Name: В центре внимания автора: Экстракция мембраны круглого окна морской свинки для облегчения исследований по доставке лекарств во внутреннее ухо
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана грантами NIDCD No 1K08DC020780 и 5T32DC000027-33, а также Фондом исследований слуха им. Рубинштейна.

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (GP18M226). В настоящем исследовании использовались морские свинки-альбиносы Хартли (как самцы, так и самки, массой 500-700 г).
1. Настройка и подготовка процедуры
<ol><li>Перед нача?...

Морская свинка с круглым окном мембранная эксплантация

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

При локальной доставке лекарств в ухо RWM является основным путем прохождения терапевтических препаратов во внутреннее ухо. Для лучшего понимания механизмов транспортировки и проницаемости новых средств доставки и разработки лекарств необходима точная и надежная настольная модель. В...

Появились новые классы терапевтических средств для лечения нейросенсорной тугоухости. Трансляция этих терапевтических препаратов в клинические популяции ограничена безопасными и эффективными путями транспортировки во внутреннее ухо. Современные методы доставки in vivo в исследованиях на животных основаны либо на фенестрации во внутреннем ухе, либо на диффузии через мембрану круглого окна (RWM), бескостный барьер, который отделяет пространство среднего уха от улитки1.
Хирургическая фенестрация и микроинъекция во внутреннее ухо являются инвазивными и могут представлять опасность для остаточной функции внутреннего уха2. Таким образом, RWM является важным маршрутом для местной доставки лекарств, а морские свинки являются основной доклинической моделью на животных, используемой для изучения фармакокинетики местных лекарств в RWM и во внутреннем ухе для фармацевтических разработок 3,4. Несмотря на то, что морская свинка тоньше RWM, она имеет идентичную трехслойную структуру. Он имеет диаметр около 1 мм, толщину 15-25 мкм и состоит из двух слоев эпителиальных клеток, скрепляющих слой соединительной ткани5. Эпителиальный слой, обращенный к среднему уху, плотно упакован и соединен плотными соединениями, в то время как слой, обращенный к внутреннему уху и scala tympani, имеет более рыхлую архитектуру и не имеет значительных межклеточных спаек.
Современные доклинические исследования, изучающие лекарственную проницаемость RWM морских свинок, основаны на инъекциях в среднее ухо in vivo с последующим забором проб перилимфатической жидкости во внутреннем ухе, что не позволяет провести специфическое исследование транспорта RWM 6,7. Фрагменты эксплантов RWM использовались в доклинических исследованиях, но из-за своей хрупкости и небольшого размера они не подходят для систематических микрофлюидных исследований транспортировки лекарств и транспортных средств, требующих водонепроницаемого уплотнения через RWM2. Другие группы использовали модели in vitro с культивируемыми эпителиальными клетками человека, чтобы приблизиться к RWM 8,9,10. Тем не менее, большинство этих конструкций сосредоточены исключительно на внешнем эпителиальном слое и не отражают сложность архитектуры нативной ткани. Для более детального понимания механизмов транспортировки в RWM необходимы целевые исследования ex vivo.
В данном исследовании мы демонстрируем эксплантацию RWM морской свинки с окружающей костной опорой для сохранения целостности мембраны и иллюстрируем их использование в экспериментальной парадигме, предназначенной для специфического изучения RWM-транспорта транспортных средств доставки лекарств.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

Эффективная и минимально инвазивная доставка лекарств во внутреннее ухо представляет собой серьезную проблему. Мембрана круглого окна (RWM), являющаяся одной из немногих точек входа во внутреннее ухо, стала жизненно важным объектом исследований. Однако из-за сложностей выделения RWM наше понимание его фармакокинетики остается ограниченным. RWM состоит из трех отдельных слоев: наружного эпителия, среднего слоя соединительной ткани и внутреннего эпителиального слоя, каждый из которых потенциально обладает уникальными свойствами доставки.
Современные модели для исследования переноса через RWM используют модели животных in vivo или модели ex vivo RWM, которые полагаются на клеточные культуры или фрагменты мембран. Морские свинки служат валидированной доклинической моделью для исследования фармакокинетики лекарств во внутреннем ухе и являются важной животной моделью для трансляционной разработки средств доставки в улитку. В этом исследовании мы описываем подход к эксплантации RWM морской свинки с окружающей кохлеарной костью для экспериментов по настольной доставке лекарств. Этот метод позволяет сохранить исходную архитектуру RWM и может обеспечить более реалистичное представление транспортных барьеров по сравнению с текущими настольными моделями.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

В центре внимания автора: Экстракция мембраны круглого окна морской свинки для облегчения исследований по доставке лекарств во внутреннее ухо

Эксплантация мембраны с круглым окном морской свинки для исследований ex vivo

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Как показано на рисунке 3А, этот метод позволяет эксплантировать неповрежденную круглую оконную мембрану морской свинки с окружающим кольцом из жесткой кости. RWM должен быть полностью соединен с костным кольцом по окружности. Переломы кохлеарной кости не должны быть оц...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

В этом протоколе описывается метод эксплантации мембраны круглого окна из височных костей морских свинок, что является ценным ресурсом для исследований ex vivo .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Наша группа изучает лекарства и средства доставки лекарств для лечения заболеваний внутреннего уха, таких как потеря слуха. Мембрана с круглым окном является критическим барьером, который предотвращает попадание лекарств местного применения в улитку, и в настоящее время мы работаем над тем, чтобы понять, как можно спроектировать средства доставки наночастиц для прохождения через этот барьер. Понимание того, как работает мембрана с круглым окном с точки зрения транспортировки лекарств, имеет решающее значение для разработки эффективных стратегий доставки лекарств в ухо.Морская свинка является важной доклинической моделью на животных для изучения доставки лекарств в ухо. Тем не менее, изоляция этой хрупкой мембраны, толщина которой составляет всего 17 микрон, для исследований переноса лекарств остается серьезной проблемой. В этой статье мы опишем метод извлечения круглой оконной мембраны морской свинки, который позволяет проводить эффективные лабораторные исследования транспортировки наркотиков.Современные исследования доставки лекарств во внутренний год жизни основываются в основном на экспериментальных моделях in vivo с последующим взятием проб перилимфы, которые не позволяют провести специфическое и целенаправленное изучение механизмов транспортировки мембран через круглое окно. В этом исследовании мы демонстрируем извлечение круглой оконной мембраны морской свинки с окружающей костной поддержкой. Этот метод сохраняет целостность нативной тканевой архитектуры и позволяет проводить точные и целенаправленные исследования доставки лекарств через мембрану круглого окна.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.