Name: Autor em destaque: Extração da membrana da janela redonda de cobaia para facilitar a pesquisa de entrega de medicamentos no ouvido interno
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Este trabalho foi financiado em parte pelo NIDCD Grants No. 1K08DC020780 e 5T32DC000027-33, e pelo Rubenstein Hearing Research Fund.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (GP18M226). Cobaias albinas Hartley (machos e fêmeas, pesando 500-700 g) foram utilizadas no presente estudo.
1. Configuração e preparação do procedimento
<ol><li>Esterilizar todos os instrumentos com óxido de etileno antes de iniciar o experimento.</li>
	<li>Eutanásia dos animais seguindo protocolo aprovado institucionalmente. NOTA: No presente estudo, uma c?...

Explantação de membrana de janela redonda de porquinho-da-índia

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

Na administração local da droga para a orelha, a RWM é a principal via de passagem para a terapêutica chegar à orelha interna. Um modelo de bancada preciso e confiável é necessário para entender melhor os mecanismos de transporte e a permeabilidade em novos veículos de entrega e para o desenvolvimento de medicamentos. Neste estudo, demonstramos que o explante de RMP em cobaias é um procedimento viável e confiável para permitir investigações sistemáticas de interações fármaco-membrana. e Kelso et al., ut...

Novas classes de terapêuticas têm surgido para o tratamento da perda auditiva neurossensorial. A tradução dessas terapêuticas para populações clínicas é limitada por vias seguras e eficazes de transporte para a orelha interna. Os métodos atuais de liberação in vivo em estudos com animais baseiam-se tanto na fenestração para a orelha interna quanto na difusão através da membrana da janela redonda (MRP), uma barreira não óssea que separa o espaço da orelha média da cóclea1.
A fenestração cirúrgica e a microinjeção na orelha interna são invasivas e podem representar riscos à função residual da orelha interna2. Portanto, a RWM é uma importante via para liberação local de fármacos, e as cobaias são o principal modelo animal pré-clínico utilizado para estudar a farmacocinética local de fármacos em toda a RWM e na orelha interna para o desenvolvimento farmacêutico 3,4. Embora mais fina que a RWM humana, a cobaia RWM compartilha uma estrutura idêntica de três camadas. Tem aproximadamente 1 mm de diâmetro, 15-25 μm de espessura e é composto por duas camadas de células epiteliais que formam uma camada de tecido conjuntivo5. A camada epitelial voltada para a orelha média é densamente compactada e conectada através de tight junctions, enquanto a camada voltada para a orelha interna e escala timpânica tem arquitetura mais frouxa e não tem aderências intercelulares significativas.
Os estudos pré-clínicos atuais que investigam a permeabilidade de drogas na cobaia RWM baseiam-se em injeções in vivo na orelha média seguidas da amostragem do fluido da perilinfa dentro da orelha interna, o que não permite o estudo específico do transporte da RMP 6,7. Fragmentos de explantes RWM têm sido usados em estudos pré-clínicos, mas devido à sua fragilidade e pequeno tamanho, eles não são adequados para investigações microfluídicas sistemáticas de transporte de drogas e veículos que requerem uma vedação estanque em todo o RWM2. Outros grupos empregaram modelos in vitro com cultura de células epiteliais humanas para aproximar o RWM 8,9,10. No entanto, a maioria desses construtos focaliza apenas a camada epitelial externa e não captura a complexidade da arquitetura do tecido nativo. Para uma compreensão mais detalhada dos mecanismos de transporte através do RWM, são necessários estudos ex vivo direcionados.
Neste estudo, demonstramos o explante de uma cobaia RWM com suporte ósseo circundante para preservar a integridade da membrana e ilustramos seu uso em um paradigma experimental desenhado para o estudo específico do transporte RWM de veículos de entrega de drogas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

A liberação eficiente e minimamente invasiva de fármacos na orelha interna é um grande desafio. A membrana da janela redonda (MRP), sendo um dos poucos pontos de entrada para a orelha interna, tornou-se um foco vital de investigação. No entanto, devido às complexidades do isolamento do RWM, nossa compreensão de sua farmacocinética permanece limitada. O RWM compreende três camadas distintas: o epitélio externo, a camada média de tecido conjuntivo e a camada epitelial interna, cada uma potencialmente possuindo propriedades de liberação únicas.
Os modelos atuais para investigar o transporte através do RWM utilizam modelos animais in vivo ou modelos RWM ex vivo que dependem de culturas de células ou fragmentos de membrana. As cobaias servem como um modelo pré-clínico validado para a investigação da farmacocinética de drogas na orelha interna e são um modelo animal importante para o desenvolvimento translacional de veículos de entrega para a cóclea. Neste estudo, descrevemos uma abordagem para explante de uma cobaia RWM com osso coclear circundante para experimentos de liberação de fármacos em bancada. Este método permite a preservação da arquitetura RWM nativa e pode fornecer uma representação mais realista das barreiras ao transporte do que os modelos atuais de bancada.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Autor em destaque: Extração da membrana da janela redonda de cobaia para facilitar a pesquisa de entrega de medicamentos no ouvido interno

Explante de membrana de janela redonda de cobaia para estudos ex vivo

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Como demonstrado na Figura 3A, este método permite o explante da membrana da janela redonda intacta da cobaia com um anel de osso rígido circundante. A RMP deve estar totalmente conectada circunferencialmente ao anel ósseo. Nenhuma fratura do osso coclear deve ser apreciada. Em comparação com espécimes humanos de janela redonda, a cobaia RWM não tem uma pseudomembrana sobrejacente. Além disso, ao contrário dos seres humanos, existe uma ponte óssea entre as cruras do estribo da coba...

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Este protocolo descreve um método para o explante da membrana da janela redonda de ossos temporais de cobaias, fornecendo um recurso valioso para estudos ex vivo .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Nosso grupo está investigando medicamentos e veículos de entrega de medicamentos para o tratamento de doenças do ouvido interno, como a perda auditiva. A membrana da janela redonda é a barreira crítica que impede que drogas aplicadas localmente entrem na cóclea e atualmente estamos trabalhando para entender como os veículos de entrega de nanopartículas podem ser projetados para passar por essa barreira. Entender como a membrana da janela redonda funciona em termos de transporte de drogas é crucial no desenvolvimento de estratégias eficazes de liberação de drogas para o ouvido.A cobaia é um importante modelo animal pré-clínico para estudar a liberação de drogas na orelha. No entanto, isolar essa frágil membrana, que tem apenas 17 mícrons de espessura, para estudos de transporte de fármacos continua sendo um desafio significativo. Aqui, descrevemos um método para extração da membrana da janela redonda da cobaia que permite estudos eficientes de transporte de drogas em bancada.As investigações atuais da liberação de fármacos para o ano interno baseiam-se principalmente em modelos experimentais in vivo seguidos de amostragem de perilinfa que não permitem um estudo específico e direcionado dos mecanismos de transporte da membrana da janela redonda. Neste estudo, demonstramos a extração da membrana da janela redonda da cobaia com suporte ósseo circundante. Este método preserva a integridade da arquitetura do tecido nativo e permite estudos precisos e direcionados da liberação de fármacos através da membrana da janela redonda.

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Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.