Name: Forfatter Spotlight: Ekstraksjon av marsvin rund vindusmembran for å lette forskning på legemiddellevering i det indre øret
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av NIDCD Grants No. 1K08DC020780 og 5T32DC000027-33, og Rubenstein Hearing Research Fund.

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albino marsvin (både hann og kvinne, veier 500-700 g) ble brukt i denne studien.
1. Prosedyreoppsett og forberedelse
<ol><li>Steriliser alle instrumenter med etylenoksid før du begynner forsøket.</li>
	<li>Avlive dyrene etter den institusjonelt godkjente protokollen. MERK: I den nåværende studien ble et ikke-forhåndsladet kammer ansatt for å frigjøre 100% karbondiok...

Marsvin rund vindusmembran eksplantasjon

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

I lokal legemiddellevering til øret er RWM den primære passasjeveien for terapeutika for å nå det indre øret. En nøyaktig og pålitelig stasjonær modell er nødvendig for å bedre forstå transportmekanismer og permeabilitet på tvers av nye leveringskjøretøy og for legemiddelutvikling. I denne studien demonstrerer vi at marsvin RWM-eksplantasjon er en gjennomførbar og pålitelig prosedyre for å tillate systematiske undersøkelser av legemiddelmembraninteraksjoner. Lundman et al. og Kelso et al. har tidligere ...

Nye klasser av terapeutika har dukket opp for behandling av sensorinevralt hørselstap. Oversettelsen av disse behandlingene til kliniske populasjoner er begrenset av trygge og effektive transportveier til det indre øret. Nåværende metoder for in vivo levering i dyrestudier er avhengig av enten fenestrasjon i det indre øret eller diffusjon gjennom den runde vindusmembranen (RWM), en ikke-osseøs barriere som skiller mellomøret fra cochlea1.
Både kirurgisk fenestrasjon og mikroinjeksjon i det indre øret er invasivt og kan utgjøre en risiko for gjenværende indre ørefunksjon2. Derfor er RWM en viktig rute for lokal legemiddellevering, og marsvin er den primære prekliniske dyremodellen som brukes til å studere lokal legemiddelfarmakokinetikk over RWM og i det indre øret for farmasøytisk utvikling 3,4. Selv om den er tynnere enn den menneskelige RWM, deler marsvinet RWM en identisk trelags struktur. Den er ca. 1 mm i diameter, 15-25 μm tykk, og består av to epitelcellelag som sandwicher et bindevevslag5. Epitellaget mot mellomøret er tettpakket og forbundet via tette kryss, mens laget mot det indre øret og scala tympani har løsere arkitektur og har ikke signifikante intercellulære adhesjoner.
Nåværende prekliniske studier som undersøker legemiddelpermeabilitet hos marsvin RWM, er avhengige av in vivo mellomøreinjeksjoner etterfulgt av prøvetaking av perilymfevæsken i det indre øret, noe som ikke tillater den spesifikke studien av RWM-transport 6,7. Fragmenter av RWM-eksplanter har blitt brukt i prekliniske studier, men på grunn av deres skjørhet og lille størrelse er de ikke egnet for systematiske, mikrofluidiske undersøkelser av legemiddel- og kjøretøytransport som krever en vanntett forsegling over RWM2. Andre grupper har benyttet in vitro-modeller med dyrkede humane epitelceller for å tilnærme RWM 8,9,10. Imidlertid fokuserer flertallet av disse konstruksjonene utelukkende på det ytre epitellaget og fanger ikke kompleksiteten til innfødt vevsarkitektur. For en mer detaljert forståelse av transportmekanismer på tvers av RWM er det nødvendig med målrettede ex vivo-studier.
I denne studien demonstrerer vi eksplantasjonen av en marsvin RWM med omkringliggende benstøtte for å bevare membranintegritet og illustrere bruken av dem i et eksperimentelt paradigme designet for den spesifikke studien av RWM-transport av legemiddelleveringsbiler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

Effektiv og minimalt invasiv legemiddellevering til det indre øret er en betydelig utfordring. Den runde vindusmembranen (RWM), som er en av de få inngangspunktene til det indre øret, har blitt et viktig fokus for undersøkelser. På grunn av kompleksiteten ved å isolere RWM, er vår forståelse av farmakokinetikken imidlertid fortsatt begrenset. RWM består av tre forskjellige lag: det ytre epitelet, det midterste bindevevslaget og det indre epitellaget, som hver potensielt har unike leveringsegenskaper.
Nåværende modeller for å undersøke transport over RWM bruker in vivo dyremodeller eller ex vivo RWM-modeller som er avhengige av cellekulturer eller membranfragmenter. Marsvin fungerer som en validert preklinisk modell for undersøkelse av farmakokinetikken i det indre øret og er en viktig dyremodell for translasjonell utvikling av leveringsbiler til cochlea. I denne studien beskriver vi en tilnærming for eksplantasjon av et marsvin RWM med omkringliggende cochleabein for benchtop-legemiddelleveringseksperimenter. Denne metoden muliggjør bevaring av opprinnelig RWM-arkitektur og kan gi en mer realistisk representasjon av transportbarrierer enn dagens stasjonære modeller.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Forfatter Spotlight: Ekstraksjon av marsvin rund vindusmembran for å lette forskning på legemiddellevering i det indre øret

Marsvin Round Window Membrane Explantation for Ex vivo studier

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Som vist i figur 3A, tillater denne metoden eksplantasjon av den intakte marsvin runde vindusmembranen med en omkringliggende ring av stivt bein. RWM skal være fullt koblet til den benete ringrommet omkretsende. Ingen brudd i cochleabenet bør verdsettes. I sammenligning med menneskelige runde vindusprøver har marsvin RWM ikke en overliggende pseudomembran. I tillegg, i motsetning til mennesker, er det en benete bro mellom crura av marsvinstiftene, som krever oppsprekking og fjerning før ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Denne protokollen skisserer en metode for eksplantasjon av den runde vindusmembranen fra marsvin temporale bein, og gir en verdifull ressurs for ex vivo studier.

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Vår gruppe undersøker medisiner og legemiddelleveringsbiler for behandling av indre øresykdommer som hørselstap. Den runde vindusmembranen er den kritiske barrieren som forhindrer lokalt påførte stoffer i å komme inn i cochlea, og vi jobber for tiden med å forstå hvordan nanopartikkelleveringskjøretøy kan konstrueres for å passere gjennom denne barrieren. Å forstå hvordan den runde vindusmembranen fungerer når det gjelder narkotikatransport er avgjørende for å utvikle effektive legemiddelleveringsstrategier til øret.Marsvin er en viktig preklinisk dyremodell for å studere legemiddellevering til øret. Det er imidlertid fortsatt en betydelig utfordring å isolere denne skjøre membranen, som bare er 17 mikrometer tykk, for narkotikatransportstudier. Her beskriver vi en metode for å trekke ut marsvinets runde vindusmembran som muliggjør effektive benktransportstudier.Nåværende undersøkelser av legemiddellevering til det indre året er hovedsakelig avhengig av in vivo eksperimentelle modeller etterfulgt av perilymfeprøvetaking som ikke tillater en spesifikk og målrettet studie av membrantransportmekanismer for runde vinduer. I denne studien demonstrerer vi ekstraksjonen av marsvinets runde vindusmembran med omkringliggende benstøtte. Denne metoden bevarer naturlig vevsarkitekturintegritet og muliggjør presise og målrettede studier av legemiddellevering over den runde vindusmembranen.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.