Name: מחבר זרקור: הערכה של שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב באמצעות גישות משלימות יעילות וחזקות
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

א.ל-ד. מאשר תמיכה מה-NIH (T32-AI007413 ו-T32-AG000114). SAS מודה על תמיכתם של JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), המחלקה לענייני חיילים משוחררים (I01 BX004444), משפחת ברהם ומשפחת אנתוני.

המחקרים בבעלי חיים המוצגים בפרוטוקול זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני עשרים שבועות, שקיבלו דיאטת שומן רגילה של 15 שבועות (RFD) או דיאטה עתירת שומן (HFD).
1. הערכת מיטופגיה באמצעות גישת M...

ניתוח כמותי של מיטופגיה בתאי β של הלבלב

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+&#946;-cell+mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates &#946;-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+mitophagy.">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo.">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li><li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy.">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li><li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver.">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li><li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+protects+&#946;+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes.">Mitophagy protects &#946; cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).</li><li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy.">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li><li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+&#946;-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets.">Imaging &#946;-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).</li><li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule.">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).</li><li>Klein, B., W&#246;rndl, K., L&#252;tz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+intracellular+K(+)+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes.">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+&#946;+cells+in+diet-induced+obesity.">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic &#946; cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li><li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry.">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li><li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC.">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li><li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry.">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li></ol>

פרוטוקול זה תיאר שתי שיטות משלימות לכימות שטף מיטופגיה באיים עכבריים ראשוניים מנותקים. בשיטת mt-Keima כומתה עלייה במיטופגיה כיחס מוגבר של תאים חומציים (561 ננומטר)/ניטרליים (405 ננומטר), ואילו בשיטת MtPhagy כומתה שטף מיטופגיה מוגבר כגידול באוכלוסייתהתאים הגבוהה MtPhagyHighTMRE. שיטות אלה...

תאי β בלבלב מייצרים ומפרישים אינסולין כדי לעמוד בדרישות המטבוליות, ותפקוד לקוי של תאי β אחראי להתפרצות היפרגליקמיה וסוכרת הן בסוכרת מסוג 1 והן בסוכרת מסוג 2. תאי β משלבים מטבוליזם של גלוקוז עם הפרשת אינסולין באמצעות אנרגיה מיטוכונדריאלית ופלט מטבולי, אשר תלויים בעתודה של מסה מיטוכונדריאלית תפקודית 1,2,3. כדי לשמור על תפקוד מיטבי של תאי β, תאי β מסתמכים על מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריה כדי להסיר מיטוכונדריה מיושנים או פגומים ולשמר את המסה המיטוכונדריאלית התפקודית4. אוטופגיה מיטוכונדריאלית סלקטיבית, הידועה גם בשם מיטופגיה, היא מרכיב מרכזי במסלול בקרת האיכות של המיטוכונדריה.
הערכות של מיטופגיה בתאים חיים מסתמכות לעתים קרובות על שינויים ב- pH המיטוכונדריאלי המתרחשים במהלך מיטופגיה. למיטוכונדריה יש pH בסיסי מעט, ומיטוכונדריה בריאים בדרך כלל שוכנים בציטוזול ניטרלי עם pH. במהלך מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומים או לא מתפקדים משולבים באופן סלקטיבי באוטופגוזומים ובסופו של דבר מנוקים בתוך ליזוזומים חומציים5. מספר מודלים של עכברי כתב מיטופגיה טרנסגנית in vivo, כגון mt-Keima6, mitoQC7 ו-CMMR8, כמו גם בדיקות מיטופגיות טרנספקטיות, כגון פלסמיד Cox8-EGFP-mCherry9, משתמשים בשינוי pH זה כדי לספק הערכות כמותיות של מיטופגיה. השימוש בעכברים טרנסגניים המבטאים את ה-mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe עבר אופטימיזציה להערכות מיטופגיות באיים ובתאים β באמצעות ציטומטריית זרימה10,11. ניתן להשתמש ביחס בין פליטות אורכי גל חומציים לנייטרליים mt-Keima (היחס בין עירור חומצי של 561 ננומטר לעירור נייטרלי של 480 ננומטר) כדי לכמת בצורה איתנה מיטופגיה 6,12.
פרוטוקול זה מתאר גישה אופטימלית להערכת שטף מיטופגיה באיים ראשוניים ובתאי β שבודדו מעכברים טרנסגניים mt-Keima 10,11. בעוד mt-Keima היא בדיקה רגישה מאוד, זה דורש או תוכניות רבייה מסובכות של בעלי חיים או transfection של תאים, אשר לעתים קרובות יכול להיות מאתגר כאשר עובדים בשילוב עם מודלים גנטיים אחרים או עם איים אנושיים ראשוניים. בנוסף, השימוש במספר לייזרים וגלאים פלואורסצנטיים לזיהוי אוכלוסיות תאים ניטרליים וחומציים יכול להגביל את השימוש הקומבינטורי של כתבים פלואורסצנטיים אחרים.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, פרוטוקול זה מתאר גם שיטה משלימה, בעלת תעלה פלואורסצנטית יחידה, מבוססת צבע, לזיהוי חזק של מיטופגיה בתאי β מאיי עכבר מבודדים. גישה זו, המכונה שיטת MtPhagy, משתמשת בשילוב של שלושה צבעים חדירים לתאים כדי לבחור תאים β, לכמת את אוכלוסיות התאים שעוברות מיטופגיה באופן פעיל, ולהעריך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP או Δψm) בו זמנית.
הראשון מבין צבעים אלה הוא Fluozin-3-AM, מחוון Zn2+ חדיר לתאים עם Ex/Em 494/516 nm13. איי עכבר מהווים אוכלוסייה הטרוגנית של תאים נבדלים מבחינה תפקודית, כולל תאי α, β, δ ו- PP. תאי β מהווים כ-80% מהתאים בתוך איון העכבר וניתן להבדיל בינם לבין סוגי תאי איון אחרים בשל ריכוזם הגבוה Zn2+ בגרגרי אינסולין14,15, המאפשר זיהוי של תאי β כאוכלוסייההגבוהה של פלואוזין-3-AM. צבע MtPhagy, צבע רגיש ל- pH המשותק על המיטוכונדריה באמצעות קשר כימי ופולט פלואורסצנטיות חלשה, משמש גם בפרוטוקולזה 16. עם השראת מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומה משולבת בליזוזום החומצי, וצבע MtPhagy מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות שלו בסביבת pH נמוכה (Ex/Em 561/570-700 ננומטר).
בנוסף, טטרמתילרודמין, אתיל אסטר (TMRE), משמש להערכת MMP. TMRE הוא צבע בעל מטען חיובי חדיר לתאים (Ex/Em 552/575 nm) אשר נתפס על ידי מיטוכונדריה בריאה בשל המטען השלילי היחסי הנתמך על ידי פוטנציאל הממברנה שלהם17. מיטוכונדריה פגומה או לא בריאה מפזרת את פוטנציאל הממברנה שלהם, וכתוצאה מכך היכולת לבודד TMRE יורדת. באמצעות שימוש בצבעים אלה יחד, ניתן לזהות β תאים שעוברים מיטופגיה כאוכלוסייהנמוכה של פלואוזיןגבוה MtPhagyגבוהTMRE באמצעות ציטומטריית זרימה. מאחר שמיטופגיה היא תהליך דינמי ולא סטטי, פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה להערכת שטף מיטופגיה באמצעות Valinomycin, K+-ionophore המשרה מיטופגיה לאחר פיזור MMP18. השוואה של מיטופגיה בנוכחות והיעדר valinomycin מאפשרת הערכה של שטף מיטופגיה בקבוצות מדגם שונות.
האופי מבוסס הצבע של הגישה הנוכחית מאפשר להסיק אותה על איים אנושיים וסוגי תאים קשים אחרים להעברה ולעקוף את הצורך בתוכניות גידול מסובכות של בעלי חיים, בניגוד לפרוטוקול mt-Keima. מטרת העל של פרוטוקול זה היא לכמת מיטופגיה בתאי β ברמת התא הבודד באמצעות שתי שיטות עצמאיות מבוססות ציטומטריית זרימה. יחד, פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות חזקות ומשלימות המאפשרות דיוק וגמישות במחקר כמותי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 &#181;g/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>F24195</td>
			<td>100 &#956;g Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 &#956;L DMSO and 51 &#956;L Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td>TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 &#956;M stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary approaches to interrogate mitophagy flux in pancreatic &#946;-cells

מיטופגיה היא מנגנון בקרת איכות הכרחי לשמירה על תפקוד מיטוכונדריאלי אופטימלי. מיטופגיה לא מתפקדת של תאי β גורמת לשחרור אינסולין לא מספיק. הערכות כמותיות מתקדמות של מיטופגיה דורשות לעתים קרובות שימוש במדווחים גנטיים. מודל העכבר mt-Keima, המבטא בדיקה ממוקדת pH רגישה למיטוכונדריה בעלת יחס עירור כפול לכימות מיטופגיה באמצעות ציטומטריית זרימה, עבר אופטימיזציה בתאי β. ניתן להשתמש ביחס בין פליטות אורכי גל mt-Keima חומציים לנייטרליים כדי לכמת מיטופגיה בצורה איתנה. עם זאת, שימוש בכתבי מיטופגיה גנטית יכול להיות מאתגר כאשר עובדים עם מודלים גנטיים מורכבים של עכברים או תאים קשים להעברה, כגון איים אנושיים ראשוניים. פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית מבוססת צבע משלימה לכימות מיטופגיה של β תאים באיים ראשוניים באמצעות MtPhagy. MtPhagy הוא צבע רגיש ל-pH וחדיר לתאים שמצטבר במיטוכונדריה ומגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות שלו כאשר מיטוכונדריה נמצאים בסביבות pH נמוכות, כמו ליזוזומים במהלך מיטופגיה. על ידי שילוב צבע MtPhagy עם Fluozin-3-AM, מחוון Zn2+ הבוחר עבור תאי β, וטטרמתילרודמין, אתיל אסטר (TMRE) להערכת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, ניתן לכמת שטף מיטופגיה באופן ספציפי בתאי β באמצעות ציטומטריית זרימה. שתי גישות אלה משלימות מאוד, ומאפשרות גמישות ודיוק בהערכת בקרת איכות מיטוכונדריאלית במודלים רבים של תאי β.

Pancreatic &#946;-cells produce and secrete insulin to meet metabolic demands, and &#946;-cell dysfunction is responsible for hyperglycemia and diabetes onset in both type 1 and type 2 diabetes. &#946;-Cells couple glucose metabolism with insulin secretion via mitochondrial energetics and metabolic output, which depend on a reserve of functional mitochondrial mass1,2,3. To maintain optimal &#946;-cell function, &#946;-cells rely on mitochondrial quality control mechanisms to remove aged or damaged mitochondria and preserve functional mitochondrial mass4. Selective mitochondrial autophagy, also known as mitophagy, is a key component of the mitochondrial quality control pathway.
Assessments of mitophagy in live cells often rely on changes in mitochondrial pH that occur during mitophagy. Mitochondria have a slightly alkaline pH, and healthy mitochondria normally reside in the pH-neutral cytosol. During mitophagy, damaged or dysfunctional mitochondria are selectively incorporated into autophagosomes and eventually cleared within acidic lysosomes5. Several in vivo transgenic mitophagy reporter mouse models, such as mt-Keima6, mitoQC7, and CMMR8, as well as transfectable mitophagy probes, such as the Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, utilize this pH change to provide quantitative assessments of mitophagy. Use of transgenic mice expressing the mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe has been optimized for mitophagy assessments in islets and &#946;-cells via flow cytometry10,11. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions (the ratio of acidic 561 nm to neutral 480 nm excitation) can be used to robustly quantify mitophagy6,12.
This protocol describes an optimized approach to assess mitophagy flux in primary islets and &#946;-cells isolated from mt-Keima transgenic mice10,11. While mt-Keima is a highly sensitive probe, it requires either complicated animal breeding schemes or the transfection of cells, which can often be challenging when working in combination with other genetic models or with primary human islets. Additionally, the use of multiple fluorescence lasers and detectors to identify neutral and acidic cell populations can limit the combinatorial use of other fluorescent reporters.
To overcome these challenges, this protocol also describes a complementary, single fluorescent channel, dye-based method for robust detection of mitophagy in &#946;-cells from isolated mouse islets. This approach, referred to as the MtPhagy method, utilizes a combination of three cell-permeable dyes to select for &#946;-cells, quantify the cell populations actively undergoing mitophagy, and assess mitochondrial membrane potential (MMP or &#916;&#968;m) simultaneously.
The first of these dyes is Fluozin-3-AM, a cell-permeable Zn2+ indicator with an Ex/Em 494/516 nm13. Mouse islets comprise a heterogeneous population of functionally distinct cells, including &#945;-, &#946;-, &#948;-, and PP cells. &#946;-Cells comprise approximately 80% of cells within the mouse islet and can be distinguished from other islet cell types due to their high Zn2+ concentration within insulin granules14,15, allowing for identification of &#946;-cells as the Fluozin-3-AMhigh population. The MtPhagy dye, a pH-sensitive dye that is immobilized on mitochondria via a chemical bond and emits weak fluorescence, is also utilized in this protocol16. Upon mitophagy induction, damaged mitochondria are incorporated into the acidic lysosome, and the MtPhagy dye increases its fluorescence intensity within the low pH environment (Ex/Em 561/570-700 nm).
Additionally, Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), is used to assess MMP. TMRE is a cell-permeable positively charged dye (Ex/Em 552/575 nm) that is sequestered by healthy mitochondria due to the relative negative charge upheld by their membrane potential17. Damaged or unhealthy mitochondria dissipate their membrane potential, resulting in decreased ability to sequester TMRE. Utilizing these dyes together, &#946;-cells undergoing mitophagy can be identified as the FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flow cytometry. Since mitophagy is a dynamic rather than static process, this protocol was optimized to assess mitophagy flux using valinomycin, a K+-ionophore that induces mitophagy following dissipation of MMP18. Comparison of mitophagy in the presence and absence of valinomycin allows for assessment of mitophagy flux in different sample groups.
The dye-based nature of the current approach allows it to be extrapolated to human islets and other difficult-to-transfect cell types and circumvents the need for complicated animal breeding schemes, unlike the mt-Keima protocol. The overarching goal of this protocol is to quantify mitophagy in &#946;-cells at the single-cell level via two independent flow cytometry-based methods. Taken together, this protocol describes two powerful and complementary methods that allow for both precision and flexibility in the quantitative study of mitochondrial quality control.

מחבר זרקור: הערכה של שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב באמצעות גישות משלימות יעילות וחזקות 

גישות משלימות לחקירת שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב

Our protocol describes two complementary methods to study beta-cell mitophagy flux at the single-cell resolution via flow cytometry. The mt-Keima protocol utilizes a genetic mitophagy reporter, whereas the MtPhagy protocol combines three fluorescent dyes, which makes it easy to extrapolate to difficult-to-transfect cells in human samples. Assessments of mitophagy using traditional biochemical approaches and imaging approaches are both time consuming and challenging.Thus, it's important to develop new, robust, and effective methods to study mitophagy flux in beta-cells. Both the mt-Keima and MtPhagy method are quantitative assessments that are efficient for studying mitophagy flux in pancreatic beta cells. So, the Soleimanpour lab focuses on the different mechanisms that drive pancreatic beta-cell failure and diabetes.And we specifically focus on the different aspects of mitochondrial lifecycle, including mitophagy, to understand how defects in mitochondrial function drive the development of diabetes.

הערכת מיטופגיה באמצעות גישת MtPhagy מבוססת צבע גישה מבוססת צבע זו הותאמה לניתוח שטף מיטופגיה בתוך תאי β עכבר ראשוניים ללא צורך בכתב גנטי, תוך שימוש בפלוזין-3-AM, TMRE ו- MtPhagy וכן DAPI כדי להוציא תאים מתים. על ידי זיווג צבעים אלה עם valinomycin כדי לגרום mitophagy, פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת צבע למדו...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לניתוח כמותי של מיטופגיה בתאי β של הלבלב: הראשונה, שילוב של צבעים ספציפיים למיטוכונדריה החדירים, ושנית, כתב מיטופגיה מקודד גנטית. שתי טכניקות אלה משלימות זו את זו וניתנות לפריסה על בסיס צרכים ספציפיים, ומאפשרות גמישות ודיוק בטיפול כמותי בבקרת איכות מיטוכונדריאלית.

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

הפרוטוקול שלנו מתאר שתי שיטות משלימות לחקר שטף מיטופגיה של תאי בטא ברזולוציה של תא בודד באמצעות ציטומטריית זרימה. פרוטוקול mt-Keima משתמש בכתב מיטופגיה גנטית, ואילו פרוטוקול MtPhagy משלב שלושה צבעים פלואורסצנטיים, מה שמקל על אקסטרפולציה לתאים קשים להעברה בדגימות אנושיות. הערכות של מיטופגיה באמצעות גישות ביוכימיות מסורתיות וגישות הדמיה הן גוזלות זמן רב ומאתגרות.לכן, חשוב לפתח שיטות חדשות, חזקות ויעילות לחקר שטף מיטופגיה בתאי בטא. הן שיטת mt-Keima והן שיטת MtPhagy הן הערכות כמותיות היעילות לחקר שטף מיטופגיה בתאי בטא של הלבלב. לכן, מעבדת סולימנפור מתמקדת במנגנונים השונים המניעים אי ספיקת תאי בטא בלבלב וסוכרת.אנו מתמקדים באופן ספציפי בהיבטים השונים של מחזור החיים של המיטוכונדריה, כולל מיטופגיה, כדי להבין כיצד פגמים בתפקוד המיטוכונדריה מניעים את התפתחות הסוכרת.

complementary-approaches-to-interrogate-mitophagy-flux-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Single-Cell Dissociation of Murine Islets for Flow Cytometric Analysis of &#946;-Cell Mitophagy

Begin by culturing the eyelet samples isolated from regular fat diet or high fat diet mice overnight at 37 degrees Celsius. Design the desired experimental conditions for the study. For each experimental condition, using a pipette, pick 100 eyelets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of eyelet medium.To induce Mitophagy, treat the eyelets in the appropriate Petri dishes with two microliters of 250 nano molar Valinomycin stock for three hours. Isolate the eyelets and using a pipette, transfer the eyelets from each Petri dish to a separate micro centrifuge tube. Then, spin the eyelets at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius and using a pipette, discard the supernatant.Wash the obtained sample twice with one milliliter of PBS. Between the washes, spin the sample and discard the supernatant as demonstrated previously. To dissociate eyelets into single cells, add 500 microliters of 0.05%Trypsin prewarmed to 37 degrees celsius, to one sample tube.Pipette the contents of the tube up and down repeatedly until the eyelets are visibly dispersed. Immediately add one milliliter of prewarmed eyelet medium to neutralize trypsin. Spin the samples at 500 G for five minutes at 10 degrees Celsius.Remove the supernatant carefully without disturbing the pellet. Then, wash the samples two times with eyelet flow medium. The cell samples are now ready to be stained for flow cytometric analysis of beta cell mitophagy.

דיסוציאציה חד-תאית של איי מורין לאנליזה ציטומטרית של מיטופגיה β-תאית

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using MtPhagy Dye

Proceed to perform flow cytometric analysis of beta cell mitophagy, with a single cell suspension of about 100 isolated mirroring islets prepared, corresponding to each desired experimental condition to be studied. First, resuspend the islet samples for each condition in 500 microliters of islet flow medium. Add 0.25 microliters of MtPhagy stock to tubes designated to receive the MtPhagy dye.Similarly, add 0.25 microliters of TMRE stock and fluozin-3-AM stock to the respective designated tubes. Wrap the tubes in aluminum foil and vortex each tube at low speed for five seconds to mix the contents. Then incubate the tubes at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Halfway through incubation, vortex each sample at low speed for five to 10 seconds. After incubation, centrifuge the tubes at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant.And resuspend the samples in 500 microliters of islet flow medium. Add DAPI to the microcentrifuge tubes containing samples that require DAPI treatment. Centrifuge again and discard the supernatant as demonstrated previously.Resuspend the residue in 500 microliters of islet flow medium. Finally, place the samples on ice and then proceed with flow cytometry. Adjust the voltages for forward scatter or FSC and side scatter or SSC to ensure cell populations are at the center of the scatter plot.To exclude multiplets, at a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSC width. Adjust voltages and compensation for DAPI to filter for live beta cells. Set fluorescence gates for each fluorophore used based on the unstained RFD sample.Once gates are established, collect 10, 000 events per sample. Beta cells with high utilization of mitophagy were defined as the fluozin high MtPhagy high TMRE low population in quadrant three or Q3.Basal and valinomycin-induced mitophagy levels were characterized in both RFD and HFD islets.

אנליזה ציטומטרית של מיטופגיה בתאי β של הלבלב באמצעות MtPhagy Dye

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using the Genetically Encoded mt-Keima Reporter

To assess mitophagy in murine pancreatic beta cells using the genetically encoded mitophagy reporter, culture pancreatic islets isolated from wild type and Mt-Keima mice overnight at 37 degrees Celsius. The following day, add 100 islets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of islet medium for each experimental condition used in this protocol. Next, to dissociate the eyelets into single cells and stain with FluoZin-3-AM and DAPI as demonstrated previously for the Mt-Phagy dye based approach.Then proceed with the flow cytometric analysis of the samples. Adjust the forward scatter or FSC and side scatter or SSC voltages to attain an even distribution of cells on an SSCA versus FSCA plot. To select single cells and exclude multiplets, add a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSE width.The multiplets are excluded due to their higher width signal values. Then set up a DAPI negative gate to exclude dead cells. After that, set up FluoZin-3-AM positive gates to filter for live beta cells.Set up a triangle gating scheme using the Mt-Keima positive sample to identify acidic and neutral cell populations. Once the primary and fluorescence gates were established, assess mitophagy flux using basal and valinomycin-induced changes in Mt-Keima fluorescence.