Name: Författare i fokus: Bedömning av mitofagiskt flöde i bukspottkörtelns β-celler med hjälp av effektiva och robusta komplementära metoder
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

E.L-D. Parlamentet erkänner stöd från NIH (T32-AI007413 och T32-AG000114). SAS bekräftar stöd från JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), familjen Brehm och familjen Anthony.

Djurstudierna som presenteras i detta protokoll har granskats och godkänts av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Tjugo veckor gamla C57BL/6J-möss, på antingen en 15-veckors vanlig fettdiet (RFD) eller högfettdiet (HFD), användes för denna studie.
1. Bedömning av mitofagi med hjälp av den färgämnesbaserade MtPhagy-metoden (metod 1)
<ol><li>Förberedelse och behandling av musöar<ol><li>Utför öodling och exponering för valinomycin ...

Kvantitativ analys av mitofagi i murina pankreas-β-celler

<ol>
	<li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+regulation+of+&#946;-cell+function:+maintaining+the+momentum+for+insulin+release.">Mitochondrial regulation of &#946;-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li><li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy.">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li><li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clec16a,+Nrdp1,+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+&#946;-cell+mitophagy.">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates &#946;-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li><li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+by+mitophagy.">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li><li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy.">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+mitophagy.">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo.">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li><li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy.">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li><li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver.">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li><li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+protects+&#946;+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes.">Mitophagy protects &#946; cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).</li><li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy.">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li><li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima.">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).</li><li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+&#946;-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets.">Imaging &#946;-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).</li><li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule.">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li><li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining.">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).</li><li>Klein, B., W&#246;rndl, K., L&#252;tz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+intracellular+K(+)+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes.">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+&#946;+cells+in+diet-induced+obesity.">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic &#946; cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li><li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry.">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li><li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mt-Keima+detects+PINK1-PRKN+mitophagy+in+vivo+with+greater+sensitivity+than+mito-QC.">Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC.</a> Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).</li><li>Mauro-Lizcano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+to+assess+mitophagy+flux+by+flow+cytometry.">New method to assess mitophagy flux by flow cytometry.</a> Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).</li></ol>

Detta protokoll beskrev två komplementära metoder för att kvantifiera mitofagiskt flöde i dissocierade primära musöar. Med hjälp av mt-Keima-metoden kvantifierades en ökning av mitofagi som en ökad kvot av sura (561 nm) / neutrala (405 nm) celler, medan i MtPhagy-metoden kvantifierades ökat mitofagiflöde som en ökning i FluozinhighMtPhagyhighTMRElow cell population. Dessa metoder möjliggör snabba, kvantitativa och β-cellspecifika bedömningar av mitofagiflödet.
<p clas...

Bukspottkörtelns β-celler producerar och utsöndrar insulin för att möta metaboliska krav, och β-cellsdysfunktion är ansvarig för hyperglykemi och diabetesdebut vid både typ 1- och typ 2-diabetes. β-celler kopplar glukosmetabolism med insulinutsöndring via mitokondriell energi och metabolisk produktion, som beror på en reserv av funktionell mitokondriell massa 1,2,3. För att upprätthålla optimal β-cellsfunktion förlitar sig β-celler på mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer för att avlägsna åldrade eller skadade mitokondrier och bevara funktionell mitokondriell massa4. Selektiv mitokondriell autofagi, även känd som mitofagi, är en nyckelkomponent i den mitokondriella kvalitetskontrollvägen.
Bedömningar av mitofagi i levande celler förlitar sig ofta på förändringar i mitokondriellt pH som uppstår under mitofagi. Mitokondrier har ett svagt alkaliskt pH, och friska mitokondrier finns normalt i den pH-neutrala cytosolen. Under mitofagi inkorporeras skadade eller dysfunktionella mitokondrier selektivt i autofagosomer och elimineras så småningom i sura lysosomer5. Flera in vivo transgena mitofagiska reportermusmodeller, såsom mt-Keima6, mitoQC7 och CMMR8, såväl som transfekterbara mitofagiska sonder, såsom Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, använder denna pH-förändring för att ge kvantitativa bedömningar av mitofagi. Användning av transgena möss som uttrycker den pH-känsliga dual-excitation ratiometriska sonden mt-Keima har optimerats för mitofagibedömningar i öar och β-celler via flödescytometri 10,11. Förhållandet mellan sur och neutral mt-Keima-våglängdsemission (förhållandet mellan sur 561 nm och neutral 480 nm excitation) kan användas för att på ett robust sätt kvantifiera mitofagi 6,12.
Detta protokoll beskriver ett optimerat tillvägagångssätt för att bedöma mitofagiflödet i primära öar och β-celler isolerade från mt-Keima transgena möss 10,11. Även om mt-Keima är en mycket känslig sond kräver den antingen komplicerade djuravelssystem eller transfektion av celler, vilket ofta kan vara en utmaning när man arbetar i kombination med andra genetiska modeller eller med primära mänskliga öar. Dessutom kan användningen av flera fluorescenslasrar och detektorer för att identifiera neutrala och sura cellpopulationer begränsa den kombinatoriska användningen av andra fluorescerande rapportörer.
För att övervinna dessa utmaningar beskriver detta protokoll också en komplementär, enkelfluorescerande kanal, färgämnesbaserad metod för robust detektion av mitofagi i β-celler från isolerade musöar. Detta tillvägagångssätt, kallat MtPhagy-metoden, använder en kombination av tre cellpermeabla färgämnen för att selektera för β-celler, kvantifiera cellpopulationerna som aktivt genomgår mitofagi och bedöma mitokondriell membranpotential (MMP eller Δψm) samtidigt.
Det första av dessa färgämnen är Fluozin-3-AM, en cellpermeabel Zn2+-indikator med en Ex/Em 494/516 nm13. Musöar består av en heterogen population av funktionellt distinkta celler, inklusive α-, β-, δ- och PP-celler. β-celler utgör cirka 80 % av cellerna i musön och kan särskiljas från andra ö-celltyper på grund av deras höga Zn2+-koncentration i insulingranulat14,15, vilket gör det möjligt att identifiera β-celler som denhöga populationen av Fluozin-3-AM. MtPhagy-färgämnet, ett pH-känsligt färgämne som immobiliseras på mitokondrier via en kemisk bindning och avger svag fluorescens, används också i detta protokoll16. Vid mitofaginiduktion inkorporeras skadade mitokondrier i den sura lysosomen, och MtFagy-färgämnet ökar sin fluorescensintensitet i miljön med lågt pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
Dessutom används tetrametylrhodamin, etylester (TMRE), för att bedöma MMP. TMRE är ett cellpermeabelt positivt laddat färgämne (Ex/Em 552/575 nm) som binds av friska mitokondrier på grund av den relativa negativa laddningen som upprätthålls av deras membranpotential17. Skadade eller sjuka mitokondrier förlorar sin membranpotential, vilket resulterar i minskad förmåga att binda TMRE. Genom att använda dessa färgämnen tillsammans kan β-celler som genomgår mitofagi identifieras som FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flödescytometri. Eftersom mitofagi är en dynamisk snarare än statisk process, optimerades detta protokoll för att bedöma mitofagiskt flöde med hjälp av valinomycin, en K+-jonofor som inducerar mitofagi efter avledning av MMP18. Jämförelse av mitofagi i närvaro och frånvaro av valinomycin möjliggör bedömning av mitofagiskt flöde i olika provgrupper.
Den nuvarande metodens färgämnesbaserade karaktär gör det möjligt att extrapolera den till mänskliga öar och andra celltyper som är svåra att transfektera och kringgår behovet av komplicerade djuravelssystem, till skillnad från mt-Keima-protokollet. Det övergripande målet med detta protokoll är att kvantifiera mitofagi i β-celler på encellsnivå via två oberoende flödescytometribaserade metoder. Sammantaget beskriver detta protokoll två kraftfulla och kompletterande metoder som möjliggör både precision och flexibilitet i den kvantitativa studien av mitokondriell kvalitetskontroll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 &#181;g/mL stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>317275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free heat shock BSA powder</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM&#160;</td>
			<td>Thermofisher Scientific&#160;</td>
			<td>F24195</td>
			<td>100 &#956;g Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 &#956;L DMSO and 51 &#956;L Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MtPhagy dye</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>MT02-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>5 &#956;g MtPhagy powder reconstituted with 50 &#956;L DMSO to reach 100 &#956;M stock.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-88061</td>
			<td>TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 &#956;M stock.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementary approaches to interrogate mitophagy flux in pancreatic &#946;-cells

Mitofagi är en kvalitetskontrollmekanism som är nödvändig för att upprätthålla optimal mitokondriell funktion. Dysfunktionell β-cellig mitofagi resulterar i otillräcklig insulinfrisättning. Avancerade kvantitativa bedömningar av mitofagi kräver ofta användning av genetiska rapportörer. Musmodellen mt-Keima, som uttrycker en mitokondrieriktad pH-känslig dubbelexcitationskvotmetrisk sond för kvantifiering av mitofagi via flödescytometri, har optimerats i β-celler. Förhållandet mellan sura och neutrala mt-Keima-våglängdsutsläpp kan användas för att på ett robust sätt kvantifiera mitofagi. Att använda genetiska mitofagirapportörer kan dock vara utmanande när man arbetar med komplexa genetiska musmodeller eller svårtransfekterade celler, såsom primära mänskliga öar. Detta protokoll beskriver en ny komplementär färgämnesbaserad metod för att kvantifiera β-cellsmitofagi i primära öar med hjälp av MtPhagy. MtPhagy är ett pH-känsligt, cellgenomsläppligt färgämne som ackumuleras i mitokondrierna och ökar dess fluorescensintensitet när mitokondrier befinner sig i miljöer med lågt pH, såsom lysosomer under mitofagi. Genom att kombinera MtFagy-färgämnet med Fluozin-3-AM, en Zn2+ -indikator som selekterar för β-celler, och tetrametylrhodamin, etylester (TMRE) för att bedöma mitokondriell membranpotential, kan mitofagiskt flöde kvantifieras specifikt i β-celler via flödescytometri. Dessa två tillvägagångssätt är mycket komplementära, vilket möjliggör flexibilitet och precision vid bedömning av mitokondriell kvalitetskontroll i många β-cellsmodeller.

Pancreatic &#946;-cells produce and secrete insulin to meet metabolic demands, and &#946;-cell dysfunction is responsible for hyperglycemia and diabetes onset in both type 1 and type 2 diabetes. &#946;-Cells couple glucose metabolism with insulin secretion via mitochondrial energetics and metabolic output, which depend on a reserve of functional mitochondrial mass1,2,3. To maintain optimal &#946;-cell function, &#946;-cells rely on mitochondrial quality control mechanisms to remove aged or damaged mitochondria and preserve functional mitochondrial mass4. Selective mitochondrial autophagy, also known as mitophagy, is a key component of the mitochondrial quality control pathway.
Assessments of mitophagy in live cells often rely on changes in mitochondrial pH that occur during mitophagy. Mitochondria have a slightly alkaline pH, and healthy mitochondria normally reside in the pH-neutral cytosol. During mitophagy, damaged or dysfunctional mitochondria are selectively incorporated into autophagosomes and eventually cleared within acidic lysosomes5. Several in vivo transgenic mitophagy reporter mouse models, such as mt-Keima6, mitoQC7, and CMMR8, as well as transfectable mitophagy probes, such as the Cox8-EGFP-mCherry plasmid9, utilize this pH change to provide quantitative assessments of mitophagy. Use of transgenic mice expressing the mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe has been optimized for mitophagy assessments in islets and &#946;-cells via flow cytometry10,11. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions (the ratio of acidic 561 nm to neutral 480 nm excitation) can be used to robustly quantify mitophagy6,12.
This protocol describes an optimized approach to assess mitophagy flux in primary islets and &#946;-cells isolated from mt-Keima transgenic mice10,11. While mt-Keima is a highly sensitive probe, it requires either complicated animal breeding schemes or the transfection of cells, which can often be challenging when working in combination with other genetic models or with primary human islets. Additionally, the use of multiple fluorescence lasers and detectors to identify neutral and acidic cell populations can limit the combinatorial use of other fluorescent reporters.
To overcome these challenges, this protocol also describes a complementary, single fluorescent channel, dye-based method for robust detection of mitophagy in &#946;-cells from isolated mouse islets. This approach, referred to as the MtPhagy method, utilizes a combination of three cell-permeable dyes to select for &#946;-cells, quantify the cell populations actively undergoing mitophagy, and assess mitochondrial membrane potential (MMP or &#916;&#968;m) simultaneously.
The first of these dyes is Fluozin-3-AM, a cell-permeable Zn2+ indicator with an Ex/Em 494/516 nm13. Mouse islets comprise a heterogeneous population of functionally distinct cells, including &#945;-, &#946;-, &#948;-, and PP cells. &#946;-Cells comprise approximately 80% of cells within the mouse islet and can be distinguished from other islet cell types due to their high Zn2+ concentration within insulin granules14,15, allowing for identification of &#946;-cells as the Fluozin-3-AMhigh population. The MtPhagy dye, a pH-sensitive dye that is immobilized on mitochondria via a chemical bond and emits weak fluorescence, is also utilized in this protocol16. Upon mitophagy induction, damaged mitochondria are incorporated into the acidic lysosome, and the MtPhagy dye increases its fluorescence intensity within the low pH environment (Ex/Em 561/570-700 nm).
Additionally, Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), is used to assess MMP. TMRE is a cell-permeable positively charged dye (Ex/Em 552/575 nm) that is sequestered by healthy mitochondria due to the relative negative charge upheld by their membrane potential17. Damaged or unhealthy mitochondria dissipate their membrane potential, resulting in decreased ability to sequester TMRE. Utilizing these dyes together, &#946;-cells undergoing mitophagy can be identified as the FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population via flow cytometry. Since mitophagy is a dynamic rather than static process, this protocol was optimized to assess mitophagy flux using valinomycin, a K+-ionophore that induces mitophagy following dissipation of MMP18. Comparison of mitophagy in the presence and absence of valinomycin allows for assessment of mitophagy flux in different sample groups.
The dye-based nature of the current approach allows it to be extrapolated to human islets and other difficult-to-transfect cell types and circumvents the need for complicated animal breeding schemes, unlike the mt-Keima protocol. The overarching goal of this protocol is to quantify mitophagy in &#946;-cells at the single-cell level via two independent flow cytometry-based methods. Taken together, this protocol describes two powerful and complementary methods that allow for both precision and flexibility in the quantitative study of mitochondrial quality control.

Författare i fokus: Bedömning av mitofagiskt flöde i bukspottkörtelns β-celler med hjälp av effektiva och robusta komplementära metoder 

Kompletterande metoder för att undersöka mitofagiskt flöde i bukspottkörtelns β-celler

Our protocol describes two complementary methods to study beta-cell mitophagy flux at the single-cell resolution via flow cytometry. The mt-Keima protocol utilizes a genetic mitophagy reporter, whereas the MtPhagy protocol combines three fluorescent dyes, which makes it easy to extrapolate to difficult-to-transfect cells in human samples. Assessments of mitophagy using traditional biochemical approaches and imaging approaches are both time consuming and challenging.Thus, it's important to develop new, robust, and effective methods to study mitophagy flux in beta-cells. Both the mt-Keima and MtPhagy method are quantitative assessments that are efficient for studying mitophagy flux in pancreatic beta cells. So, the Soleimanpour lab focuses on the different mechanisms that drive pancreatic beta-cell failure and diabetes.And we specifically focus on the different aspects of mitochondrial lifecycle, including mitophagy, to understand how defects in mitochondrial function drive the development of diabetes.

Bedömning av mitofagi med hjälp av den färgämnesbaserade MtPhagy-metoden Detta färgämnesbaserade tillvägagångssätt optimerades för att analysera mitofagiskt flöde i primära β-celler hos möss utan behov av en genetisk rapportör, med hjälp av Fluozin-3-AM, TMRE och MtPhagy samt DAPI för att utesluta döda celler. Genom att para ihop dessa färgämnen med valinomycin för att inducera mitofagi beskriver detta protokoll en färgämnesbaserad metod för att selektivt mäta mitofagiskt flö...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic β-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches at JoVE.com

Detta protokoll beskriver två metoder för kvantitativ analys av mitofagi i bukspottkörtelns β-celler: för det första en kombination av cellpermeabla mitokondriespecifika färgämnen, och för det andra en genetiskt kodad mitofagireporter. Dessa två tekniker kompletterar varandra och kan användas baserat på specifika behov, vilket möjliggör flexibilitet och precision när det gäller att kvantitativt ta itu med mitokondriell kvalitetskontroll.

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Vårt protokoll beskriver två komplementära metoder för att studera beta-cells mitofagiflöde vid encellsupplösning via flödescytometri. Mt-Keima-protokollet använder en genetisk mitofagireporter, medan MtPhagy-protokollet kombinerar tre fluorescerande färgämnen, vilket gör det lätt att extrapolera till svårtransfekterade celler i mänskliga prover. Bedömningar av mitofagi med hjälp av traditionella biokemiska metoder och avbildningsmetoder är både tidskrävande och utmanande.Därför är det viktigt att utveckla nya, robusta och effektiva metoder för att studera mitofagiflödet i betaceller. Både mt-Keima- och MtPhagy-metoden är kvantitativa bedömningar som är effektiva för att studera mitofagiflöde i bukspottkörtelns betaceller. Soleimanpour-labbet fokuserar därför på de olika mekanismer som driver betacellssvikt i bukspottkörteln och diabetes.Och vi fokuserar specifikt på de olika aspekterna av mitokondriernas livscykel, inklusive mitofagi, för att förstå hur defekter i mitokondriell funktion driver utvecklingen av diabetes.

complementary-approaches-to-interrogate-mitophagy-flux-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Single-Cell Dissociation of Murine Islets for Flow Cytometric Analysis of &#946;-Cell Mitophagy

Begin by culturing the eyelet samples isolated from regular fat diet or high fat diet mice overnight at 37 degrees Celsius. Design the desired experimental conditions for the study. For each experimental condition, using a pipette, pick 100 eyelets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of eyelet medium.To induce Mitophagy, treat the eyelets in the appropriate Petri dishes with two microliters of 250 nano molar Valinomycin stock for three hours. Isolate the eyelets and using a pipette, transfer the eyelets from each Petri dish to a separate micro centrifuge tube. Then, spin the eyelets at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius and using a pipette, discard the supernatant.Wash the obtained sample twice with one milliliter of PBS. Between the washes, spin the sample and discard the supernatant as demonstrated previously. To dissociate eyelets into single cells, add 500 microliters of 0.05%Trypsin prewarmed to 37 degrees celsius, to one sample tube.Pipette the contents of the tube up and down repeatedly until the eyelets are visibly dispersed. Immediately add one milliliter of prewarmed eyelet medium to neutralize trypsin. Spin the samples at 500 G for five minutes at 10 degrees Celsius.Remove the supernatant carefully without disturbing the pellet. Then, wash the samples two times with eyelet flow medium. The cell samples are now ready to be stained for flow cytometric analysis of beta cell mitophagy.

Encellsdissociation av murina öar för flödescytometrisk analys av β-cellmitofagi

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using MtPhagy Dye

Proceed to perform flow cytometric analysis of beta cell mitophagy, with a single cell suspension of about 100 isolated mirroring islets prepared, corresponding to each desired experimental condition to be studied. First, resuspend the islet samples for each condition in 500 microliters of islet flow medium. Add 0.25 microliters of MtPhagy stock to tubes designated to receive the MtPhagy dye.Similarly, add 0.25 microliters of TMRE stock and fluozin-3-AM stock to the respective designated tubes. Wrap the tubes in aluminum foil and vortex each tube at low speed for five seconds to mix the contents. Then incubate the tubes at 37 degrees Celsius for 30 minutes.Halfway through incubation, vortex each sample at low speed for five to 10 seconds. After incubation, centrifuge the tubes at 350 G for one minute at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant.And resuspend the samples in 500 microliters of islet flow medium. Add DAPI to the microcentrifuge tubes containing samples that require DAPI treatment. Centrifuge again and discard the supernatant as demonstrated previously.Resuspend the residue in 500 microliters of islet flow medium. Finally, place the samples on ice and then proceed with flow cytometry. Adjust the voltages for forward scatter or FSC and side scatter or SSC to ensure cell populations are at the center of the scatter plot.To exclude multiplets, at a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSC width. Adjust voltages and compensation for DAPI to filter for live beta cells. Set fluorescence gates for each fluorophore used based on the unstained RFD sample.Once gates are established, collect 10, 000 events per sample. Beta cells with high utilization of mitophagy were defined as the fluozin high MtPhagy high TMRE low population in quadrant three or Q3.Basal and valinomycin-induced mitophagy levels were characterized in both RFD and HFD islets.

Flödescytometrisk analys av mitofagi i murina pankreas-β-celler med MtPhagy Dye

Flow Cytometric Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells Using the Genetically Encoded mt-Keima Reporter

To assess mitophagy in murine pancreatic beta cells using the genetically encoded mitophagy reporter, culture pancreatic islets isolated from wild type and Mt-Keima mice overnight at 37 degrees Celsius. The following day, add 100 islets into a six centimeter Petri dish containing two milliliters of islet medium for each experimental condition used in this protocol. Next, to dissociate the eyelets into single cells and stain with FluoZin-3-AM and DAPI as demonstrated previously for the Mt-Phagy dye based approach.Then proceed with the flow cytometric analysis of the samples. Adjust the forward scatter or FSC and side scatter or SSC voltages to attain an even distribution of cells on an SSCA versus FSCA plot. To select single cells and exclude multiplets, add a rectangular gate on FSC height versus FSC width, followed by SSC height versus SSE width.The multiplets are excluded due to their higher width signal values. Then set up a DAPI negative gate to exclude dead cells. After that, set up FluoZin-3-AM positive gates to filter for live beta cells.Set up a triangle gating scheme using the Mt-Keima positive sample to identify acidic and neutral cell populations. Once the primary and fluorescence gates were established, assess mitophagy flux using basal and valinomycin-induced changes in Mt-Keima fluorescence.