Name: Pleins feux sur l’auteur : Extraction de la membrane de fenêtre ronde d’un cobaye pour faciliter la recherche sur l’administration de médicaments dans l’oreille interne
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par les subventions NIDCD n° 1K08DC020780 et 5T32DC000027-33, et le Fonds de recherche sur l’audition Rubenstein.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (GP18M226). Des cobayes Hartley albinos (mâles et femelles, pesant de 500 à 700 g) ont été utilisés dans la présente étude.
1. Mise en place et préparation de la procédure
<ol><li>Stérilisez tous les instruments avec de l’oxyde d’éthylène avant de commencer l’expérience.</li>
	<li>Euthanasier les animaux en suivant l...

Cochon d’Inde Explantation de membrane de fenêtre ronde

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

Dans l’administration locale de médicaments à l’oreille, le RWM est la principale voie de passage pour que les thérapies atteignent l’oreille interne. Un modèle de paillasse précis et fiable est nécessaire pour mieux comprendre les mécanismes de transport et la perméabilité à travers les nouveaux véhicules d’administration et pour le développement de médicaments. Dans cette étude, nous démontrons que l’explantation RWM de cobaye est une procédure réalisable et fiable pour permettre des études ...

De nouvelles classes de traitements ont vu le jour pour le traitement de la perte auditive neurosensorielle. L’application de ces thérapies aux populations cliniques est limitée par des voies de transport sûres et efficaces dans l’oreille interne. Les méthodes actuelles d’administration in vivo dans les études animales reposent soit sur la fenestration dans l’oreille interne, soit sur la diffusion à travers la membrane de la fenêtre ronde (RWM), une barrière non osseuse qui sépare l’espace de l’oreille moyenne de la cochlée1.
La fenestration chirurgicale et la micro-injection dans l’oreille interne sont toutes deux invasives et peuvent présenter des risques pour la fonction résiduelle de l’oreille interne2. Par conséquent, le RWM est une voie importante pour l’administration locale des médicaments, et les cobayes sont le principal modèle animal préclinique utilisé pour étudier la pharmacocinétique locale des médicaments dans le RWM et dans l’oreille interne pour le développement pharmaceutique 3,4. Bien que plus mince que le RWM humain, le RWM du cobaye partage une structure identique à trois couches. Il mesure environ 1 mm de diamètre, 15 à 25 μm d’épaisseur et est composé de deux couches de cellules épithéliales prenant en sandwich une couche de tissu conjonctif5. La couche épithéliale faisant face à l’oreille moyenne est densément tassée et reliée par des jonctions serrées, tandis que la couche faisant face à l’oreille interne et à la rampe tympanique a une architecture plus lâche et n’a pas d’adhérences intercellulaires significatives.
Les études précliniques actuelles portant sur la perméabilité aux médicaments chez le cobaye RWM reposent sur des injections in vivo dans l’oreille moyenne suivies d’un prélèvement du liquide périlymphatique dans l’oreille interne, ce qui ne permet pas l’étude spécifique du transport RWM 6,7. Des fragments d’explants de RWM ont été utilisés dans des études précliniques, mais en raison de leur fragilité et de leur petite taille, ils ne conviennent pas aux études microfluidiques systématiques du transport de médicaments et de véhicules nécessitant une étanchéité à travers le RWM2. D’autres groupes ont utilisé des modèles in vitro avec des cellules épithéliales humaines en culture pour approximer le RWM 8,9,10. Cependant, la majorité de ces constructions se concentrent uniquement sur la couche épithéliale externe et ne capturent pas la complexité de l’architecture tissulaire native. Pour une compréhension plus détaillée des mécanismes de transport dans l’ensemble de la RWM, des études ex vivo ciblées sont nécessaires.
Dans cette étude, nous démontrons l’explantation d’un RWM de cobaye avec un support osseux environnant pour préserver l’intégrité de la membrane et illustrons leur utilisation dans un paradigme expérimental conçu pour l’étude spécifique du transport RWM des véhicules d’administration de médicaments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

L’administration efficace et peu invasive de médicaments dans l’oreille interne est un défi de taille. La membrane de fenêtre ronde (RWM), étant l’un des rares points d’entrée de l’oreille interne, est devenue un centre de recherche essentiel. Cependant, en raison de la complexité de l’isolement du RWM, notre compréhension de sa pharmacocinétique reste limitée. Le RWM comprend trois couches distinctes : l’épithélium externe, la couche de tissu conjonctif moyen et la couche épithéliale interne, chacune possédant potentiellement des propriétés d’administration uniques.
Les modèles actuels d’étude du transport à travers le RWM utilisent des modèles animaux in vivo ou des modèles RWM ex vivo qui reposent sur des cultures cellulaires ou des fragments de membrane. Les cobayes servent de modèle préclinique validé pour l’étude de la pharmacocinétique des médicaments dans l’oreille interne et constituent un modèle animal important pour le développement translationnel des véhicules d’administration à la cochlée. Dans cette étude, nous décrivons une approche d’explantation d’un RWM de cobaye avec l’os cochléaire environnant pour des expériences d’administration de médicaments sur paillasse. Cette méthode permet de préserver l’architecture RWM native et peut fournir une représentation plus réaliste des obstacles au transport que les modèles de paillasse actuels.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Pleins feux sur l’auteur : Extraction de la membrane de fenêtre ronde d’un cobaye pour faciliter la recherche sur l’administration de médicaments dans l’oreille interne

Explantation de membrane de fenêtre ronde de cobaye pour études ex vivo

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Comme le montre la figure 3A, cette méthode permet d’explanter la membrane intacte de la fenêtre ronde du cobaye avec un anneau d’os rigide qui l’entoure. Le RWM doit être entièrement connecté à l’anneau osseux sur la circonférence. Aucune fracture de l’os cochléaire ne doit être appréciée. Par rapport aux spécimens humains à fenêtre ronde, le cobaye RWM n’a pas de pseudomembrane sus-jacente. De plus, contrairement aux humains, il existe un pont osseux entre la crur...

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Ce protocole décrit une méthode d’explantation de la membrane de la fenêtre ronde des os temporaux de cobaye, fournissant une ressource précieuse pour les études ex vivo .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Notre groupe étudie les médicaments et les véhicules d’administration de médicaments pour le traitement des maladies de l’oreille interne telles que la perte auditive. La membrane de fenêtre ronde est la barrière essentielle qui empêche les médicaments appliqués localement de pénétrer dans la cochlée et nous travaillons actuellement à comprendre comment les véhicules d’administration de nanoparticules peuvent être conçus pour traverser cette barrière. Comprendre comment fonctionne la membrane de la fenêtre ronde en termes de transport de médicament est crucial pour développer des stratégies efficaces d’administration de médicaments à l’oreille.Le cobaye est un modèle animal préclinique important pour étudier l’administration de médicaments à l’oreille. Cependant, l’isolement de cette membrane fragile, qui ne fait que 17 microns d’épaisseur, pour les études de transport de médicaments reste un défi important. Ici, nous décrivons une méthode d’extraction de la membrane de la fenêtre ronde du cobaye qui permet des études efficaces sur le transport des médicaments en paillasse.Les recherches actuelles sur l’administration de médicaments à l’année intérieure reposent principalement sur des modèles expérimentaux in vivo suivis d’un prélèvement périlymphatique qui ne permet pas une étude spécifique et ciblée des mécanismes de transport de la membrane à fenêtre ronde. Dans cette étude, nous démontrons l’extraction de la membrane de la fenêtre ronde du cobaye avec le support osseux environnant. Cette méthode préserve l’intégrité de l’architecture tissulaire native et permet des études précises et ciblées de l’administration de médicaments à travers la membrane de la fenêtre ronde.

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Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.