Name: מחבר זרקור: מיצוי קרום החלון העגול של חזיר גינאה כדי להקל על מחקר אספקת תרופות באוזן הפנימית
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIDCD מס' 1K08DC020780 ו- 5T32DC000027-33, וקרן רובינשטיין לחקר השמיעה.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (GP18M226). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשרקנים לבקנים של הארטלי (זכר ונקבה כאחד, במשקל 500-700 גרם).
1. הגדרת הנוהל והכנתו
<ol><li>לעקר את כל המכשירים עם אתילן אוקסיד לפני תחילת הניסוי.</li>
	<li>יש להרדים את בע?...

שרקן גינאה חלון עגול קרום Explantation

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

באספקת תרופות מקומית לאוזן, RWM הוא נתיב המעבר העיקרי של טיפולים להגיע לאוזן הפנימית. יש צורך במודל מדויק ואמין כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ההובלה והחדירות בין רכבי משלוח חדשניים ולפיתוח תרופות. במחקר זה, אנו מראים כי מטע RWM של שרקנים הוא הליך אפשרי ואמין המאפשר חקירות שיטתיות של אינטראקצי...

סוגים חדשים של טיפולים התפתחו לטיפול בליקוי שמיעה תחושתי-עצבי. תרגומם של טיפולים אלה לאוכלוסיות קליניות מוגבל על ידי נתיבי הובלה בטוחים ויעילים לאוזן הפנימית. השיטות הנוכחיות של העברת in vivo במחקרים בבעלי חיים מסתמכות על fenestration לתוך האוזן הפנימית או דיפוזיה דרך קרום החלון העגול (RWM), מחסום non-osseous המפריד בין חלל האוזן התיכונה לבין השבלול1.
פנסטרציה כירורגית ומיקרו-הזרקה לאוזן הפנימית הן פולשניות ועלולות להוות סיכון לתפקוד השיורי של האוזן הפנימית2. לכן, RWM הוא נתיב חשוב לאספקת תרופות מקומית, ושרקנים הם המודל הפרה-קליני העיקרי של בעלי חיים המשמש לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות מקומיות ברחבי RWM ובאוזן הפנימית לפיתוח תרופות 3,4. למרות שהוא דק יותר מה-RWM האנושי, השרקן RWM חולק מבנה תלת-שכבתי זהה. קוטרו כ-1 מ"מ, עוביו 15-25 מיקרומטר, והוא מורכב משתי שכבות תאי אפיתל המרכיבות שכבת רקמת חיבור5. שכבת האפיתל הפונה לאוזן התיכונה צפופה ומחוברת באמצעות צמתים הדוקים, בעוד שהשכבה הפונה לאוזן הפנימית ולסקלה טימפאני היא בעלת ארכיטקטורה רופפת יותר ואין לה הידבקויות בין-תאיות משמעותיות.
מחקרים פרה-קליניים עכשוויים החוקרים חדירות תרופות בשרקן RWM מסתמכים על זריקות in vivo באוזן התיכונה ולאחר מכן דגימה של נוזל הפרילימפה בתוך האוזן הפנימית, מה שאינו מאפשר את המחקר הספציפי של הובלת RWM 6,7. שברי צמחי RWM שימשו במחקרים פרה-קליניים, אך בשל שבריריותם וגודלם הקטן, הם אינם מתאימים לחקירות שיטתיות ומיקרופלואידיות של הובלת תרופות וכלי רכב הדורשים אטם אטום למים על פני RWM2. קבוצות אחרות השתמשו במודלים במבחנה עם תאי אפיתל אנושיים בתרבית כדי להעריך בקירוב את RWM 8,9,10. עם זאת, רוב המבנים הללו מתמקדים אך ורק בשכבת האפיתל החיצונית ואינם לוכדים את המורכבות של ארכיטקטורת רקמות טבעית. להבנה מפורטת יותר של מנגנוני הובלה ברחבי RWM, נדרשים מחקרים ממוקדים, ex vivo.
במחקר זה, אנו מדגימים את הנטיעה של RWM שרקן עם תמיכה גרמית מסביב כדי לשמור על שלמות הממברנה וממחישים את השימוש בהם בפרדיגמה ניסיונית המיועדת למחקר ספציפי של הובלת RWM של כלי משלוח סמים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

מתן יעיל וזעיר פולשני של תרופות לאוזן הפנימית הוא אתגר משמעותי. קרום החלון העגול (RWM), בהיותו אחת מנקודות הכניסה הבודדות לאוזן הפנימית, הפך למוקד חקירה חיוני. עם זאת, בשל המורכבות של בידוד RWM, ההבנה שלנו של הפרמקוקינטיקה שלה נותרה מוגבלת. ה-RWM מורכב משלוש שכבות נפרדות: האפיתל החיצוני, שכבת רקמת החיבור האמצעית ושכבת האפיתל הפנימית, שכל אחת מהן בעלת תכונות העברה ייחודיות.
המודלים הנוכחיים לחקר התחבורה ברחבי RWM משתמשים במודלים של בעלי חיים in vivo או מודלים של RWM ex vivo המסתמכים על תרביות תאים או שברי ממברנה. שרקנים משמשים כמודל פרה-קליני מתוקף לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות בתוך האוזן הפנימית והם מודל חייתי חשוב לפיתוח תרגומי של רכבי משלוח לשבלול. במחקר זה, אנו מתארים גישה לנטיעת RWM של שרקן עם עצם השבלול שמסביב לניסויים בהעברת תרופות. שיטה זו מאפשרת שימור של ארכיטקטורת RWM מקורית ועשויה לספק ייצוג מציאותי יותר של חסמי תחבורה מאשר דגמי הספסלים הנוכחיים.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

מחבר זרקור: מיצוי קרום החלון העגול של חזיר גינאה כדי להקל על מחקר אספקת תרופות באוזן הפנימית

נטיעת קרום חלון עגול של שרקן גינאה ללימודי Ex Vivo

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

כפי שמודגם באיור 3A, שיטה זו מאפשרת לנטוע את קרום החלון העגול של השרקן השלם עם טבעת מקיפה של עצם קשיחה. RWM צריך להיות מחובר באופן מלא לטבעת הגרמית באופן היקפי. אין להעריך שברים בעצם השבלול. בהשוואה לדגימות חלון עגול אנושי, לשרקן RWM אין פסאודוממברנה מעל. בנוסף, בניגוד לבני אדם, ק...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שיטה להוצאת קרום החלון העגול מעצמות הרקתיות של שרקן, ומספק משאב רב ערך למחקרי ex vivo .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

הקבוצה שלנו חוקרת תרופות וכלי משלוח תרופות לטיפול במחלות אוזן פנימית כגון ליקוי שמיעה. קרום החלון העגול הוא המחסום הקריטי שמונע מתרופות מקומיות להיכנס לשבלול, וכעת אנו עובדים כדי להבין כיצד ניתן להנדס כלי רכב להובלת ננו-חלקיקים כך שיעברו דרך מחסום זה. הבנת אופן הפעולה של קרום החלון העגול במונחים של הובלת תרופות חיונית לפיתוח אסטרטגיות יעילות להעברת תרופות לאוזן.שרקן גינאה הוא מודל פרה-קליני חשוב של בעלי חיים לחקר העברת תרופות לאוזן. עם זאת, בידוד קרום שברירי זה, שעוביו 17 מיקרון בלבד, לצורך מחקרי הובלת תרופות נותר אתגר משמעותי. כאן, אנו מתארים שיטה לחילוץ קרום החלון העגול של השרקן המאפשר מחקרי הובלת תרופות יעילים על גבי ספסל.החקירות הנוכחיות של העברת תרופות לשנה הפנימית מסתמכות בעיקר על מודלים ניסיוניים in vivo ואחריו דגימת פרילימפה, שאינם מאפשרים מחקר ספציפי וממוקד של מנגנוני הובלת קרום החלון העגול. במחקר זה אנו מדגימים מיצוי של קרום החלון העגול של השרקן עם תמיכה גרמית מסביב. שיטה זו שומרת על שלמות ארכיטקטורת הרקמה הטבעית ומאפשרת מחקרים מדויקים וממוקדים של העברת תרופות על פני קרום החלון העגול.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.