Name: تسليط الضوء على المؤلف: استخراج غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا لتسهيل أبحاث توصيل الأدوية في الأذن الداخلية
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح NIDCD رقم 1K08DC020780 و 5T32DC000027-33 ، وصندوق روبنشتاين لأبحاث السمع.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (GP18M226). تم استخدام خنازير غينيا Hartley albino (ذكورا وإناثا ، تزن 500-700 جم) في هذه الدراسة.
1. إعداد الإجراء وإعداده
<ol><li>تعقيم جميع الأدوات بأكسيد الإيثيلين قبل بدء التجربة.</li>
	<li>القتل الرحي?...

خنزير غينيا جولة نافذة غشاء الزرع

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

في توصيل الدواء المحلي إلى الأذن ، يعد RWM هو الطريق الرئيسي لمرور العلاجات للوصول إلى الأذن الداخلية. هناك حاجة إلى نموذج دقيق وموثوق به على الطاولة لفهم آليات النقل والنفاذية بشكل أفضل عبر مركبات التسليم الجديدة ولتطوير الأدوية. في هذه الدراسة ، أثبتنا أن زراعة خنزير غينيا RWM هو إجراء ممك?...

ظهرت فئات جديدة من العلاجات لعلاج فقدان السمع الحسي العصبي. إن ترجمة هذه العلاجات إلى المجموعات السريرية محدودة بطرق النقل الآمنة والفعالة إلى الأذن الداخلية. تعتمد الطرق الحالية للتسليم في الجسم الحي في الدراسات التي أجريت على إما على التكاثر في الأذن الداخلية أو الانتشار من خلال غشاء النافذة المستديرة (RWM) ، وهو حاجز غير عظمي يفصل مساحة الأذن الوسطى عن القوقعة1.
يعتبر الحقن الجراحي والحقن المجهري في الأذن الداخلية غازيين ويمكن أن يشكلان مخاطر على وظيفة الأذن الداخلية المتبقية2. لذلك ، يعد RWM طريقا مهما لتوصيل الأدوية المحلية ، وخنازير غينيا هي النموذج الحيواني الأساسي قبل السريري المستخدم لدراسة الحرائك الدوائية الدوائية المحلية عبر RWM وفي الأذن الداخلية لتطوير الأدوية 3,4. على الرغم من أنه أرق من RWM البشري ، إلا أن خنزير غينيا RWM يشترك في بنية متطابقة ثلاثية الطبقات. يبلغ قطرها حوالي 1 مم ، وسمكها 15-25 ميكرومتر ، وتتألف من طبقتين من الخلايا الظهارية التي تحيط بطبقة النسيج الضام5. الطبقة الظهارية التي تواجه الأذن الوسطى مكتظة بكثافة ومتصلة عبر تقاطعات ضيقة ، في حين أن الطبقة التي تواجه الأذن الداخلية و scala tympani لها بنية أكثر مرونة وليس لها التصاقات كبيرة بين الخلايا.
تعتمد الدراسات قبل السريرية الحالية التي تبحث في نفاذية الدواء في خنزير غينيا RWM على حقن الأذن الوسطى في الجسم الحي متبوعة بأخذ عينات من السائل المحيط بالأذن داخل الأذن الداخلية ، مما لا يسمح بإجراء دراسة محددة لنقل RWM 6,7. تم استخدام شظايا نباتات RWM في الدراسات قبل السريرية ، ولكن نظرا لهشاشتها وصغر حجمها ، فهي غير مناسبة للتحقيقات المنهجية والدقيقة لنقل الأدوية والمركبات التي تتطلب ختما مانعا للماء عبر RWM2. استخدمت مجموعات أخرى نماذج في المختبر مع خلايا ظهارية بشرية مستزرعة لتقريب RWM8،9،10. ومع ذلك ، فإن غالبية هذه التركيبات تركز فقط على الطبقة الظهارية الخارجية ولا تلتقط تعقيد بنية الأنسجة الأصلية. من أجل فهم أكثر تفصيلا لآليات النقل عبر RWM ، يلزم إجراء دراسات مستهدفة خارج الجسم الحي.
في هذه الدراسة ، نوضح زرع خنزير غينيا RWM مع الدعم العظمي المحيط للحفاظ على سلامة الغشاء وتوضيح استخدامها في نموذج تجريبي مصمم لدراسة محددة لنقل RWM لمركبات توصيل المخدرات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

يمثل توصيل الدواء الفعال والأقل بضعا إلى الأذن الداخلية تحديا كبيرا. أصبح غشاء النافذة المستديرة (RWM) ، كونه أحد نقاط الدخول القليلة إلى الأذن الداخلية ، محورا حيويا للتحقيق. ومع ذلك ، نظرا لتعقيدات عزل RWM ، يظل فهمنا لحركيتها الدوائية محدودا. يتكون RWM من ثلاث طبقات متميزة: الظهارة الخارجية ، وطبقة النسيج الضام الأوسط ، والطبقة الظهارية الداخلية ، ولكل منها خصائص توصيل فريدة.
تستخدم النماذج الحالية للتحقيق في النقل عبر RWM نماذج حيوانية في الجسم الحي أو نماذج RWM خارج الجسم الحي تعتمد على مزارع الخلايا أو شظايا الغشاء. تعمل خنازير غينيا كنموذج قبل سريري معتمد لفحص الحرائك الدوائية داخل الأذن الداخلية وهي نموذج حيواني مهم للتطوير الانتقالي لمركبات التوصيل إلى القوقعة. في هذه الدراسة ، وصفنا نهجا لزرع خنزير غينيا RWM مع عظم القوقعة المحيط لتجارب توصيل الأدوية الموضوعة على الطاولة. تسمح هذه الطريقة بالحفاظ على بنية RWM الأصلية وقد توفر تمثيلا أكثر واقعية للحواجز أمام النقل من نماذج الطاولة الحالية.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

تسليط الضوء على المؤلف: استخراج غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا لتسهيل أبحاث توصيل الأدوية في الأذن الداخلية

خنزير غينيا جولة نافذة غشاء الزرع للدراسات خارج الجسم الحي

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

كما هو موضح في الشكل 3 أ ، تسمح هذه الطريقة بزرع غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا السليم بحلقة محيطة من العظم الصلب. يجب أن تكون RWM متصلة بالكامل بالحلقة العظمية محيطيا. لا ينبغي تقدير أي كسور في عظم القوقعة. بالمقارنة مع عينات النوافذ المستديرة البشرية ، لا يحتوي خنزير غ?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

يحدد هذا البروتوكول طريقة لزرع غشاء النافذة المستديرة من عظام خنزير غينيا الصدغية ، مما يوفر موردا قيما للدراسات خارج الجسم الحي .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

تقوم مجموعتنا بالتحقيق في الأدوية ووسائل توصيل الأدوية لعلاج أمراض الأذن الداخلية مثل فقدان السمع. غشاء النافذة المستديرة هو الحاجز الحرج الذي يمنع الأدوية المطبقة محليا من الدخول إلى القوقعة ونحن نعمل حاليا على فهم كيفية تصميم مركبات توصيل الجسيمات النانوية للمرور عبر هذا الحاجز. إن فهم كيفية عمل غشاء النافذة المستديرة من حيث نقل الدواء أمر بالغ الأهمية في تطوير استراتيجيات فعالة لتوصيل الدواء إلى الأذن.خنزير غينيا هو نموذج حيواني مهم قبل السريري لدراسة توصيل الدواء إلى الأذن. ومع ذلك ، فإن عزل هذا الغشاء الهش ، الذي يبلغ سمكه 17 ميكرون فقط ، لدراسات نقل الأدوية لا يزال يمثل تحديا كبيرا. هنا ، نصف طريقة لاستخراج غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا الذي يسمح بإجراء دراسات فعالة لنقل الأدوية على مقاعد البدلاء.تعتمد التحقيقات الحالية لتوصيل الدواء إلى السنة الداخلية بشكل أساسي على النماذج التجريبية في الجسم الحي تليها أخذ العينات حول الليمفاوية التي لا تسمح بدراسة محددة ومستهدفة لآليات نقل غشاء النافذة المستديرة. في هذه الدراسة ، نوضح استخراج غشاء النافذة المستديرة لخنزير غينيا مع الدعم العظمي المحيط. تحافظ هذه الطريقة على سلامة بنية الأنسجة الأصلية وتسمح بإجراء دراسات دقيقة ومستهدفة لتوصيل الدواء عبر غشاء النافذة المستديرة.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.