Name: Autore in primo piano: Estrazione della membrana della finestra rotonda di porcellino d'India per facilitare la ricerca sulla somministrazione di farmaci nell'orecchio interno
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni NIDCD n. 1K08DC020780 e 5T32DC000027-33 e dal Rubenstein Hearing Research Fund.

Tutte le procedure per la cura e l'uso degli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (GP18M226). Nel presente studio sono stati utilizzati porcellini d'india albini Hartley (sia maschi che femmine, del peso di 500-700 g).
1. Impostazione e preparazione della procedura
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti con ossido di etilene prima di iniziare l'esperimento.</li>
	<li>Sopprimere gli animali seguendo il protocollo istituzi...

Espiantazione di membrana per finestre rotonde di cavia

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

Nella somministrazione locale di farmaci all'orecchio, l'RWM è la principale via di passaggio per le terapie per raggiungere l'orecchio interno. È necessario un modello da banco accurato e affidabile per comprendere meglio i meccanismi di trasporto e la permeabilità attraverso i nuovi veicoli di somministrazione e per lo sviluppo di farmaci. In questo studio, dimostriamo che l'espianto di RWM da cavia è una procedura fattibile e affidabile per consentire indagini sistematiche sulle interazioni farmaco-membrana. Lundm...

Sono emerse nuove classi di terapie per il trattamento dell'ipoacusia neurosensoriale. La traduzione di queste terapie nelle popolazioni cliniche è limitata da vie di trasporto sicure ed efficaci nell'orecchio interno. Gli attuali metodi di somministrazione in vivo negli studi sugli animali si basano sulla fenestrazione nell'orecchio interno o sulla diffusione attraverso la membrana a finestra rotonda (RWM), una barriera non ossea che separa lo spazio dell'orecchio medio dalla coclea1.
La fenestrazione chirurgica e la microiniezione nell'orecchio interno sono entrambe invasive e possono comportare rischi per la funzione residua dell'orecchio interno2. Pertanto, l'RWM è una via importante per la somministrazione locale di farmaci e le cavie sono il principale modello animale preclinico utilizzato per studiare la farmacocinetica dei farmaci locali attraverso l'RWM e nell'orecchio interno per lo sviluppo farmaceutico 3,4. Sebbene più sottile dell'RWM umano, il porcellino d'India RWM condivide un'identica struttura a tre strati. Ha un diametro di circa 1 mm, uno spessore di 15-25 μm ed è composto da due strati di cellule epiteliali che racchiudono uno strato di tessuto connettivo5. Lo strato epiteliale rivolto verso l'orecchio medio è densamente impacchettato e collegato tramite giunzioni strette, mentre lo strato rivolto verso l'orecchio interno e la scala timpanica ha un'architettura più sciolta e non ha aderenze intercellulari significative.
Gli attuali studi preclinici che indagano la permeabilità ai farmaci nella RWM cavia si basano su iniezioni in vivo nell'orecchio medio seguite dal campionamento del liquido perilinfatico all'interno dell'orecchio interno, il che non consente lo studio specifico del trasporto RWM 6,7. Frammenti di espianti RWM sono stati utilizzati in studi preclinici, ma a causa della loro fragilità e delle loro piccole dimensioni, non sono adatti per indagini microfluidiche sistematiche sul trasporto di farmaci e veicoli che richiedono una tenuta stagna attraverso l'RWM2. Altri gruppi hanno impiegato modelli in vitro con cellule epiteliali umane in coltura per approssimare l'RWM 8,9,10. Tuttavia, la maggior parte di questi costrutti si concentra esclusivamente sullo strato epiteliale esterno e non cattura la complessità dell'architettura del tessuto nativo. Per una comprensione più dettagliata dei meccanismi di trasporto attraverso l'RWM, sono necessari studi mirati ex vivo.
In questo studio, dimostriamo l'espianto di un RWM di cavia con supporto osseo circostante per preservare l'integrità della membrana e illustriamo il loro utilizzo in un paradigma sperimentale progettato per lo studio specifico del trasporto RWM di veicoli per la somministrazione di farmaci.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

La somministrazione efficiente e minimamente invasiva dei farmaci all'orecchio interno è una sfida significativa. La membrana a finestra rotonda (RWM), essendo uno dei pochi punti di ingresso all'orecchio interno, è diventata un punto focale di indagine. Tuttavia, a causa della complessità dell'isolamento dell'RWM, la nostra comprensione della sua farmacocinetica rimane limitata. L'RWM comprende tre strati distinti: l'epitelio esterno, lo strato intermedio di tessuto connettivo e lo strato epiteliale interno, ciascuno dei quali possiede proprietà di rilascio uniche.
Gli attuali modelli per studiare il trasporto attraverso l'RWM utilizzano modelli animali in vivo o modelli RWM ex vivo che si basano su colture cellulari o frammenti di membrana. I porcellini d'India fungono da modello preclinico validato per lo studio della farmacocinetica dei farmaci all'interno dell'orecchio interno e sono un importante modello animale per lo sviluppo traslazionale di veicoli di somministrazione alla coclea. In questo studio, descriviamo un approccio per l'espianto di un RWM di cavia con osso cocleare circostante per esperimenti di somministrazione di farmaci da banco. Questo metodo consente di preservare l'architettura RWM nativa e può fornire una rappresentazione più realistica delle barriere al trasporto rispetto agli attuali modelli da banco.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Autore in primo piano: Estrazione della membrana della finestra rotonda di porcellino d'India per facilitare la ricerca sulla somministrazione di farmaci nell'orecchio interno

Espianto di membrane a finestra rotonda di porcellini d'India per studi ex vivo

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Come dimostrato nella Figura 3A, questo metodo consente l'espianto della membrana a finestra rotonda intatta del porcellino d'India con un anello circostante di osso rigido. L'RWM deve essere completamente collegato all'anulus osseo circonferenzialmente. Non devono essere apprezzate fratture dell'osso cocleare. Rispetto agli esemplari umani a finestra rotonda, il porcellino d'India RWM non ha una pseudomembrana sovrastante. Inoltre, a differenza degli esseri umani, c'è un ponte osseo tra la...

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Questo protocollo delinea un metodo per l'espianto della membrana della finestra rotonda dalle ossa temporali dei porcellini d'India, fornendo una risorsa preziosa per gli studi ex vivo .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Il nostro gruppo sta studiando farmaci e veicoli per il trattamento delle malattie dell'orecchio interno come la perdita dell'udito. La membrana a finestra rotonda è la barriera critica che impedisce ai farmaci applicati localmente di entrare nella coclea e attualmente stiamo lavorando per capire come i veicoli di rilascio di nanoparticelle possano essere progettati per passare attraverso questa barriera. Capire come funziona la membrana a finestra rotonda in termini di trasporto del farmaco è fondamentale per sviluppare strategie efficaci di somministrazione del farmaco all'orecchio.Il porcellino d'India è un importante modello animale preclinico per lo studio della somministrazione di farmaci all'orecchio. Tuttavia, l'isolamento di questa fragile membrana, che ha uno spessore di soli 17 micron, per gli studi sul trasporto dei farmaci rimane una sfida significativa. In questo articolo, descriviamo un metodo per estrarre la membrana a finestra rotonda del porcellino d'India che consente di effettuare studi efficienti sul trasporto dei farmaci da banco.Le attuali indagini sulla somministrazione del farmaco all'anno interno si basano principalmente su modelli sperimentali in vivo seguiti da campionamento della perilinfa, che non consentono uno studio specifico e mirato dei meccanismi di trasporto della membrana a finestra rotonda. In questo studio, dimostriamo l'estrazione della membrana della finestra rotonda del porcellino d'India con il supporto osseo circostante. Questo metodo preserva l'integrità dell'architettura tissutale nativa e consente studi precisi e mirati sulla somministrazione del farmaco attraverso la membrana a finestra rotonda.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.