Name: Forfatter Spotlight: Ekstraktion af marsvin rund vinduesmembran for at lette forskning i lægemiddellevering i det indre øre
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af NIDCD Grants No. 1K08DC020780 og 5T32DC000027-33 og Rubenstein Hearing Research Fund.

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albino marsvin (både mandlige og kvindelige, vejer 500-700 g) blev anvendt i denne undersøgelse.
1. Opsætning og forberedelse af procedure
<ol><li>Steriliser alle instrumenter med ethylenoxid, inden eksperimentet påbegyndes.</li>
	<li>Aflive dyrene efter den institutionelt godkendte protokol. BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev der anvendt et ikke-opladet kammer ti...

Marsvin rund vinduesmembran eksplantation

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

I lokal lægemiddelafgivelse til øret er RWM den primære passage for terapi for at nå det indre øre. Der er behov for en nøjagtig og pålidelig bordmodel for bedre at forstå transportmekanismer og permeabilitet på tværs af nye leveringskøretøjer og til lægemiddeludvikling. I denne undersøgelse viser vi, at marsvin RWM-eksplantation er en gennemførlig og pålidelig procedure for at muliggøre systematiske undersøgelser af lægemiddelmembraninteraktioner. Lundman et al. og Kelso et al. tidligere beskrevet ved...

Nye klasser af terapi er opstået til behandling af sensorineuralt høretab. Oversættelsen af disse lægemidler til kliniske populationer er begrænset af sikre og effektive transportveje ind i det indre øre. Nuværende metoder til in vivo-levering i dyreforsøg er afhængige af enten fenestration i det indre øre eller diffusion gennem den runde vinduesmembran (RWM), en ikke-osseøs barriere, der adskiller mellemørerummet fra cochlea1.
Kirurgisk fenestrering og mikroinjektion i det indre øre er begge invasive og kan udgøre en risiko for resterende indre ørefunktion2. Derfor er RWM en vigtig vej for lokal lægemiddelafgivelse, og marsvin er den primære prækliniske dyremodel, der bruges til at studere lokal lægemiddelfarmakokinetik på tværs af RWM og i det indre øre til farmaceutisk udvikling 3,4. Selvom tyndere end den menneskelige RWM, deler marsvinet RWM en identisk trelags struktur. Den er ca. 1 mm i diameter, 15-25 μm tyk og består af to epitelcellelag, der sandwicher et bindevævslag5. Epitellaget, der vender mod mellemøret, er tæt pakket og forbundet via stramme kryds, mens laget, der vender mod det indre øre og scala tympani, har løsere arkitektur og ikke har signifikante intercellulære adhæsioner.
Aktuelle prækliniske undersøgelser, der undersøger lægemiddelpermeabilitet hos marsvin RWM, er afhængige af in vivo-mellemøreinjektioner efterfulgt af prøveudtagning af perilymfevæsken i det indre øre, hvilket ikke muliggør den specifikke undersøgelse af RWM-transport 6,7. Fragmenter af RWM-eksplantater er blevet anvendt i prækliniske undersøgelser, men på grund af deres skrøbelighed og lille størrelse er de ikke egnede til systematiske, mikrofluidiske undersøgelser af lægemiddel- og køretøjstransport, der kræver en vandtæt forsegling over RWM2. Andre grupper har anvendt in vitro-modeller med dyrkede humane epitelceller for at tilnærme RWM 8,9,10. Imidlertid fokuserer størstedelen af disse konstruktioner udelukkende på det ydre epitellag og fanger ikke kompleksiteten af native vævsarkitektur. For at opnå en mere detaljeret forståelse af transportmekanismerne på tværs af RWM er der behov for målrettede ex vivo-undersøgelser.
I denne undersøgelse demonstrerer vi eksplantationen af et marsvin RWM med omgivende knoglestøtte for at bevare membranintegritet og illustrere deres anvendelse i et eksperimentelt paradigme designet til den specifikke undersøgelse af RWM-transport af lægemiddelleveringskøretøjer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

Effektiv og minimalt invasiv lægemiddeltilførsel til det indre øre er en betydelig udfordring. Den runde vinduesmembran (RWM), der er et af de få indgangspunkter til det indre øre, er blevet et vigtigt fokus for undersøgelse. På grund af kompleksiteten ved at isolere RWM er vores forståelse af dens farmakokinetik imidlertid fortsat begrænset. RWM består af tre forskellige lag: det ydre epitel, det midterste bindevævslag og det indre epitellag, der hver især potentielt har unikke leveringsegenskaber.
Nuværende modeller til undersøgelse af transport over RWM bruger in vivo dyremodeller eller ex vivo RWM-modeller, der er afhængige af cellekulturer eller membranfragmenter. Marsvin fungerer som en valideret præklinisk model til undersøgelse af lægemidlers farmakokinetik i det indre øre og er en vigtig dyremodel for translationel udvikling af leveringskøretøjer til cochlea. I denne undersøgelse beskriver vi en tilgang til eksplantation af et marsvin RWM med omgivende cochlear knogle til benchtop drug delivery eksperimenter. Denne metode giver mulighed for at bevare oprindelig RWM-arkitektur og kan give en mere realistisk repræsentation af transportbarrierer end nuværende stationære modeller.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Forfatter Spotlight: Ekstraktion af marsvin rund vinduesmembran for at lette forskning i lægemiddellevering i det indre øre

Marsvins rundvinduesmembran til ex vivo-undersøgelser

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Som vist i figur 3A giver denne metode mulighed for eksplantation af den intakte marsvinrunde vinduesmembran med en omgivende ring af stiv knogle. RWM skal være fuldt forbundet med knogleannulusomkredsen. Ingen brud på cochlear knoglen bør værdsættes. I sammenligning med humane runde vinduesprøver har marsvin RWM ikke en overliggende pseudomembran. Derudover er der i modsætning til mennesker en knoglebro mellem marsvinets hæfters crura, som kræver brud og fjernelse inden ekstraktion...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Denne protokol skitserer en metode til eksplantation af den runde vinduesmembran fra marsvins temporale knogler, hvilket giver en værdifuld ressource til ex vivo-undersøgelser .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Vores gruppe undersøger lægemidler og lægemiddelafgivelseskøretøjer til behandling af indre øresygdomme såsom høretab. Den runde vinduesmembran er den kritiske barriere, der forhindrer lokalt anvendte lægemidler i at komme ind i cochlea, og vi arbejder i øjeblikket på at forstå, hvordan nanopartikelleveringskøretøjer kan konstrueres til at passere gennem denne barriere. At forstå, hvordan den runde vinduesmembran fungerer med hensyn til lægemiddeltransport, er afgørende for at udvikle effektive lægemiddelleveringsstrategier til øret.Marsvin er en vigtig præklinisk dyremodel til undersøgelse af lægemiddelafgivelse til øret. Imidlertid er isolering af denne skrøbelige membran, som kun er 17 mikron tyk, til lægemiddeltransportundersøgelser fortsat en betydelig udfordring. Her beskriver vi en metode til ekstraktion af marsvinets runde vinduesmembran, der muliggør effektive undersøgelser af lægemiddeltransport på bænken.Nuværende undersøgelser af lægemiddelafgivelse til det indre år er primært baseret på in vivo eksperimentelle modeller efterfulgt af perilymfeprøvetagning, som ikke muliggør en specifik og målrettet undersøgelse af runde vinduesmembrantransportmekanismer. I dette studie demonstrerer vi ekstraktionen af marsvinets runde vinduesmembran med omgivende knoglestøtte. Denne metode bevarer integriteten af den oprindelige vævsarkitektur og giver mulighed for præcise og målrettede undersøgelser af lægemiddelafgivelse over den runde vinduesmembran.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.