Name: Autor im Rampenlicht: Extraktion einer Meerschweinchen-Rundfenstermembran zur Erleichterung der Forschung zur Verabreichung von Medikamenten im Innenohr
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIDCD-Zuschüsse Nr. 1K08DC020780 und 5T32DC000027-33 sowie den Rubenstein Hearing Research Fund unterstützt.

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226) genehmigt. Hartley-Albino-Meerschweinchen (sowohl männlich als auch weiblich, mit einem Gewicht von 500-700 g) wurden in der vorliegenden Studie verwendet.
1. Einrichtung und Vorbereitung des Verfahrens
<ol><li>Sterilisieren Sie alle Instrumente mit Ethylenoxid, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.</li>
	<li>Euthanasieren Sie die Tiere gemäß dem institutionell genehmigten Protokoll. ...

Meerschweinchen-Membran-Explantation mit rundem Fenster

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. 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Bei der lokalen Verabreichung von Medikamenten an das Ohr ist das RWM der primäre Durchgangsweg für Therapeutika, um das Innenohr zu erreichen. Ein genaues und zuverlässiges Tischmodell ist erforderlich, um Transportmechanismen und Permeabilität in neuartigen Verabreichungsvehikeln und für die Arzneimittelentwicklung besser zu verstehen. In dieser Studie zeigen wir, dass die RWM-Explantation von Meerschweinchen ein praktikables und zuverlässiges Verfahren ist, um systematische Untersuchungen von Arzneimittel-Membra...

Für die Behandlung von Schallempfindungsschwerhörigkeit sind neuartige Klassen von Therapeutika entstanden. Die Translation dieser Therapeutika in klinische Populationen ist durch sichere und wirksame Transportwege in das Innenohr begrenzt. Aktuelle Methoden der In-vivo-Verabreichung in Tierversuchen beruhen entweder auf der Fenestration in das Innenohr oder auf der Diffusion durch die Rundfenstermembran (RWM), eine nicht-knöcherne Barriere, die den Mittelohrraum von der Cochlea trennt1.
Chirurgische Fenestration und Mikroinjektion in das Innenohr sind beide invasiv und können Risiken für die verbleibende Innenohrfunktiondarstellen 2. Daher ist das RWM ein wichtiger Weg für die lokale Arzneimittelabgabe, und Meerschweinchen sind das primäre präklinische Tiermodell, das zur Untersuchung der lokalen Arzneimittelpharmakokinetik im RWM und im Innenohr für die pharmazeutische Entwicklung verwendet wird 3,4. Obwohl das Meerschweinchen-RWM dünner ist als das menschliche RWM, hat es eine identische dreischichtige Struktur. Es hat einen Durchmesser von etwa 1 mm, eine Dicke von 15 bis 25 μm und besteht aus zwei Epithelzellschichten, die eine Bindegewebsschicht5 umgeben. Die dem Mittelohr zugewandte Epithelschicht ist dicht gepackt und über Tight Junctions verbunden, während die dem Innenohr und der Scala tympani zugewandte Schicht eine lockerere Architektur aufweist und keine signifikanten interzellulären Adhäsionen aufweist.
Aktuelle präklinische Studien zur Untersuchung der Arzneimittelpermeabilität beim Meerschweinchen-RWM beruhen auf In-vivo-Mittelohrinjektionen mit anschließender Probenahme der Perilymphflüssigkeit im Innenohr, was eine spezifische Untersuchung des RWM-Transports nicht zulässt 6,7. Fragmente von RWM-Explantaten wurden in präklinischen Studien verwendet, sind jedoch aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit und geringen Größe nicht für systematische, mikrofluidische Untersuchungen des Arzneimittel- und Fahrzeugtransports geeignet, die eine wasserdichte Abdichtung über das RWM2 erfordern. Andere Gruppen haben In-vitro-Modelle mit kultivierten menschlichen Epithelzellen verwendet, um sich dem RWM 8,9,10 anzunähern. Die meisten dieser Konstrukte konzentrieren sich jedoch ausschließlich auf die äußere Epithelschicht und erfassen nicht die Komplexität der nativen Gewebearchitektur. Für ein detaillierteres Verständnis der Transportmechanismen im RWM sind gezielte Ex-vivo-Studien erforderlich.
In dieser Studie demonstrieren wir die Explantation eines Meerschweinchen-RWM mit umgebender knöcherner Unterstützung, um die Membranintegrität zu erhalten, und veranschaulichen ihre Verwendung in einem experimentellen Paradigma, das für die spezifische Untersuchung des RWM-Transports von Medikamententrägerfahrzeugen entwickelt wurde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

Die effiziente und minimalinvasive Verabreichung von Medikamenten an das Innenohr ist eine große Herausforderung. Die runde Fenstermembran (RWM) ist als einer der wenigen Eintrittspunkte in das Innenohr zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt geworden. Aufgrund der Komplexität der Isolierung des RWM bleibt unser Verständnis seiner Pharmakokinetik jedoch begrenzt. Das RWM besteht aus drei verschiedenen Schichten: dem äußeren Epithel, der mittleren Bindegewebsschicht und der inneren Epithelschicht, die jeweils potenziell einzigartige Verabreichungseigenschaften besitzen.
Aktuelle Modelle zur Untersuchung des Transports durch das RWM verwenden In-vivo-Tiermodelle oder Ex-vivo-RWM-Modelle, die auf Zellkulturen oder Membranfragmenten basieren. Meerschweinchen dienen als validiertes präklinisches Modell für die Untersuchung der Arzneimittelpharmakokinetik im Innenohr und sind ein wichtiges Tiermodell für die translationale Entwicklung von Verabreichungsvehikeln an die Cochlea. In dieser Studie beschreiben wir einen Ansatz zur Explantation eines Meerschweinchen-RWM mit umgebendem Cochlea-Knochen für Experimente zur Medikamentenverabreichung auf dem Labortisch. Diese Methode ermöglicht die Beibehaltung der nativen RWM-Architektur und kann eine realistischere Darstellung von Transporthindernissen liefern als aktuelle Tischmodelle.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Autor im Rampenlicht: Extraktion einer Meerschweinchen-Rundfenstermembran zur Erleichterung der Forschung zur Verabreichung von Medikamenten im Innenohr

Meerschweinchen-Rundfenstermembran-Explantation für Ex-vivo-Studien

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Wie in Abbildung 3A gezeigt, ermöglicht diese Methode die Explantation der intakten Meerschweinchen-Rundfenstermembran mit einem umgebenden Ring aus starrem Knochen. Das RWM sollte umlaufend vollständig mit dem knöchernen Anulus verbunden sein. Frakturen des Cochlea-Knochens sollten nicht geschätzt werden. Im Vergleich zu menschlichen Rundfensterproben hat Meerschweinchen-RWM keine darüber liegende Pseudomembran. Darüber hinaus gibt es im Gegensatz zum Menschen eine knöcherne Brücke ...

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Explantation der Rundfenstermembran aus Schläfenknochen von Meerschweinchen, die eine wertvolle Ressource für Ex-vivo-Studien darstellt.

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Unsere Gruppe untersucht Medikamente und Medikamententräger zur Behandlung von Innenohrerkrankungen wie Hörverlust. Die runde Fenstermembran ist die kritische Barriere, die verhindert, dass lokal applizierte Medikamente in die Cochlea gelangen, und wir arbeiten derzeit daran, zu verstehen, wie Nanopartikel-Verabreichungsvehikel so konstruiert werden können, dass sie diese Barriere passieren. Das Verständnis, wie die Rundfenstermembran in Bezug auf den Wirkstofftransport funktioniert, ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Strategien zur Verabreichung von Medikamenten an das Ohr.Meerschweinchen ist ein wichtiges präklinisches Tiermodell für die Untersuchung der Arzneimittelabgabe an das Ohr. Die Isolierung dieser fragilen Membran, die nur 17 Mikrometer dick ist, für Studien zum Wirkstofftransport bleibt jedoch eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode zur Extraktion der Meerschweinchen-Rundfenstermembran, die effiziente Laborstudien zum Drogentransport ermöglicht.Aktuelle Untersuchungen zur Wirkstoffabgabe in das innere Jahr stützen sich hauptsächlich auf experimentelle In-vivo-Modelle, gefolgt von Perilymphproben, die keine spezifische und gezielte Untersuchung der Transportmechanismen von Rundfenstermembranen ermöglichen. In dieser Studie demonstrieren wir die Extraktion der Meerschweinchen-Rundfenstermembran mit umgebender knöcherner Unterstützung. Diese Methode bewahrt die Integrität der nativen Gewebearchitektur und ermöglicht präzise und gezielte Untersuchungen der Wirkstoffabgabe über die runde Fenstermembran.

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Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.