Name: 著者スポットライト:内耳薬物送達研究を促進するためのモルモット丸窓膜の抽出
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
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この研究の一部は、NIDCD Grants No. 1K08DC020780 および 5T32DC000027-33、およびルーベンシュタイン聴覚研究基金の支援を受けました。

すべての動物処置は、動物実験委員会(GP18M226)によって承認されました。Hartleyアルビノモルモット(雄と雌の両方、体重500〜700g)を本研究で使用しました。
1. 手順の設定と準備
<ol><li>実験を開始する前に、すべての機器をエチレンオキシドで滅菌してください。</li>
	<li>施設で承認されたプロトコルに従って動物を安楽死させます。 注:現在の研究では、市?...

モルモット丸窓膜の説明

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

耳への局所薬物送達では、RWMは治療薬が内耳に到達するための主要な通過経路です。正確で信頼性の高いベンチトップモデルは、新しい送達手段の輸送メカニズムと透過性をよりよく理解し、医薬品開発のために必要です。この研究では、モルモットのRWM移植が実行可能で信頼できる手順であり、薬物と膜の相互作用の体系的な調査を可能にすることを実証します。LundmanらとKelsoらは、以前?...

感音難聴の治療のために、新しいクラスの治療法が登場しました。これらの治療薬の臨床集団への翻訳は、内耳への安全で効果的な輸送経路によって制限されています。動物実験における in vivo 送達の現在の方法は、内耳への開窓または中耳腔と蝸牛を隔てる非骨性バリアである丸窓膜(RWM)を介した拡散のいずれかに依存しています1。
外科的開窓と内耳へのマイクロインジェクションはどちらも侵襲的であり、残存する内耳機能にリスクをもたらす可能性があります2。したがって、RWMは局所薬物送達の重要な経路であり、モルモットは、医薬品開発のためにRWM全体および内耳で局所薬物動態を研究するために使用される主要な前臨床動物モデルです3,4。モルモットのRWMは、ヒトのRWMよりも薄いが、同じ3層構造を共有している。直径約1mm、厚さ15〜25μmで、結合組織層5を挟む2つの上皮細胞層からなる。中耳に面した上皮層は密集し、タイトジャンクションを介して接続されていますが、内耳とスカラティンパニに面した層は構造が緩く、細胞間接着が顕著ではありません。
モルモットRWMの薬物透過性を調査する現在の前臨床試験は、in vivoの中耳注射とそれに続く内耳内の外リンパ液のサンプリングに依存しており、RWM輸送の特定の研究は不可能です6,7。RWM外植片の断片は前臨床試験で使用されてきましたが、壊れやすくサイズが小さいため、RWM2全体に水密シールを必要とする薬物および車両輸送の体系的なマイクロ流体研究には適していません。他のグループは、RWM 8,9,10を近似するために、培養したヒト上皮細胞を用いたin vitroモデルを採用しました。しかし、これらのコンストラクトの大部分は、外側の上皮層にのみ焦点を当てており、天然組織構造の複雑さを捉えていません。RWM全体の輸送メカニズムをより詳細に理解するには、ターゲットを絞ったex vivo研究が必要です。
この研究では、モルモットRWMの移植と周囲の骨サポートを実証し、膜の完全性を維持し、薬物送達車両のRWM輸送の特定の研究のために設計された実験パラダイムでの使用を説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

内耳への効率的で低侵襲な薬物送達は大きな課題です。丸窓膜(RWM)は、内耳への数少ない入り口の1つであり、研究の重要な焦点となっています。しかし、RWMの単離は複雑なため、その薬物動態に関する理解は依然として限られています。RWMは、外側の上皮、中間結合組織層、内側上皮層の3つの異なる層で構成されており、それぞれが独自の送達特性を持っている可能性があります。
RWM全体の輸送を調査するための現在のモデルでは、in vivo動物モデルまたは細胞培養または膜断片に依存するex vivo RWMモデルが利用されています。モルモットは、内耳内の薬物動態を調査するための検証済みの前臨床モデルとして機能し、蝸牛への送達担体のトランスレーショナル開発のための重要な動物モデルです。本研究では、モルモットRWMを周囲の蝸牛骨とともに移植し、卓上での薬物送達実験を行うアプローチについて述べる。この方法では、ネイティブのRWMアーキテクチャを維持でき、現在のベンチトップモデルよりも輸送の障壁をより現実的に表現できる可能性があります。

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

著者スポットライト:内耳薬物送達研究を促進するためのモルモット丸窓膜の抽出

モルモットの丸窓膜移植による Ex Vivo 研究

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

図3Aに示されるように、この方法は、無傷のモルモットの丸い窓膜を、周囲の硬い骨のリングで移植することを可能にする。RWMは、円周方向に骨輪に完全に接続されている必要があります。蝸牛の骨折は認められません。ヒトの丸い窓の標本と比較して、モルモットのRWMは偽膜を覆っていません。さらに、人間とは異なり、モルモットの茎のクルーラの間には骨の橋が?...

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このプロトコルはモルモットの一時的な骨からの円形の窓の膜のexplantationのための方法を輪郭を描いて、 ex vivo の調査に貴重な資源を提供する。

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

当グループでは、難聴などの内耳疾患の治療のための薬剤や薬物送達担体の研究を行っています。丸い窓の膜は、局所的に塗布された薬剤が蝸牛に入るのを防ぐ重要な障壁であり、私たちは現在、この障壁を通過するようにナノ粒子送達車をどのように設計できるかを理解しようとしています。丸窓膜が薬物輸送の観点からどのように機能するかを理解することは、耳への効果的な薬物送達戦略を開発する上で非常に重要です。モルモットは、耳への薬物送達を研究するための重要な前臨床動物モデルです。しかし、厚さわずか17ミクロンのこの脆弱な膜を薬物輸送研究のために単離することは、依然として大きな課題です。ここでは、効率的なベンチトップ薬物輸送研究を可能にするモルモットの丸窓膜の抽出法について説明します。内年への薬物送達の現在の研究は、主にin vivo実験モデルとそれに続く外リンパサンプリングに依存しており、円形の窓の膜輸送メカニズムの特異的で的を絞った研究は不可能です。本研究では、モルモットの丸い窓膜を周囲の骨支持体で抽出する方法を実証する。この方法により、天然組織構造の完全性が維持され、丸い窓膜を介した薬物送達の正確で標的を絞った研究が可能になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.