Name: 저자 스포트라이트: 내이 약물 전달 연구를 촉진하기 위한 기니피그 원형 창막 추출
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

이 연구는 NIDCD 보조금 번호 1K08DC020780 및 5T32DC000027-33과 Rubenstein Hearing Research Fund의 지원을 받았습니다.

모든 동물 시술은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(GP18M226)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 하틀리 알비노 기니피그(수컷과 암컷 모두, 체중 500-700g)를 사용하였다.
1. 절차 설정 및 준비
<ol><li>실험을 시작하기 전에 모든 기구를 에틸렌옥사이드로 멸균하십시오.</li>
	<li>제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다. 알림: 현재 연구에서는 상?...

기니피그 원형 창 멤브레인 이식

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

귀에 국소 약물 전달에서 RWM은 치료제가 내이에 도달하는 주요 통로입니다. 정확하고 신뢰할 수 있는 벤치탑 모델은 새로운 전달 차량 전반에 걸친 운송 메커니즘과 투과성을 더 잘 이해하고 약물 개발을 위해 필요합니다. 이 연구에서 우리는 기니피그 RWM 이식이 약물-막 상호 작용에 대한 체계적인 조사를 가능하게 하는 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 절차임을 보여줍니다. Lundman et al. 및 Kelso et a...

감각신경성 난청 치료를 위한 새로운 종류의 치료법이 등장했습니다. 이러한 치료제를 임상 인구에 적용하는 것은 내이로 운반하는 안전하고 효과적인 경로에 의해 제한됩니다. 동물 연구에서 현재 생체 내 전달 방법은 내이로의 창호 또는 달팽이관에서 중이 공간을 분리하는 비골 장벽인 둥근 창막(RWM)을 통한 확산에 의존합니다1.
외과적 창호와 내이에 대한 미세 주입은 모두 침습적이며 잔류 내이 기능에 위험을 초래할 수 있다2. 따라서 RWM은 국소 약물 전달을 위한 중요한 경로이며, 기니피그는 RWM 전체와 의약품 개발을 위한 내이의 국소 약물 약동학을 연구하는 데 사용되는 주요 전임상 동물 모델입니다 3,4. 기니피그 RWM은 인간 RWM보다 얇지만 동일한 3층 구조를 공유합니다. 직경 약 1mm, 두께 15-25μm이며, 결합 조직층(5)을 끼우는 두 개의 상피 세포층으로 구성되어 있습니다. 중이를 향하는 상피층은 조밀하게 밀집되어 있고 단단한 접합부를 통해 연결되어 있는 반면, 내이와 스칼라 고막을 향하는 층은 구조가 느슨하고 세포 간 유착이 크지 않습니다.
기니피그 RWM의 약물 투과성을 조사하는 현재의 전임상 연구는 생체 내 중이 주사 후 내이 내 림프액 샘플링에 의존하고 있으며, 이는 RWM 수송에 대한 특정 연구를 허용하지 않습니다 6,7. RWM 외식의 단편은 전임상 연구에 사용되어 왔지만, 취약성과 작은 크기로 인해 RWM2 전체에 걸쳐 방수 밀봉이 필요한 약물 및 차량 운송의 체계적인 미세유체 조사에는 적합하지 않습니다. 다른 그룹은 RWM 8,9,10에 근접하기 위해 배양된 인간 상피 세포가 있는 시험관 내 모델을 사용했습니다. 그러나 이러한 구조의 대부분은 외부 상피층에만 초점을 맞추고 자연 조직 구조의 복잡성을 포착하지 못합니다. RWM 전반의 수송 메커니즘에 대한 보다 자세한 이해를 위해서는 표적화된 체외 연구가 필요합니다.
이 연구에서는 막 무결성을 보존하기 위해 주변 뼈 지지대와 함께 기니피그 RWM을 이식하는 방법을 시연하고 약물 전달 차량의 RWM 수송에 대한 특정 연구를 위해 설계된 실험 패러다임에서 RWM의 사용을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

내이에 대한 효율적이고 최소 침습적 약물 전달은 중요한 과제입니다. 내이로 들어가는 몇 안 되는 진입점 중 하나인 둥근 창막(RWM)은 연구의 중요한 초점이 되었습니다. 그러나 RWM을 분리하는 것이 복잡하기 때문에 약동학에 대한 이해는 여전히 제한적입니다. RWM은 외부 상피, 중간 결합 조직층 및 내부 상피층의 세 가지 별개의 층으로 구성되며, 각 층은 잠재적으로 고유한 전달 특성을 가지고 있습니다.
RWM을 통한 수송을 조사하기 위한 현재 모델은 세포 배양 또는 막 조각에 의존하는 생체 내 동물 모델 또는 생체 외 RWM 모델을 활용합니다. 기니피그는 내이 내 약물 약동학 조사를 위한 검증된 전임상 모델 역할을 하며, 달팽이관에 대한 전달 수단의 중개 개발을 위한 중요한 동물 모델입니다. 이 연구에서는 벤치탑 약물 전달 실험을 위해 주변 달팽이관과 함께 기니피그 RWM을 이식하는 접근 방식을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 기본 RWM 아키텍처를 보존할 수 있으며 현재 벤치탑 모델보다 운송 장벽을 보다 사실적으로 표현할 수 있습니다.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

저자 스포트라이트: 내이 약물 전달 연구를 촉진하기 위한 기니피그 원형 창막 추출

Ex Vivo 연구를 위한 기니피그 원형 창 멤브레인 이식

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

그림 3A에서 볼 수 있듯이 이 방법은 단단한 뼈의 고리를 둘러싼 온전한 기니피그 원형 창막을 이식할 수 있습니다. RWM은 뼈 고리에 원주방향으로 완전히 연결되어야 합니다. 달팽이관의 골절은 인정되어서는 안 됩니다. 인간의 둥근 창 표본과 비교할 때 기니피그 RWM에는 위에 가성막이 없습니다. 또한 인간과 달리 기니피그 등골의 등골 사이에는 뼈 다리가 있어 등골 상부 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

이 프로토콜은 기니피그 측두골에서 둥근 창막을 이식하는 방법을 설명하여 생체 외 연구에 귀중한 리소스를 제공합니다.

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

우리 그룹은 난청과 같은 내이 질환 치료를 위한 약물 및 약물 전달 수단을 연구하고 있습니다. 둥근 창 멤브레인은 국소적으로 적용된 약물이 달팽이관으로 들어가는 것을 방지하는 중요한 장벽이며, 우리는 현재 나노 입자 전달 차량이 이 장벽을 통과하도록 설계할 수 있는 방법을 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 약물 수송 측면에서 원형 창막이 어떻게 작동하는지 이해하는 것은 귀에 대한 효과적인 약물 전달 전략을 개발하는 데 매우 중요합니다.기니피그는 귀에 대한 약물 전달을 연구하기 위한 중요한 전임상 동물 모델입니다. 그러나 약물 수송 연구를 위해 두께가 17미크론에 불과한 이 깨지기 쉬운 막을 분리하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다. 여기에서는 효율적인 벤치탑 약물 수송 연구를 가능하게 하는 기니피그 원형 창 멤브레인을 추출하는 방법을 설명합니다.현재 내년까지의 약물 전달에 대한 연구는 주로 생체 내 실험 모델에 의존하고 있으며, 그 다음에는 림프 샘플링에 의존하고 있으며, 이는 둥근 창 막 수송 메커니즘에 대한 특이적이고 표적화된 연구를 허용하지 않습니다. 이 연구에서는 주변 뼈 지지대가 있는 기니피그 원형 창막의 추출을 보여줍니다. 이 방법은 자연 조직 구조의 무결성을 보존하고 둥근 창 막을 가로지르는 약물 전달에 대한 정밀하고 표적화된 연구를 가능하게 합니다.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.