Name: लेखक स्पॉटलाइट: प्रभावी और मजबूत पूरक दृष्टिकोण का उपयोग कर अग्नाशय β कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स का आकलन
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

ई.एल.डी. एनआईएच (टी 32-AI007413 और टी 32-AG000114) से समर्थन स्वीकार करता है। SAS JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), वयोवृद्ध मामलों के विभाग (I01 BX004444), ब्रेहम परिवार और एंथोनी परिवार से समर्थन स्वीकार करता है।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत पशु अध्ययन की समीक्षा की और मिशिगन संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया. बीस सप्ताह के पुरुष C57BL/6J चूहों, या तो 15 सप्ताह के नियमित वसा ...

Murine अग्नाशय β-कोशिकाओं में माइटोफैगी का मात्रात्मक विश्लेषण

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	<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+&#946;-cell+mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates &#946;-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+mitophagy.">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>McWilliams, T. 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X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver.">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li><li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+protects+&#946;+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes.">Mitophagy protects &#946; cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).</li><li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy.">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li><li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+&#946;-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets.">Imaging &#946;-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).</li><li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule.">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).</li><li>Klein, B., W&#246;rndl, K., L&#252;tz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+intracellular+K(+)+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes.">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+&#946;+cells+in+diet-induced+obesity.">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic &#946; cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li><li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry.">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li><li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC.">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li><li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry.">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल ने अलग-अलग प्राथमिक माउस आइलेट्स में माइटोफैगी प्रवाह की मात्रा निर्धारित करने के लिए दो पूरक तरीकों का वर्णन किया। एमटी-कीमा विधि का उपयोग करते हुए, माइटोफैगी में वृद्धि को अम्लीय (561 एनए?...

अग्नाशयी β-कोशिकाएं चयापचय मांगों को पूरा करने के लिए इंसुलिन का उत्पादन और स्राव करती हैं, और β-सेल डिसफंक्शन टाइप 1 और टाइप 2 मधुमेह दोनों में हाइपरग्लाइसेमिया और मधुमेह की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है। β-कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान और चयापचय उत्पादन के माध्यम से इंसुलिन स्राव के साथ ग्लूकोज चयापचय को जोड़ती हैं, जो कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान 1,2,3 के रिजर्व पर निर्भर करती हैं। इष्टतम β-सेल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए, β-कोशिकाएं वृद्ध या क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमानको संरक्षित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर भरोसा करती हैं। चयनात्मक माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी, जिसे माइटोफैगी के रूप में भी जाना जाता है, माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग का एक प्रमुख घटक है।
जीवित कोशिकाओं में माइटोफैगी का आकलन अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल पीएच में परिवर्तन पर निर्भर करता है जो माइटोफैगी के दौरान होता है। माइटोकॉन्ड्रिया में थोड़ा क्षारीय पीएच होता है, और स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया सामान्य रूप से पीएच-तटस्थ साइटोसोल में रहते हैं। माइटोफैगी के दौरान, क्षतिग्रस्त या शिथिल माइटोकॉन्ड्रिया को चुनिंदा रूप से ऑटोफैगोसोम में शामिल किया जाता है और अंततः अम्लीय लाइसोसोमके भीतर साफ किया जाता है। विवो ट्रांसजेनिक माइटोफैगी रिपोर्टर माउस मॉडल में कई, जैसे एमटी-कीमा6, माइटोक्यूसी7, और सीएमएमआर8, साथ ही ट्रांसफेक्टेबल माइटोफैगी जांच, जैसे कि कॉक्स 8-ईजीएफपी-एमचेरी प्लास्मिड9, माइटोफैगी के मात्रात्मक आकलन प्रदान करने के लिए इस पीएच परिवर्तन का उपयोग करते हैं। एमटी-कीमा पीएच-संवेदनशील दोहरी-उत्तेजना अनुपातमितीय जांच को व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री10,11के माध्यम से आइलेट्स और β-कोशिकाओं में माइटोफैगी आकलन के लिए अनुकूलित किया गया है। अम्लीय-से-तटस्थ एमटी-कीमा तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन (अम्लीय 561 एनएम से तटस्थ 480 एनएम उत्तेजना का अनुपात) का अनुपात माइटोफैगी 6,12 को मजबूती से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल प्राथमिक आइलेट्स और β-कोशिकाओं में माइटोफैगी प्रवाह का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण का वर्णन करता है जो एमटी-कीमा ट्रांसजेनिक चूहों 10,11से अलग है। जबकि एमटी-कीमा एक अत्यधिक संवेदनशील जांच है, इसके लिए या तो जटिल पशु प्रजनन योजनाओं या कोशिकाओं के अभिकर्मक की आवश्यकता होती है, जो अक्सर अन्य आनुवंशिक मॉडल या प्राथमिक मानव आइलेट्स के साथ संयोजन में काम करते समय चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, तटस्थ और अम्लीय सेल आबादी की पहचान करने के लिए कई प्रतिदीप्ति लेज़रों और डिटेक्टरों का उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट पत्रकारों के दहनशील उपयोग को सीमित कर सकता है।
इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, इस प्रोटोकॉल भी एक पूरक, एकल फ्लोरोसेंट चैनल, अलग माउस आइलेट्स से β कोशिकाओं में mitophagy के मजबूत पता लगाने के लिए डाई आधारित विधि का वर्णन करता है. यह दृष्टिकोण, जिसे MtPhagy विधि के रूप में संदर्भित किया जाता है, β-कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए तीन सेल-पारगम्य रंगों के संयोजन का उपयोग करता है, सक्रिय रूप से माइटोफैगी से गुजरने वाली सेल आबादी की मात्रा निर्धारित करता है, और एक साथ माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (MMP या Δψm) का आकलन करता है।
इन रंगों में से पहला फ्लोज़िन-3-एएम है, जो एक सेल-पारगम्य Zn2+ संकेतक है जिसमें Ex/Em 494/516 nm13 है। माउस आइलेट्स में कार्यात्मक रूप से अलग-अलग कोशिकाओं की एक विषम आबादी शामिल है, जिसमें α-, β-, δ- और पीपी कोशिकाएं शामिल हैं। β-कोशिकाओं माउस आइलेट के भीतर कोशिकाओं के लगभग 80% शामिल हैं और इंसुलिन कणिकाओं14,15 के भीतर उनके उच्च Zn2+ एकाग्रता के कारण अन्य आइलेट सेल प्रकार से अलग किया जा सकता है, Fluozin-3 AMउच्च आबादी के रूप में β कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है. MtPhagy डाई, एक पीएच संवेदनशील डाई है कि एक रासायनिक बंधन के माध्यम से mitochondria पर immobilized है और कमजोर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, भी इस प्रोटोकॉल16 में प्रयोग किया जाता है. माइटोफैगी प्रेरण पर, क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को अम्लीय लाइसोसोम में शामिल किया जाता है, और MtPhagy डाई कम पीएच वातावरण (Ex/Em 561/570-700 nm) के भीतर इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ाती है।
इसके अतिरिक्त, टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर (टीएमआरई), का उपयोग एमएमपी का आकलन करने के लिए किया जाता है। टीएमआरई एक सेल-पारगम्य सकारात्मक चार्ज डाई (पूर्व / ईएम 552/575 एनएम) है जो स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा अनुक्रमित है क्योंकि उनके झिल्ली क्षमता17 द्वारा बनाए गए सापेक्ष नकारात्मक चार्ज के कारण। क्षतिग्रस्त या अस्वास्थ्यकर माइटोकॉन्ड्रिया उनकी झिल्ली क्षमता को नष्ट कर देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप टीएमआरई को अनुक्रमित करने की क्षमता कम हो जाती है। इन रंगों का एक साथ उपयोग करते हुए, माइटोफैगी से गुजरने वाली β-कोशिकाओं को फ्लोटिन साइटोमेट्री के माध्यम से फ्लुओज़िनउच्चएमटीफैगीउच्चटीएमआरईकम आबादी के रूप में पहचाना जा सकता है। चूंकि माइटोफैगी स्थैतिक प्रक्रिया के बजाय एक गतिशील है, इसलिए इस प्रोटोकॉल को वैलिनोमाइसिन का उपयोग करके माइटोफैगी फ्लक्स का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया गया था, एक के +-आयनोफोर जो एमएमपी18 के अपव्यय के बाद माइटोफैगी को प्रेरित करता है। वैलिनोमाइसिन की उपस्थिति और अनुपस्थिति में माइटोफैगी की तुलना विभिन्न नमूना समूहों में माइटोफैगी प्रवाह के आकलन की अनुमति देती है।
वर्तमान दृष्टिकोण की डाई-आधारित प्रकृति इसे मानव आइलेट्स और अन्य कठिन-से-ट्रांसफ़ेक्ट सेल प्रकारों के लिए एक्सट्रपलेशन करने की अनुमति देती है और एमटी-कीमा प्रोटोकॉल के विपरीत, जटिल पशु प्रजनन योजनाओं की आवश्यकता को दरकिनार करती है। इस प्रोटोकॉल का व्यापक लक्ष्य दो स्वतंत्र प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधियों के माध्यम से एकल-कोशिका स्तर पर β-कोशिकाओं में माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करना है। एक साथ लिया, इस प्रोटोकॉल दो शक्तिशाली और पूरक तरीकों है कि दोनों परिशुद्धता और माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण के मात्रात्मक अध्ययन में लचीलापन के लिए अनुमति का वर्णन करता है.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 &#181;g/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>F24195</td>
			<td>100 &#956;g Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 &#956;L DMSO and 51 &#956;L Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td>TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 &#956;M stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary approaches to interrogate mitophagy flux in pancreatic &#946;-cells

माइटोफैगी एक गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र है जो इष्टतम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। डिसफंक्शनल β-सेल माइटोफैगी के परिणामस्वरूप अपर्याप्त इंसुलिन रिलीज होता है। माइटोफैगी के उन्नत मात्रात्मक आकलन के लिए अक्सर आनुवंशिक पत्रकारों के उपयोग की आवश्यकता होती है। एमटी-कीमा माउस मॉडल, जो प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित पीएच-संवेदनशील दोहरी-उत्तेजना अनुपातमितीय जांच को व्यक्त करता है, को β-कोशिकाओं में अनुकूलित किया गया है। अम्लीय-से-तटस्थ mt-Keima तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के अनुपात का उपयोग माइटोफैगी को मजबूती से निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जटिल आनुवंशिक माउस मॉडल या मुश्किल-से-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, जैसे प्राथमिक मानव आइलेट्स के साथ काम करते समय आनुवंशिक माइटोफैगी पत्रकारों का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह प्रोटोकॉल MtPhagy का उपयोग करके प्राथमिक आइलेट्स में β-सेल माइटोफैगी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपन्यास पूरक डाई-आधारित विधि का वर्णन करता है। MtPhagy एक पीएच-संवेदनशील, सेल-पारगम्य डाई है जो माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होती है और इसकी प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है जब माइटोकॉन्ड्रिया कम पीएच वातावरण में होते हैं, जैसे कि माइटोफैगी के दौरान लाइसोसोम। Fluozin-3-AM के साथ MtPhagy डाई के संयोजन से, एक Zn2+ संकेतक जो β-कोशिकाओं के लिए चयन करता है, और टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर (TMRE) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का आकलन करने के लिए, माइटोफैगी फ्लक्स को विशेष रूप से प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से β-कोशिकाओं में निर्धारित किया जा सकता है। ये दो दृष्टिकोण अत्यधिक पूरक हैं, जो कई β-सेल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण का आकलन करने में लचीलेपन और सटीकता की अनुमति देते हैं।

Pancreatic &#946;-cells produce and secrete insulin to meet metabolic demands, and &#946;-cell dysfunction is responsible for hyperglycemia and diabetes onset in both type 1 and type 2 diabetes. &#946;-Cells couple glucose metabolism with insulin secretion via mitochondrial energetics and metabolic output, which depend on a reserve of functional mitochondrial mass1,2,3. To maintain optimal &#946;-cell function, &#946;-cells rely on mitochondrial quality control mechanisms to remove aged or damaged mitochondria and preserve functional mitochondrial mass4. Selective mitochondrial autophagy, also known as mitophagy, is a key component of the mitochondrial quality control pathway.
Assessments of mitophagy in live cells often rely on changes in mitochondrial pH that occur during mitophagy. Mitochondria have a slightly alkaline pH, and healthy mitochondria normally reside in the pH-neutral cytosol. During mitophagy, damaged or dysfunctional mitochondria are selectively incorporated into autophagosomes and eventually cleared within acidic lysosomes5. Several in vivo transgenic mitophagy reporter mouse models, such as mt-Keima6, mitoQC7, and CMMR8, as well as transfectable mitophagy probes, such as the Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, utilize this pH change to provide quantitative assessments of mitophagy. Use of transgenic mice expressing the mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe has been optimized for mitophagy assessments in islets and &#946;-cells via flow cytometry10,11. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions (the ratio of acidic 561 nm to neutral 480 nm excitation) can be used to robustly quantify mitophagy6,12.
This protocol describes an optimized approach to assess mitophagy flux in primary islets and &#946;-cells isolated from mt-Keima transgenic mice10,11. While mt-Keima is a highly sensitive probe, it requires either complicated animal breeding schemes or the transfection of cells, which can often be challenging when working in combination with other genetic models or with primary human islets. Additionally, the use of multiple fluorescence lasers and detectors to identify neutral and acidic cell populations can limit the combinatorial use of other fluorescent reporters.
To overcome these challenges, this protocol also describes a complementary, single fluorescent channel, dye-based method for robust detection of mitophagy in &#946;-cells from isolated mouse islets. This approach, referred to as the MtPhagy method, utilizes a combination of three cell-permeable dyes to select for &#946;-cells, quantify the cell populations actively undergoing mitophagy, and assess mitochondrial membrane potential (MMP or &#916;&#968;m) simultaneously.
The first of these dyes is Fluozin-3-AM, a cell-permeable Zn2+ indicator with an Ex/Em 494/516 nm13. Mouse islets comprise a heterogeneous population of functionally distinct cells, including &#945;-, &#946;-, &#948;-, and PP cells. &#946;-Cells comprise approximately 80% of cells within the mouse islet and can be distinguished from other islet cell types due to their high Zn2+ concentration within insulin granules14,15, allowing for identification of &#946;-cells as the Fluozin-3-AMhigh population. The MtPhagy dye, a pH-sensitive dye that is immobilized on mitochondria via a chemical bond and emits weak fluorescence, is also utilized in this protocol16. Upon mitophagy induction, damaged mitochondria are incorporated into the acidic lysosome, and the MtPhagy dye increases its fluorescence intensity within the low pH environment (Ex/Em 561/570-700 nm).
Additionally, Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), is used to assess MMP. TMRE is a cell-permeable positively charged dye (Ex/Em 552/575 nm) that is sequestered by healthy mitochondria due to the relative negative charge upheld by their membrane potential17. Damaged or unhealthy mitochondria dissipate their membrane potential, resulting in decreased ability to sequester TMRE. Utilizing these dyes together, &#946;-cells undergoing mitophagy can be identified as the FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flow cytometry. Since mitophagy is a dynamic rather than static process, this protocol was optimized to assess mitophagy flux using valinomycin, a K+-ionophore that induces mitophagy following dissipation of MMP18. Comparison of mitophagy in the presence and absence of valinomycin allows for assessment of mitophagy flux in different sample groups.
The dye-based nature of the current approach allows it to be extrapolated to human islets and other difficult-to-transfect cell types and circumvents the need for complicated animal breeding schemes, unlike the mt-Keima protocol. The overarching goal of this protocol is to quantify mitophagy in &#946;-cells at the single-cell level via two independent flow cytometry-based methods. Taken together, this protocol describes two powerful and complementary methods that allow for both precision and flexibility in the quantitative study of mitochondrial quality control.

लेखक स्पॉटलाइट: प्रभावी और मजबूत पूरक दृष्टिकोण का उपयोग कर अग्नाशय β कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स का आकलन 

अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी फ्लक्स से पूछताछ करने के लिए पूरक दृष्टिकोण

Our protocol describes two complementary methods to study beta-cell mitophagy flux at the single-cell resolution via flow cytometry. The mt-Keima protocol utilizes a genetic mitophagy reporter, whereas the MtPhagy protocol combines three fluorescent dyes, which makes it easy to extrapolate to difficult-to-transfect cells in human samples. Assessments of mitophagy using traditional biochemical approaches and imaging approaches are both time consuming and challenging.Thus, it's important to develop new, robust, and effective methods to study mitophagy flux in beta-cells. Both the mt-Keima and MtPhagy method are quantitative assessments that are efficient for studying mitophagy flux in pancreatic beta cells. So, the Soleimanpour lab focuses on the different mechanisms that drive pancreatic beta-cell failure and diabetes.And we specifically focus on the different aspects of mitochondrial lifecycle, including mitophagy, to understand how defects in mitochondrial function drive the development of diabetes.

डाई-आधारित MtPhagy दृष्टिकोण के माध्यम से माइटोफैगी का आकलन करना इस डाई-आधारित दृष्टिकोण को मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए फ्लुओज़िन -3-एएम, टीएमआरई और एमटीफैगी के साथ-साथ डीएपीआई का उपयोग करके आनु?...

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यह प्रोटोकॉल अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए दो तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है: पहला, सेल-पारगम्य माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट रंगों का संयोजन, और दूसरा, एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड माइटोफैगी रिपोर्टर। ये दो तकनीकें पूरक हैं और विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर तैनात की जा सकती हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण को मात्रात्मक रूप से संबोधित करने में लचीलापन और सटीकता की अनुमति मिलती है।

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

हमारा प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एकल-कोशिका संकल्प पर बीटा-सेल माइटोफैगी प्रवाह का अध्ययन करने के लिए दो पूरक तरीकों का वर्णन करता है। एमटी-कीमा प्रोटोकॉल एक आनुवंशिक माइटोफैगी रिपोर्टर का उपयोग करता है, जबकि एमटीफैगी प्रोटोकॉल तीन फ्लोरोसेंट रंगों को जोड़ता है, जो मानव नमूनों में मुश्किल-से-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को एक्सट्रपलेशन करना आसान बनाता है। पारंपरिक जैव रासायनिक दृष्टिकोण और इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके माइटोफैगी का आकलन समय लेने वाली और चुनौतीपूर्ण दोनों हैं।इस प्रकार, बीटा-कोशिकाओं में माइटोफैगी प्रवाह का अध्ययन करने के लिए नए, मजबूत और प्रभावी तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है। एमटी-कीमा और एमटीफैगी दोनों विधि मात्रात्मक आकलन हैं जो अग्नाशयी बीटा कोशिकाओं में माइटोफैगी प्रवाह का अध्ययन करने के लिए कुशल हैं। तो, सोलेमनपुर लैब विभिन्न तंत्रों पर ध्यान केंद्रित करती है जो अग्नाशयी बीटा-सेल विफलता और मधुमेह को चलाती हैं।और हम विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल जीवनचक्र के विभिन्न पहलुओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिसमें माइटोफैगी भी शामिल है, यह समझने के लिए कि माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में दोष मधुमेह के विकास को कैसे चलाते हैं।

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Research

JoVE Journal

Biology

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Single-Cell Dissociation of Murine Islets for Flow Cytometric Analysis of &#946;-Cell Mitophagy

Begin by culturing the eyelet samples isolated from regular fat diet or high fat diet mice overnight at 37 degrees Celsius. Design the desired experimental conditions for the study. For each experimental condition, using a pipette, pick 100 eyelets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of eyelet medium.To induce Mitophagy, treat the eyelets in the appropriate Petri dishes with two microliters of 250 nano molar Valinomycin stock for three hours. Isolate the eyelets and using a pipette, transfer the eyelets from each Petri dish to a separate micro centrifuge tube. Then, spin the eyelets at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius and using a pipette, discard the supernatant.Wash the obtained sample twice with one milliliter of PBS. Between the washes, spin the sample and discard the supernatant as demonstrated previously. To dissociate eyelets into single cells, add 500 microliters of 0.05%Trypsin prewarmed to 37 degrees celsius, to one sample tube.Pipette the contents of the tube up and down repeatedly until the eyelets are visibly dispersed. Immediately add one milliliter of prewarmed eyelet medium to neutralize trypsin. Spin the samples at 500 G for five minutes at 10 degrees Celsius.Remove the supernatant carefully without disturbing the pellet. Then, wash the samples two times with eyelet flow medium. The cell samples are now ready to be stained for flow cytometric analysis of beta cell mitophagy.

β-सेल माइटोफैगी के फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए म्यूरिन आइलेट्स का एकल-सेल पृथक्करण

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using MtPhagy Dye

Proceed to perform flow cytometric analysis of beta cell mitophagy, with a single cell suspension of about 100 isolated mirroring islets prepared, corresponding to each desired experimental condition to be studied. First, resuspend the islet samples for each condition in 500 microliters of islet flow medium. Add 0.25 microliters of MtPhagy stock to tubes designated to receive the MtPhagy dye.Similarly, add 0.25 microliters of TMRE stock and fluozin-3-AM stock to the respective designated tubes. Wrap the tubes in aluminum foil and vortex each tube at low speed for five seconds to mix the contents. Then incubate the tubes at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Halfway through incubation, vortex each sample at low speed for five to 10 seconds. After incubation, centrifuge the tubes at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant.And resuspend the samples in 500 microliters of islet flow medium. Add DAPI to the microcentrifuge tubes containing samples that require DAPI treatment. Centrifuge again and discard the supernatant as demonstrated previously.Resuspend the residue in 500 microliters of islet flow medium. Finally, place the samples on ice and then proceed with flow cytometry. Adjust the voltages for forward scatter or FSC and side scatter or SSC to ensure cell populations are at the center of the scatter plot.To exclude multiplets, at a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSC width. Adjust voltages and compensation for DAPI to filter for live beta cells. Set fluorescence gates for each fluorophore used based on the unstained RFD sample.Once gates are established, collect 10, 000 events per sample. Beta cells with high utilization of mitophagy were defined as the fluozin high MtPhagy high TMRE low population in quadrant three or Q3.Basal and valinomycin-induced mitophagy levels were characterized in both RFD and HFD islets.

MtPhagy डाई का उपयोग करके Murine अग्नाशयी β-कोशिकाओं में माइटोफैगी का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using the Genetically Encoded mt-Keima Reporter

To assess mitophagy in murine pancreatic beta cells using the genetically encoded mitophagy reporter, culture pancreatic islets isolated from wild type and Mt-Keima mice overnight at 37 degrees Celsius. The following day, add 100 islets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of islet medium for each experimental condition used in this protocol. Next, to dissociate the eyelets into single cells and stain with FluoZin-3-AM and DAPI as demonstrated previously for the Mt-Phagy dye based approach.Then proceed with the flow cytometric analysis of the samples. Adjust the forward scatter or FSC and side scatter or SSC voltages to attain an even distribution of cells on an SSCA versus FSCA plot. To select single cells and exclude multiplets, add a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSE width.The multiplets are excluded due to their higher width signal values. Then set up a DAPI negative gate to exclude dead cells. After that, set up FluoZin-3-AM positive gates to filter for live beta cells.Set up a triangle gating scheme using the Mt-Keima positive sample to identify acidic and neutral cell populations. Once the primary and fluorescence gates were established, assess mitophagy flux using basal and valinomycin-induced changes in Mt-Keima fluorescence.