mitophagy flux in beta-cells. Both the mt-Keima and MtPhagy method are quantitative assessments that are efficient for studying mitophagy flux in pancreatic beta cells. So, the Soleimanpour lab focuses on the different mechanisms that drive pancreatic beta-cell failure and diabetes.And we specifically focus on the different aspects of mitochondrial lifecycle, including mitophagy, to understand how defects in mitochondrial function drive the development of diabetes.

Beurteilung der Mitophagie mit dem farbstoffbasierten MtPhagy-Ansatz Dieser farbstoffbasierte Ansatz wurde optimiert, um den Mitophagiefluss in primären β-Zellen der Maus zu analysieren, ohne dass ein genetischer Reporter erforderlich ist, wobei Fluozin-3-AM, TMRE und MtPhagy sowie DAPI verwendet wurden, um tote Zellen auszuschließen. Durch die Kombination dieser Farbstoffe mit Valinomycin, um die Mitophagie zu induzieren, skizziert dieses Protokoll eine farbstoffbasierte Methode zur selektiven Mes...

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Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur quantitativen Analyse der Mitophagie in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse: erstens eine Kombination zellpermeabler Mitochondrien-spezifischer Farbstoffe und zweitens einen genetisch kodierten Mitophagie-Reporter. Diese beiden Techniken ergänzen sich und können je nach Bedarf eingesetzt werden, was Flexibilität und Präzision bei der quantitativen Qualitätskontrolle der Mitochondrien ermöglicht.

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Unser Protokoll beschreibt zwei komplementäre Methoden zur Untersuchung des Betazell-Mitophagieflusses mit Einzelzellauflösung mittels Durchflusszytometrie. Das mt-Keima-Protokoll verwendet einen genetischen Mitophagie-Reporter, während das MtPhagy-Protokoll drei Fluoreszenzfarbstoffe kombiniert, was die Extrapolation auf schwer zu transfizierende Zellen in menschlichen Proben erleichtert. Die Beurteilung der Mitophagie mit traditionellen biochemischen Ansätzen und bildgebenden Verfahren ist sowohl zeitaufwändig als auch herausfordernd.Daher ist es wichtig, neue, robuste und effektive Methoden zu entwickeln, um den Mitophagiefluss in Betazellen zu untersuchen. Sowohl die mt-Keima- als auch die MtPhagy-Methode sind quantitative Beurteilungen, die für die Untersuchung des Mitophagieflusses in Betazellen der Bauchspeicheldrüse effizient sind. Daher konzentriert sich das Soleimanpour-Labor auf die verschiedenen Mechanismen, die das Versagen von Betazellen der Bauchspeicheldrüse und Diabetes vorantreiben.Und wir konzentrieren uns speziell auf die verschiedenen Aspekte des mitochondrialen Lebenszyklus, einschließlich der Mitophagie, um zu verstehen, wie Defekte in der mitochondrialen Funktion die Entwicklung von Diabetes vorantreiben.

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Research

JoVE Journal

Biology

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Forschung

Biologie

Single-Cell Dissociation of Murine Islets for Flow Cytometric Analysis of &#946;-Cell Mitophagy

Begin by culturing the eyelet samples isolated from regular fat diet or high fat diet mice overnight at 37 degrees Celsius. Design the desired experimental conditions for the study. For each experimental condition, using a pipette, pick 100 eyelets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of eyelet medium.To induce Mitophagy, treat the eyelets in the appropriate Petri dishes with two microliters of 250 nano molar Valinomycin stock for three hours. Isolate the eyelets and using a pipette, transfer the eyelets from each Petri dish to a separate micro centrifuge tube. Then, spin the eyelets at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius and using a pipette, discard the supernatant.Wash the obtained sample twice with one milliliter of PBS. Between the washes, spin the sample and discard the supernatant as demonstrated previously. To dissociate eyelets into single cells, add 500 microliters of 0.05%Trypsin prewarmed to 37 degrees celsius, to one sample tube.Pipette the contents of the tube up and down repeatedly until the eyelets are visibly dispersed. Immediately add one milliliter of prewarmed eyelet medium to neutralize trypsin. Spin the samples at 500 G for five minutes at 10 degrees Celsius.Remove the supernatant carefully without disturbing the pellet. Then, wash the samples two times with eyelet flow medium. The cell samples are now ready to be stained for flow cytometric analysis of beta cell mitophagy.

Einzelzelldissoziation von murinen Inselzellen zur durchflusszytometrischen Analyse der β-Zell-Mitophagie

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using MtPhagy Dye

Proceed to perform flow cytometric analysis of beta cell mitophagy, with a single cell suspension of about 100 isolated mirroring islets prepared, corresponding to each desired experimental condition to be studied. First, resuspend the islet samples for each condition in 500 microliters of islet flow medium. Add 0.25 microliters of MtPhagy stock to tubes designated to receive the MtPhagy dye.Similarly, add 0.25 microliters of TMRE stock and fluozin-3-AM stock to the respective designated tubes. Wrap the tubes in aluminum foil and vortex each tube at low speed for five seconds to mix the contents. Then incubate the tubes at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Halfway through incubation, vortex each sample at low speed for five to 10 seconds. After incubation, centrifuge the tubes at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant.And resuspend the samples in 500 microliters of islet flow medium. Add DAPI to the microcentrifuge tubes containing samples that require DAPI treatment. Centrifuge again and discard the supernatant as demonstrated previously.Resuspend the residue in 500 microliters of islet flow medium. Finally, place the samples on ice and then proceed with flow cytometry. Adjust the voltages for forward scatter or FSC and side scatter or SSC to ensure cell populations are at the center of the scatter plot.To exclude multiplets, at a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSC width. Adjust voltages and compensation for DAPI to filter for live beta cells. Set fluorescence gates for each fluorophore used based on the unstained RFD sample.Once gates are established, collect 10, 000 events per sample. Beta cells with high utilization of mitophagy were defined as the fluozin high MtPhagy high TMRE low population in quadrant three or Q3.Basal and valinomycin-induced mitophagy levels were characterized in both RFD and HFD islets.

Durchflusszytometrische Analyse der Mitophagie in murinen Pankreas-β-Zellen mit Hilfe des MtPhagy-Farbstoffs

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using the Genetically Encoded mt-Keima Reporter

To assess mitophagy in murine pancreatic beta cells using the genetically encoded mitophagy reporter, culture pancreatic islets isolated from wild type and Mt-Keima mice overnight at 37 degrees Celsius. The following day, add 100 islets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of islet medium for each experimental condition used in this protocol. Next, to dissociate the eyelets into single cells and stain with FluoZin-3-AM and DAPI as demonstrated previously for the Mt-Phagy dye based approach.Then proceed with the flow cytometric analysis of the samples. Adjust the forward scatter or FSC and side scatter or SSC voltages to attain an even distribution of cells on an SSCA versus FSCA plot. To select single cells and exclude multiplets, add a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSE width.The multiplets are excluded due to their higher width signal values. Then set up a DAPI negative gate to exclude dead cells. After that, set up FluoZin-3-AM positive gates to filter for live beta cells.Set up a triangle gating scheme using the Mt-Keima positive sample to identify acidic and neutral cell populations. Once the primary and fluorescence gates were established, assess mitophagy flux using basal and valinomycin-induced changes in Mt-Keima fluorescence.