Name: Auteur in de schijnwerpers: extractie van rond venstermembraan voor cavia's om onderzoek naar medicijnafgifte in het binnenoor te vergemakkelijken
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIDCD-subsidies nr. 1K08DC020780 en 5T32DC000027-33, en het Rubenstein Hearing Research Fund.

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albino cavia's (zowel mannetje als vrouwtje, met een gewicht van 500-700 g) werden gebruikt in de huidige studie.
1. Opzet en voorbereiding van de procedure
<ol><li>Steriliseer alle instrumenten met ethyleenoxide voordat u met het experiment begint.</li>
	<li>Euthanaseer de dieren volgens het institutioneel goedgekeurde protocol. OPMERKING: In de huidige studie werd e...

Cavia Ronde Venster Membraan Transplantatie

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

Bij lokale medicijnafgifte aan het oor is de RWM de primaire doorgangsroute voor therapieën om het binnenoor te bereiken. Een nauwkeurig en betrouwbaar benchtop-model is nodig om transportmechanismen en permeabiliteit tussen nieuwe leveringsvoertuigen en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen beter te begrijpen. In deze studie tonen we aan dat RWM-explantatie bij cavia's een haalbare en betrouwbare procedure is om systematisch onderzoek naar geneesmiddel-membraaninteracties mogelijk te maken. Lundman et al. en Kelso et...

Er zijn nieuwe klassen van therapieën ontstaan voor de behandeling van perceptief gehoorverlies. De vertaling van deze therapieën naar klinische populaties wordt beperkt door veilige en effectieve transportroutes naar het binnenoor. De huidige methoden voor in vivo toediening in dierstudies zijn gebaseerd op fenestratie in het binnenoor of diffusie door het ronde venstermembraan (RWM), een niet-botvormige barrière die de middenoorruimte scheidt van het slakkenhuis.
Chirurgische fenestratie en micro-injectie in het binnenoor zijn beide invasief en kunnen risico's opleveren voor de resterende binnenoorfunctie2. Daarom is de RWM een belangrijke route voor lokale medicijnafgifte, en cavia's zijn het primaire preklinische diermodel dat wordt gebruikt om de lokale farmacokinetiek van geneesmiddelen in de RWM en in het binnenoor te bestuderen voor farmaceutische ontwikkeling 3,4. Hoewel dunner dan de menselijke RWM, deelt de cavia RWM een identieke drielaagse structuur. Het heeft een diameter van ongeveer 1 mm, is 15-25 μm dik en bestaat uit twee epitheelcellagen die een bindweefsellaag5 omklemmen. De epitheellaag die naar het middenoor is gericht, is dicht opeengepakt en verbonden via krappe verbindingen, terwijl de laag die naar het binnenoor en de scala tympani is gericht, een lossere architectuur heeft en geen significante intercellulaire verklevingen heeft.
Huidige preklinische studies naar de permeabiliteit van geneesmiddelen bij de cavia RWM zijn gebaseerd op in-vivo-injecties in het middenoor, gevolgd door de bemonstering van het perilymfevocht in het binnenoor, waardoor de specifieke studie van RWM-transport niet mogelijk is 6,7. Fragmenten van RWM-explantaten zijn gebruikt in preklinische studies, maar vanwege hun kwetsbaarheid en kleine formaat zijn ze niet geschikt voor systematisch, microfluïdisch onderzoek van het transport van geneesmiddelen en voertuigen waarvoor een waterdichte afsluiting over de RWM2 nodig is. Andere groepen hebben in vitro modellen met gekweekte menselijke epitheelcellen gebruikt om de RWM 8,9,10 te benaderen. De meeste van deze constructen richten zich echter uitsluitend op de buitenste epitheellaag en leggen de complexiteit van de oorspronkelijke weefselarchitectuur niet vast. Voor een gedetailleerder inzicht in de transportmechanismen in het RWM zijn gerichte, ex vivo studies nodig.
In deze studie demonstreren we de explantatie van een RWM van een cavia met omringende benige ondersteuning om de integriteit van het membraan te behouden en illustreren we hun gebruik in een experimenteel paradigma dat is ontworpen voor de specifieke studie van het RWM-transport van voertuigen voor medicijnafgifte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

Efficiënte en minimaal invasieve medicijnafgifte aan het binnenoor is een grote uitdaging. Het ronde raammembraan (RWM), een van de weinige toegangspunten tot het binnenoor, is een essentieel aandachtspunt van onderzoek geworden. Vanwege de complexiteit van het isoleren van de RWM blijft ons begrip van de farmacokinetiek ervan echter beperkt. De RWM bestaat uit drie verschillende lagen: het buitenste epitheel, de middelste bindweefsellaag en de binnenste epitheellaag, die elk potentieel unieke afgifte-eigenschappen hebben.
De huidige modellen voor het onderzoeken van transport over de RWM maken gebruik van in vivo diermodellen of ex vivo RWM-modellen die gebaseerd zijn op celculturen of membraanfragmenten. Cavia's dienen als een gevalideerd preklinisch model voor het onderzoek naar de farmacokinetiek van geneesmiddelen in het binnenoor en zijn een belangrijk diermodel voor de translationele ontwikkeling van toedieningsvoertuigen aan het slakkenhuis. In deze studie beschrijven we een aanpak voor explantatie van een cavia RWM met omringend cochleair bot voor benchtop medicijnafgifte-experimenten. Deze methode maakt het mogelijk om de oorspronkelijke RWM-architectuur te behouden en kan een realistischere weergave geven van transportbarrières dan de huidige benchtop-modellen.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Auteur in de schijnwerpers: extractie van rond venstermembraan voor cavia's om onderzoek naar medicijnafgifte in het binnenoor te vergemakkelijken

Membraanexplantatie van cavia's met rond venster voor ex vivo-onderzoek

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Zoals aangetoond in figuur 3A, maakt deze methode het mogelijk om het intacte ronde venstermembraan van cavia's met een omringende ring van stijf bot te explanteren. De RWM moet volledig verbonden zijn met de benige annulus in de omtrek. Er mogen geen fracturen van het cochleaire bot worden gewaardeerd. In vergelijking met menselijke exemplaren met ronde vensters heeft cavia RWM geen bovenliggend pseudomembraan. Bovendien is er, in tegenstelling tot mensen, een benige brug tussen de crura va...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Dit protocol schetst een methode voor de explantatie van het ronde venstermembraan uit slaapbeenderen van cavia's, wat een waardevolle bron is voor ex vivo-studies .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Onze groep onderzoekt medicijnen en voertuigen voor medicijnafgifte voor de behandeling van aandoeningen van het binnenoor, zoals gehoorverlies. Het ronde raammembraan is de kritische barrière die voorkomt dat lokaal aangebrachte medicijnen in het slakkenhuis terechtkomen en we werken er momenteel aan om te begrijpen hoe voertuigen voor de levering van nanodeeltjes kunnen worden ontworpen om door deze barrière te gaan. Begrijpen hoe het ronde venstermembraan werkt in termen van medicijntransport is cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve strategieën voor medicijnafgifte aan het oor.Cavia is een belangrijk preklinisch diermodel voor het bestuderen van medicijnafgifte aan het oor. Het isoleren van dit fragiele membraan, dat slechts 17 micron dik is, voor studies naar het transport van geneesmiddelen blijft echter een grote uitdaging. Hier beschrijven we een methode voor het extraheren van het ronde venstermembraan van de cavia dat efficiënte onderzoeken naar het transport van geneesmiddelen op de bank mogelijk maakt.Huidig onderzoek naar de toediening van geneesmiddelen aan het binnenste jaar is voornamelijk gebaseerd op in vivo experimentele modellen, gevolgd door perilymfebemonstering, die geen specifieke en gerichte studie van transportmechanismen voor ronde venstermembranen mogelijk maken. In deze studie demonstreren we de extractie van het ronde venstermembraan van de cavia met omringende benige ondersteuning. Deze methode behoudt de integriteit van de oorspronkelijke weefselarchitectuur en maakt nauwkeurige en gerichte studies mogelijk van de toediening van geneesmiddelen over het ronde venstermembraan.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.