Name: تسليط الضوء على المؤلف: طريقة جديدة للتحليل الشامل لمكونات الخلايا لجلطات الدم الدماغية
Uploaded: 2023-07-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ، ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).

تم إجراء البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات الطبية بجامعة هواتشياو. تمت إزالة جلطات الدم الدماغية جراحيا وجمعها في مستشفى تشيوانتشو الأول ، التابع لجامعة فوجيان الطبية ، بموافقة مستنيرة من المرضى.
1. المعالجة المسبقة لجلطة الدم
<ol><li>ضع الجلطا...

طريقة قائمة على الإنزيم المحلل للفيبرين لدراسة مكونات خلايا الخثرة الدماغية

<ol>
	<li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edoxaban+versus+dual+antiplatelet+therapy+for+leaflet+thrombosis+and+cerebral+thromboembolism+after+TAVR:+The+ADAPT-TAVR+Randomized+clinical+trial.">Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial.</a> Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).</li><li>Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+venous+sinus+thrombosis+incidence+is+higher+than+previously+thought:+a+retrospective+population-based+study.">Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study.</a> Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).</li><li>Sacco, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+definition+of+stroke+for+the+21st+century:+a+statement+for+healthcare+professionals+from+the+American+Heart+Association/American+Stroke+Association.">An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association.</a> Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).</li><li>Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+villains+and+targets+in+arterial,+venous,+and+cancer-associated+thrombosis.">Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).</li><li>Mocsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity,+inflammation,+and+beyond.">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li><li>Dhanesha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKM2+promotes+neutrophil+activation+and+cerebral+thromboinflammation:+therapeutic+implications+for+ischemic+stroke.">PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke.</a> Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+neutrophil+extracellular+traps+content+impair+tpa-induced+thrombolysis+in+acute+ischemic+stroke.">Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li><li>Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+methodology+for+calculating+platelet+contribution+to+clot+strength+(platelet+component)+in+thromboelastometry+and+thrombelastography.">Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography.</a> Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).</li><li>Daraei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fiber+diameter+and+porosity+measurements+of+plasma+clots+in+scanning+electron+microscopy+images.">Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images.</a> Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).</li><li>Abbasi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+thrombus+composition+in+thrombectomy+stroke+patients+with+longer+time+to+recanalization.">Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization.</a> Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).</li><li>C W Francis, a., Marder, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+of+clot+lysis.">Concepts of clot lysis.</a> Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).</li><li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , (2019).</li><li>Fotso Fotso, A., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Diagnosis+of+tick-borne+african+relapsing+fevers:+latest+developments.">Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments.</a> Front Public Health. 3, 254 (2015).</li><li>Liou, G. Y., Byrd, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+bioliquid+markers+for+pancreatic+cancer:+What+we+have+vs.+what+we+need.">Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need.</a> Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).</li><li>Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+a+fibrinolytic+enzyme+from+Sipunculus+nudus.">Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus.</a> Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).</li><li>Ge, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+Nudus.">A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus.</a> International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).</li><li>Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+whole+cells+and+cell+debris+using+surface+plasmon+coupled+emission.">Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission.</a> Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).</li><li>Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+prescribing+for+adults+in+ambulatory++care+in+the+USA,+2007-09.">Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).</li></ol>

sFE هو عامل تحلل الفيبرين الذي يمكن أن يحلل الفيبرين مباشرة وفعالية12,16. هنا ، تم استخدام sFE لتحلل الفيبرين المتصالب للجلطات الدموية الدماغية ، وإطلاق الخلايا المغلقة داخل الجلطات ، وتحليل مكونات الخلية للجلطات نوعيا وكميا. أشارت بيانات الفحص المجهري وفحص ال?...

الأمراض الدماغية الوعائية هي واحدة من ثلاثة أمراض رئيسية يمكن أن تهدد صحة الإنسان ، من بينها الأمراض الدماغية الوعائية التي تمثل أكثر من 80 ٪. تجلط الدم الدماغي وتجلط الأوردة الدماغية هي أكثر الأمراض الدماغية الوعائية الإقفارية اليوم ، والتي تسببها بشكل رئيسي جلطات الدم الدماغية 1,2. إذا لم يتم العلاج بشكل صحيح ، فسيكون له معدلات عالية من الإعاقة والوفيات ومعدل تكرار مرتفع بعد الخروج3.
في الآونة الأخيرة ، أظهر عدد متزايد من الدراسات أن مكونات الخلايا في جلطات الدم الدماغية ترتبط ارتباطا وثيقا بتشخيص وعلاج وتشخيص تجلط الدم الدماغي4،5،6. لذلك ، فإن توافر البيانات حول تكوين الجلطة ، وخاصة مكونات الخلية ، مهم للتشخيص والعلاج السريري. لسوء الحظ ، لا يمكن للطرق المتاحة حاليا تحليل مكون جلطة الدم بشكل شامل كميا ونوعيا. على سبيل المثال ، يمكن للتلطيخ في الموقع القائم على Martius Scarlett Blue فقط دراسة خلايا الدم الحمراء / البيضاء لشرائح معينة من الجلطة7. يمكن للتلوين في الموقع القائم على الكيمياء المناعية (IHC) دراسة مكونات الدم المحدودة لشرائح معينة من الجلطة باستخدام أجسامهاالمضادة 8. تهتم الطرق المجهرية القائمة على الصور فقط بالبنية المحددة للجلطة9. علاوة على ذلك ، كل هذه الأساليب شاقة وتستغرق وقتاطويلا 10. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن إجراءات دراسة مكونات خلايا الجلطات الدماغية كميا ونوعيا. من المسلم به على نطاق واسع أن الفيبرين المتصالب يلف خلايا الدم بإحكام في الجلطات11. وبالتالي ، فإن التدهور المحدد للفيبرين المتصالب وإطلاق الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق لمكونات الخلية.
قامت الأعمال السابقة بعزل إنزيم محلل للفبرين من Sipunculus nudus (sFE) ، والذي يمكن أن يتحلل الفيبرين على وجه التحديد وبسرعة12. هنا ، تم اقتراح طريقة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدماغية بناء على النشاط الفريد ل sFE. استخدم هذا البروتوكول sFE لتحلل الفيبرين من الجلطات أولا ثم تحليل مكونات الخلية عن طريق تلطيخ رايت وفحص الدمالروتيني 13،14. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية من الجلطات الدموية الدماغية كميا ونوعيا. يمكن تطبيق هذا البروتوكول البسيط والفعال لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agglutination Reaction Plate</td>
			<td>ROTEST</td>
			<td>RTB-4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Hematology Analyzer</td>
			<td>SYSMEX</td>
			<td>XNB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer&#160;</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MLS-3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>AIRTECH</td>
			<td>BLB-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td>JHS-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (100 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHG Series Heating and Drying Oven&#160;</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td>DGG-9140AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td>TP-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Membrane (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td>SLGP033NK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Refrigerated Centrifuge&#160;</td>
			<td>Cence</td>
			<td>H1650-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>01-30253-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z00QSV0CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>CISEN</td>
			<td>H37022337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE E100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0221A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (1 mL )</td>
			<td>Axygene</td>
			<td>T-1000XT-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td>T-200XT-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZY18723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ZY20280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>MARTOR</td>
			<td>23111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small-sized Vortex Oscillator</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>VORTEX KB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Hystic</td>
			<td>HKQS-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright Staining Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots

الجلطة الدماغية ، وهي جلطة دموية في الشريان أو الوريد الدماغي ، هي أكثر أنواع الاحتشاء الدماغي شيوعا. دراسة مكونات الخلية من جلطات الدم الدماغية مهمة للتشخيص والعلاج والتشخيص. ومع ذلك ، فإن الأساليب الحالية لدراسة مكونات الخلية في الجلطات تعتمد بشكل أساسي على التلوين في الموقع ، وهو أمر غير مناسب للدراسة الشاملة لمكونات الخلية لأن الخلايا ملفوفة بإحكام في الجلطات. نجحت الدراسات السابقة في عزل إنزيم محلل للفبرين (sFE) من Sipunculus nudus ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تحلل الفيبرين المتصالب مباشرة ، وإطلاق مكونات الخلية. أنشأت هذه الدراسة طريقة شاملة تعتمد على sFE لدراسة مكونات الخلية في الخثرة الدماغية. يتضمن هذا البروتوكول إذابة الجلطة ، وإطلاق الخلايا ، وتلطيخ الخلايا ، وفحص الدم الروتيني. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية كميا ونوعيا. يتم عرض النتائج التمثيلية للتجارب باستخدام هذه الطريقة.

Cerebrovascular disease is one of three major diseases that can threaten human health, among which ischemic cerebrovascular disease accounts for more than 80%. Cerebral thrombosis and cerebral vein thrombosis are the most concerned ischemic cerebrovascular diseases today, mainly caused by cerebral blood clots1,2. If the treatment is not done properly, it will have high disability and mortality rates and a high recurrence rate after discharge3.
Recently, a growing number of studies have shown that the cell components of cerebral blood clots are tightly correlated with the diagnosis, treatment, and prognosis of cerebral thrombosis4,5,6. Therefore, the availability of data on thrombus composition, especially the cell components, is important for clinical diagnosis and treatment. Unfortunately, the currently available methods cannot comprehensively analyze the blood clot component quantitatively and qualitatively. For example, Martius Scarlett Blue based in-situ staining can only study the red/white blood cells of certain slices of the clot7. Immunohistochemistry (IHC) based in-situ staining can only study limited blood components of certain slices of the clot using their antibodies8. The microscopic image-based methods are only concerned with the specific structure of the clot9. Moreover, all those methods are laborious and time-consuming10. To date, the procedures for quantitatively and qualitatively studying cerebral thrombi cell components have not been reported. It is widely acknowledged that the cross-linked fibrin tightly wraps the blood cells in the clots11. Consequently, the specific degradation of the cross-linked fibrin and release of the intact cells is critical for the accurate analysis of cell components.
Previous works isolated a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE), which can degrade the fibrin specifically and quickly12. Herein, a method for analyzing the cell components of the cerebral thrombi based on the unique activity of sFE was proposed. This protocol utilized sFE to degrade the fibrin of clots first and then analyzed the cell components by Wright&#39;s Staining and routine blood examination13,14. According to this method, the cell components of cerebral thrombi can be quantitatively and qualitatively studied. This simple and effective protocol might be applied for the cell component analysis of other blood clots.

تسليط الضوء على المؤلف: طريقة جديدة للتحليل الشامل لمكونات الخلايا لجلطات الدم الدماغية 

نهج شامل لتحليل مكونات الخلايا من جلطات الدم الدماغية

Our research mainly focuses on cerebral thrombosis. Many studies have shown that cerebral blood clot cell component correlate with the diagnosis, treatment, and prognosis of cerebral thrombosis. In this study, we established a novel method for the analysis of cell component of cerebral blood clots.This challenge in analyzing cell components of cerebral blood clots is the release of entire shaft from blood clots. This is because the clots leaked fibering tiry rash, the blood cells in the clots. Targeted approaches to starting the cell components of the clots are best done in C2 standing, which is unsuitable for the comprehensive starting of the cell components.On the contrary, our method enables both quantitative and qualitative enlightenings of the cerebral slope cell components. Our method utilizes fibrinolytic enzyme to delay the fibering in blood clots, releasing the intact cells. The data obtained from the analysis of the cell components will facilitate the study of the mechanisms of cerebral thrombosis at a molecular level.Our team will continue to focus on the study of fibrinolysis and coagulation system.

في المرحلة الأولى من عملية التحلل ، وجد أن جلطات الدم لها بنية مدمجة حمراء ، وأن محلول العمل كان عديم اللون. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، تحول محلول العمل إلى اللون الأحمر الفاتح ، مما يشير إلى إطلاق خلايا الدم المتقاطعة في محلول العمل. تم إذابة معظم الجلطات عند إطالة وقت الحضانة إلى 5 ساعات ، ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Method for Comprehensive Cell Component Analysis of Cerebral Blood Clots at JoVE.com

تصف هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الدماغية من خلال إذابة الجلطة وتلطيخ الخلايا وفحص الدم الروتيني.

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of ...

يركز بحثنا بشكل أساسي على الجلطة الدماغية. أظهرت العديد من الدراسات أن مكون خلايا الجلطة الدموية الدماغية يرتبط بتشخيص وعلاج وتشخيص تجلط الدم الدماغي. في هذه الدراسة ، أنشأنا طريقة جديدة لتحليل مكون الخلية من جلطات الدم الدماغية.هذا التحدي في تحليل مكونات الخلايا من جلطات الدم الدماغية هو إطلاق عمود كامل من جلطات الدم. وذلك لأن الجلطات تسربت من الطفح الجلدي المتعب الليفي ، وخلايا الدم في الجلطات. من الأفضل القيام بالطرق المستهدفة لبدء مكونات الخلية للجلطات في وضع C2 ، وهو أمر غير مناسب لبدء التشغيل الشامل لمكونات الخلية.على العكس من ذلك ، تتيح طريقتنا التنوير الكمي والنوعي لمكونات الخلايا المنحدرة الدماغية. تستخدم طريقتنا الإنزيم المحلل للفبرين لتأخير الألياف في جلطات الدم ، وإطلاق الخلايا السليمة. البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل مكونات الخلية ستسهل دراسة آليات تجلط الدم الدماغي على المستوى الجزيئي.سيواصل فريقنا التركيز على دراسة انحلال الفيبرين ونظام التخثر.

a-comprehensive-approach-to-analyze-cell-components-cerebral-blood

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots

Cerebral thrombosis, a blood clot in a cerebral artery or vein, is the most common type of cerebral infarction. The study of the cell components of cerebral blood clots is important for diagnosis, treatment, and prognosis. However, the current approaches to studying the cell components of the clots are mainly based on in situ staining, which is unsuitable for the comprehensive study of the cell components because cells are tightly wrapped in the clots. Previous studies have successfully isolated a fibrinolytic enzyme (sFE) from Sipunculus nudus, which can degrade the cross-linked fibrin directly, releasing the cell components. This study established a comprehensive method based on the sFE to study the cell components of cerebral thrombus. This protocol includes clot dissolving, cell releasing, cell staining, and routine blood examination. According to this method, the cell components could be studied quantitatively and qualitatively. The representative results of experiments using this method are shown.

This study describes a fast and effective method for the cell component analysis of cerebral blood clots through clot dissolving, cell staining, and routine blood examination.

Cerebral Thrombus Clot Dissolution and Cell Staining for Cell Component Analyses

To begin, place the collected cerebral blood clot samples on a clean dish using tweezers. Then, using a pipette, add five milliliters of physiological saline to it and gently shake the dish. Remove the saline using a pipette.Using a pair of scissors, chop the clots into small pieces. Once again, add five milliliters of physiological saline to the clots and shake the dish gently before aspirating the saline with a pipette. Then, using tweezers, transfer the pieces of clots to a new, clean U-plate.Prepare the SFE working solution by adjusting the concentration of SFE to 2, 000 units per milliliter using physiological saline. Add 300 microliters of the SFE working solution to the pretreated clots. To initiate the first round of degradation, incubate the mixture of SFE and clots at 37 degrees Celsius for half an hour.After that, gently shake to mix the SFE treated sample. And using a clean pipette, transfer the liquid portion to a sterile tube. Set aside the remaining clot for another round of degradation.Centrifuge the collected liquid at 200 G for five minutes at four degrees Celsius. Next, using a pipette, transfer the supernatant or the recovered SFE solution to another clean tube. Resuspend the resultant cell pellet in 50 microliters of physiological saline by gentle mixing.After this, perform subsequent rounds of degradation on the remaining clots using the recovered SFE solution as demonstrated previously. Gather the cell mixture from each round of degradation to prepare the blood cell sample. Add five microliters of the obtained cell sample to the poly-L-lysine-coated glass slide.And using a cover slip, smear the cells. Allow the liquid to evaporate at room temperature. To perform cell staining, gently add 100 microliters of rights dye to the cell smear.Allow the cells to stain for 30 minutes at room temperature before gently rinsing the dye off with clean water. Finally, examine the stained cells using a light microscope. Compact red blood clots with a colorless working solution were observed during the early stage of degradation.Clot dissolution was observed after a 30-minute incubation and a prolonged incubation of up to five hours dissolved most clots, while there was no significant change in the negative control group, even after a 10-hour incubation. After a right staining, mature red blood cells, platelets, and various granulocytes were clearly identifiable under a light microscope. The cell components could be quantitatively analyzed with the aid of autohematology successfully.