Name: 저자 스포트라이트: 효과적이고 강력한 보완적 접근법을 사용한 췌장 β세포의 미토파지 플럭스 평가
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

E.L-D. NIH(T32-AI007413 및 T32-AG000114)의 지원을 인정합니다. SAS는 JDRF(COE-2019-861), NIH(R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), 재향군인회(I01 BX004444), Brehm 가족 및 Anthony 가족의 지원을 인정합니다.

이 프로토콜에 제시된 동물 연구는 University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했습니다. 이 연구에는 15주 일반 지방 식단(RFD) 또는 고지방 식단(HFD)을 섭취한 20주 된 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다.
1. 염료 기반 MtPhagy 접근법을 통한 미토파지 평가(방법 1)
<ol><li>쥐 섬 준비 및 처리<ol><li>아래 단계에 따라 섬 배양 및 valinomycin 노출?...

쥐 췌장 β세포의 유사분열(Mitophagy)에 대한 정량적 분석

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+&#946;-cell+mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates &#946;-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+mitophagy.">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo.">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li><li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy.">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li><li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver.">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li><li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+protects+&#946;+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes.">Mitophagy protects &#946; cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).</li><li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy.">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li><li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+&#946;-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets.">Imaging &#946;-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).</li><li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule.">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).</li><li>Klein, B., W&#246;rndl, K., L&#252;tz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+intracellular+K(+)+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes.">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+&#946;+cells+in+diet-induced+obesity.">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic &#946; cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li><li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry.">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li><li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC.">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li><li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry.">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li></ol>

이 프로토콜은 해리된 1차 마우스 섬에서 미토파지 플럭스를 정량화하기 위한 두 가지 보완적인 방법을 설명했습니다. mt-Keima 방법을 사용하여 미토파지의 증가는 산성(561nm)/중성(405nm) 세포의 증가된 비율로 정량화된 반면, MtPhagy 방법에서는 증가된 미토파지 플럭스가 FluozinhighMtPhagy높은TMRE낮은 세포 집단의 증가로 정량화되었습니다. 이러한 방법을 사용하면 미토파지 플?...

췌장 β세포는 대사 요구를 충족시키기 위해 인슐린을 생산하고 분비하며, β세포 기능 장애는 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두에서 고혈당증과 당뇨병 발병의 원인이 됩니다. β-세포는 미토콘드리아 에너지 및 대사 출력을 통해 포도당 대사와 인슐린 분비를 결합하며, 이는 기능적 미토콘드리아 질량 1,2,3의 예비력에 의존합니다. β세포는 최적의 β세포 기능을 유지하기 위해 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의존하여 노화되거나 손상된 미토콘드리아를 제거하고 기능적인 미토콘드리아 질량을 보존합니다4. 선택적 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)은 미토콘드리아 품질 관리 경로의 핵심 구성 요소입니다.
살아있는 세포의 미토파지 평가는 종종 미토파지 중에 발생하는 미토콘드리아 pH의 변화에 의존합니다. 미토콘드리아는 약알칼리성 pH를 가지고 있으며, 건강한 미토콘드리아는 일반적으로 pH 중성 세포질에 존재합니다. 미토파지(mitophagy) 동안, 손상되거나 기능장애를 일으킨 미토콘드리아는 선택적으로 자가포식체에 통합되고 결국 산성 리소좀 내에서 제거된다5. mt-Keima6, mitoQC7 및 CMMR8과 같은 여러 in vivo 형질전환 미토파지 리포터 마우스 모델과 Cox8-EGFP-mCherry 플라스미드9와 같은 형질주입 가능한 미토파지 프로브는 이러한 pH 변화를 활용하여 미토파지의 정량적 평가를 제공합니다. mt-Keima pH 민감성 이중 여기 비율계량 프로브를 발현하는 형질전환 마우스의 사용은 유세포 분석10,11을 통해 섬 및 β세포의 미토파지 평가에 최적화되었습니다. 산성 대 중성 mt-Keima 파장 방출의 비율(산성 561nm와 중성 480nm 여기의 비율)은 미토파지 6,12를 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 mt-Keima 형질전환 마우스10,11에서 분리한 일차 섬 및 β-세포에서 미토파지 플럭스를 평가하기 위한 최적화된 접근법을 설명합니다. mt-Keima는 매우 민감한 프로브이지만 복잡한 동물 사육 계획이나 세포의 형질주입이 필요하며, 이는 다른 유전자 모델 또는 주요 인간 섬과 함께 작업할 때 종종 어려울 수 있습니다. 또한 중성 및 산성 세포 집단을 식별하기 위해 여러 형광 레이저 및 검출기를 사용하면 다른 형광 리포터의 조합 사용을 제한할 수 있습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해 이 프로토콜은 또한 분리된 마우스 섬의 β세포에서 미토파지를 강력하게 검출하기 위한 보완적인 단일 형광 채널, 염료 기반 방법을 설명합니다. MtPhagy 방법이라고 하는 이 접근법은 세 가지 세포 투과성 염료의 조합을 사용하여 β 세포를 선택하고, 미토파지(mitophagy)를 활발하게 진행 중인 세포 집단을 정량화하고, 미토콘드리아 막 전위(MMP 또는 Δψm)를 동시에 평가합니다.
이 염료 중 첫 번째는 Ex/Em 494/516 nm13을 갖는 세포 투과성 Zn2+ 지시체인 Fluozin-3-AM입니다. 마우스 섬은 α, β, δ 및 PP 세포를 포함하여 기능적으로 구별되는 세포의 이질적인 집단으로 구성됩니다. β-세포는 마우스 섬 내 세포의 약 80%를 구성하며 인슐린 과립14,15 내의 높은 Zn2+ 농도로 인해 다른 섬 세포 유형과 구별할 수 있어 β 세포를 Fluozin-3-AM높은 집단으로 식별할 수 있습니다. 화학 결합을 통해 미토콘드리아에 고정되고 약한 형광을 방출하는 pH에 민감한 염료인 MtPhagy 염료도 이 프로토콜16에서 활용됩니다. 미토파지 유도 시 손상된 미토콘드리아가 산성 리소좀에 통합되고 MtPhagy 염료는 낮은 pH 환경(Ex/Em 561/570-700nm) 내에서 형광 강도를 증가시킵니다.
또한 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르(TMRE)를 사용하여 MMP를 평가합니다. TMRE는 세포 투과성 양전하를 띤 염료(Ex/Em 552/575 nm)로, 막 전위17에 의해 유지되는 상대적인 음전하로 인해 건강한 미토콘드리아에 의해 격리됩니다. 손상되거나 건강하지 않은 미토콘드리아는 막 전위를 소멸시켜 TMRE를 격리하는 능력을 감소시킵니다. 이러한 염료를 함께 활용하면 미토파지를 겪는 β 세포를 유세포 분석을 통해 FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population으로 식별할 수 있습니다. 미토파지는 정적 과정이 아닌 동적 과정이기 때문에 이 프로토콜은 MMP18의 소산 후 미토파지를 유도하는 K+-이온단인 발리노마이신을 사용하여 미토파지 플럭스를 평가하도록 최적화되었습니다. valinomycin의 존재와 부재 상태에서 미토파지를 비교하면 다양한 샘플 그룹에서 미토파지 플럭스를 평가할 수 있습니다.
현재 접근 방식의 염료 기반 특성으로 인해 인간 섬 및 기타 transfection이 어려운 세포 유형으로 외삽할 수 있으며 mt-Keima 프로토콜과 달리 복잡한 동물 육종 계획의 필요성을 피할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 두 가지 독립적인 유세포 분석 기반 방법을 통해 단일 세포 수준에서 β 세포의 미토파지를 정량화하는 것입니다. 종합하면, 이 프로토콜은 미토콘드리아 품질 관리의 정량적 연구에서 정확성과 유연성을 모두 허용하는 두 가지 강력하고 보완적인 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 &#181;g/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>F24195</td>
			<td>100 &#956;g Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 &#956;L DMSO and 51 &#956;L Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td>TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 &#956;M stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary approaches to interrogate mitophagy flux in pancreatic &#946;-cells

미토파지는 최적의 미토콘드리아 기능을 유지하는 데 필요한 품질 관리 메커니즘입니다. 기능 장애β세포 미토파지는 인슐린 분비를 불충분하게 만듭니다. 미토파지의 고급 정량적 평가는 종종 유전자 보고자의 사용을 필요로 합니다. 유세포 분석을 통해 미토파지를 정량화하기 위한 미토콘드리아 표적 pH 민감성 이중 여기 비율계량 프로브를 발현하는 mt-Keima 마우스 모델은 β 세포에서 최적화되었습니다. 산성 대 중성 mt-Keima 파장 방출의 비율은 미토파지를 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 유전자 미토파지 리포터를 사용하는 것은 복잡한 유전자 마우스 모델 또는 주요 인간 섬과 같이 transfection하기 어려운 세포로 작업할 때 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 MtPhagy를 사용하여 1차 섬에서 β세포 미토파지를 정량화하는 새로운 보완 염료 기반 방법을 설명합니다. MtPhagy는 미토콘드리아에 축적되어 미토콘드리아가 미토파지 중 리소좀과 같은 낮은 pH 환경에 있을 때 형광 강도를 증가시키는 pH에 민감한 세포 투과성 염료입니다. MtPhagy 염료를 β세포를 선택하는 Zn2+ 표지자인 Fluozin-3-AM 및 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르(TMRE)와 결합하여 미토콘드리아 막 전위를 평가함으로써 유세포 분석을 통해 β세포에서 미토파지 플럭스를 특이적으로 정량화할 수 있습니다. 이 두 가지 접근 방식은 매우 상호 보완적이어서 수많은 β세포 모델에서 미토콘드리아 품질 관리를 평가하는 데 유연성과 정확성을 제공합니다.

Pancreatic &#946;-cells produce and secrete insulin to meet metabolic demands, and &#946;-cell dysfunction is responsible for hyperglycemia and diabetes onset in both type 1 and type 2 diabetes. &#946;-Cells couple glucose metabolism with insulin secretion via mitochondrial energetics and metabolic output, which depend on a reserve of functional mitochondrial mass1,2,3. To maintain optimal &#946;-cell function, &#946;-cells rely on mitochondrial quality control mechanisms to remove aged or damaged mitochondria and preserve functional mitochondrial mass4. Selective mitochondrial autophagy, also known as mitophagy, is a key component of the mitochondrial quality control pathway.
Assessments of mitophagy in live cells often rely on changes in mitochondrial pH that occur during mitophagy. Mitochondria have a slightly alkaline pH, and healthy mitochondria normally reside in the pH-neutral cytosol. During mitophagy, damaged or dysfunctional mitochondria are selectively incorporated into autophagosomes and eventually cleared within acidic lysosomes5. Several in vivo transgenic mitophagy reporter mouse models, such as mt-Keima6, mitoQC7, and CMMR8, as well as transfectable mitophagy probes, such as the Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, utilize this pH change to provide quantitative assessments of mitophagy. Use of transgenic mice expressing the mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe has been optimized for mitophagy assessments in islets and &#946;-cells via flow cytometry10,11. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions (the ratio of acidic 561 nm to neutral 480 nm excitation) can be used to robustly quantify mitophagy6,12.
This protocol describes an optimized approach to assess mitophagy flux in primary islets and &#946;-cells isolated from mt-Keima transgenic mice10,11. While mt-Keima is a highly sensitive probe, it requires either complicated animal breeding schemes or the transfection of cells, which can often be challenging when working in combination with other genetic models or with primary human islets. Additionally, the use of multiple fluorescence lasers and detectors to identify neutral and acidic cell populations can limit the combinatorial use of other fluorescent reporters.
To overcome these challenges, this protocol also describes a complementary, single fluorescent channel, dye-based method for robust detection of mitophagy in &#946;-cells from isolated mouse islets. This approach, referred to as the MtPhagy method, utilizes a combination of three cell-permeable dyes to select for &#946;-cells, quantify the cell populations actively undergoing mitophagy, and assess mitochondrial membrane potential (MMP or &#916;&#968;m) simultaneously.
The first of these dyes is Fluozin-3-AM, a cell-permeable Zn2+ indicator with an Ex/Em 494/516 nm13. Mouse islets comprise a heterogeneous population of functionally distinct cells, including &#945;-, &#946;-, &#948;-, and PP cells. &#946;-Cells comprise approximately 80% of cells within the mouse islet and can be distinguished from other islet cell types due to their high Zn2+ concentration within insulin granules14,15, allowing for identification of &#946;-cells as the Fluozin-3-AMhigh population. The MtPhagy dye, a pH-sensitive dye that is immobilized on mitochondria via a chemical bond and emits weak fluorescence, is also utilized in this protocol16. Upon mitophagy induction, damaged mitochondria are incorporated into the acidic lysosome, and the MtPhagy dye increases its fluorescence intensity within the low pH environment (Ex/Em 561/570-700 nm).
Additionally, Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), is used to assess MMP. TMRE is a cell-permeable positively charged dye (Ex/Em 552/575 nm) that is sequestered by healthy mitochondria due to the relative negative charge upheld by their membrane potential17. Damaged or unhealthy mitochondria dissipate their membrane potential, resulting in decreased ability to sequester TMRE. Utilizing these dyes together, &#946;-cells undergoing mitophagy can be identified as the FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flow cytometry. Since mitophagy is a dynamic rather than static process, this protocol was optimized to assess mitophagy flux using valinomycin, a K+-ionophore that induces mitophagy following dissipation of MMP18. Comparison of mitophagy in the presence and absence of valinomycin allows for assessment of mitophagy flux in different sample groups.
The dye-based nature of the current approach allows it to be extrapolated to human islets and other difficult-to-transfect cell types and circumvents the need for complicated animal breeding schemes, unlike the mt-Keima protocol. The overarching goal of this protocol is to quantify mitophagy in &#946;-cells at the single-cell level via two independent flow cytometry-based methods. Taken together, this protocol describes two powerful and complementary methods that allow for both precision and flexibility in the quantitative study of mitochondrial quality control.

저자 스포트라이트: 효과적이고 강력한 보완적 접근법을 사용한 췌장 β세포의 미토파지 플럭스 평가 

췌장 β세포에서 미토파지 플럭스를 조사하기 위한 보완적 접근법

Our protocol describes two complementary methods to study beta-cell mitophagy flux at the single-cell resolution via flow cytometry. The mt-Keima protocol utilizes a genetic mitophagy reporter, whereas the MtPhagy protocol combines three fluorescent dyes, which makes it easy to extrapolate to difficult-to-transfect cells in human samples. Assessments of mitophagy using traditional biochemical approaches and imaging approaches are both time consuming and challenging.Thus, it's important to develop new, robust, and effective methods to study mitophagy flux in beta-cells. Both the mt-Keima and MtPhagy method are quantitative assessments that are efficient for studying mitophagy flux in pancreatic beta cells. So, the Soleimanpour lab focuses on the different mechanisms that drive pancreatic beta-cell failure and diabetes.And we specifically focus on the different aspects of mitochondrial lifecycle, including mitophagy, to understand how defects in mitochondrial function drive the development of diabetes.

염료 기반 MtPhagy 접근법을 통한 미토파지 평가 이 염료 기반 접근법은 죽은 세포를 배제하기 위해 DAPI뿐만 아니라 Fluozin-3-AM, TMRE, MtPhagy를 사용하여 유전자 리포터 없이 일차 마우스 β세포 내의 미토파지 플럭스를 분석하도록 최적화되었습니다. 이러한 염료를 발리노마이신과 짝을 이루어 미토파지를 유도함으로써, 이 프로토콜은 일차 마우스 β-세포에서 미토파지 플럭스를 선택적...

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이 프로토콜은 췌장 β 세포에서 미토파지의 정량적 분석을 위한 두 가지 방법을 설명합니다: 첫 번째는 세포 투과성 미토콘드리아 특이적 염료의 조합이고, 두 번째는 유전적으로 인코딩된 미토파지 리포터입니다. 이 두 기술은 상호 보완적이며 특정 요구 사항에 따라 배포할 수 있으므로 미토콘드리아 품질 관리를 정량적으로 처리하는 데 유연성과 정밀도를 제공합니다.

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

당사의 프로토콜은 유세포 분석을 통해 단일 세포 분해능에서 베타 세포 미토파지 플럭스를 연구하기 위한 두 가지 보완 방법을 설명합니다. mt-Keima 프로토콜은 유전자 미토파지 리포터를 사용하는 반면, MtPhagy 프로토콜은 3가지 형광 염료를 결합하여 인간 샘플에서 transfection이 어려운 세포로 쉽게 외삽할 수 있습니다. 전통적인 생화학적 접근법과 이미징 접근법을 사용한 미토파지 평가는 시간이 많이 걸리고 까다롭습니다.따라서 베타 세포의 미토파지 플럭스를 연구하기 위한 새롭고 강력하며 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요합니다. mt-Keima 및 MtPhagy 방법은 모두 췌장 베타 세포의 미토파지 플럭스를 연구하는 데 효율적인 정량적 평가입니다. 따라서 Soleimanpour 실험실은 췌장 베타 세포 부전과 당뇨병을 유발하는 다양한 메커니즘에 초점을 맞춥니다.그리고 우리는 특히 미토콘드리아 기능의 결함이 어떻게 당뇨병의 발병을 유발하는지 이해하기 위해 미토파지를 포함한 미토콘드리아 수명 주기의 다양한 측면에 초점을 맞춥니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

연구

생물학

Single-Cell Dissociation of Murine Islets for Flow Cytometric Analysis of &#946;-Cell Mitophagy

Begin by culturing the eyelet samples isolated from regular fat diet or high fat diet mice overnight at 37 degrees Celsius. Design the desired experimental conditions for the study. For each experimental condition, using a pipette, pick 100 eyelets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of eyelet medium.To induce Mitophagy, treat the eyelets in the appropriate Petri dishes with two microliters of 250 nano molar Valinomycin stock for three hours. Isolate the eyelets and using a pipette, transfer the eyelets from each Petri dish to a separate micro centrifuge tube. Then, spin the eyelets at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius and using a pipette, discard the supernatant.Wash the obtained sample twice with one milliliter of PBS. Between the washes, spin the sample and discard the supernatant as demonstrated previously. To dissociate eyelets into single cells, add 500 microliters of 0.05%Trypsin prewarmed to 37 degrees celsius, to one sample tube.Pipette the contents of the tube up and down repeatedly until the eyelets are visibly dispersed. Immediately add one milliliter of prewarmed eyelet medium to neutralize trypsin. Spin the samples at 500 G for five minutes at 10 degrees Celsius.Remove the supernatant carefully without disturbing the pellet. Then, wash the samples two times with eyelet flow medium. The cell samples are now ready to be stained for flow cytometric analysis of beta cell mitophagy.

β세포 미토파지의 유세포 분석을 위한 쥐 섬의 단일 세포 해리

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using MtPhagy Dye

Proceed to perform flow cytometric analysis of beta cell mitophagy, with a single cell suspension of about 100 isolated mirroring islets prepared, corresponding to each desired experimental condition to be studied. First, resuspend the islet samples for each condition in 500 microliters of islet flow medium. Add 0.25 microliters of MtPhagy stock to tubes designated to receive the MtPhagy dye.Similarly, add 0.25 microliters of TMRE stock and fluozin-3-AM stock to the respective designated tubes. Wrap the tubes in aluminum foil and vortex each tube at low speed for five seconds to mix the contents. Then incubate the tubes at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Halfway through incubation, vortex each sample at low speed for five to 10 seconds. After incubation, centrifuge the tubes at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant.And resuspend the samples in 500 microliters of islet flow medium. Add DAPI to the microcentrifuge tubes containing samples that require DAPI treatment. Centrifuge again and discard the supernatant as demonstrated previously.Resuspend the residue in 500 microliters of islet flow medium. Finally, place the samples on ice and then proceed with flow cytometry. Adjust the voltages for forward scatter or FSC and side scatter or SSC to ensure cell populations are at the center of the scatter plot.To exclude multiplets, at a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSC width. Adjust voltages and compensation for DAPI to filter for live beta cells. Set fluorescence gates for each fluorophore used based on the unstained RFD sample.Once gates are established, collect 10, 000 events per sample. Beta cells with high utilization of mitophagy were defined as the fluozin high MtPhagy high TMRE low population in quadrant three or Q3.Basal and valinomycin-induced mitophagy levels were characterized in both RFD and HFD islets.

MtPhagy 염료를 사용한 쥐 췌장 β세포의 미토파지의 유세포 분석

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using the Genetically Encoded mt-Keima Reporter

To assess mitophagy in murine pancreatic beta cells using the genetically encoded mitophagy reporter, culture pancreatic islets isolated from wild type and Mt-Keima mice overnight at 37 degrees Celsius. The following day, add 100 islets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of islet medium for each experimental condition used in this protocol. Next, to dissociate the eyelets into single cells and stain with FluoZin-3-AM and DAPI as demonstrated previously for the Mt-Phagy dye based approach.Then proceed with the flow cytometric analysis of the samples. Adjust the forward scatter or FSC and side scatter or SSC voltages to attain an even distribution of cells on an SSCA versus FSCA plot. To select single cells and exclude multiplets, add a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSE width.The multiplets are excluded due to their higher width signal values. Then set up a DAPI negative gate to exclude dead cells. After that, set up FluoZin-3-AM positive gates to filter for live beta cells.Set up a triangle gating scheme using the Mt-Keima positive sample to identify acidic and neutral cell populations. Once the primary and fluorescence gates were established, assess mitophagy flux using basal and valinomycin-induced changes in Mt-Keima fluorescence.