Name: Autor destacado: Extracción de la membrana de ventana redonda de conejillo de indias para facilitar la investigación de la administración de fármacos en el oído interno
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones del NIDCD No. 1K08DC020780 y 5T32DC000027-33, y el Fondo de Investigación Auditiva Rubenstein.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (GP18M226). En el presente estudio se utilizaron cobayas albinas Hartley (machos y hembras, con un peso de 500-700 g).
1. Configuración y preparación del procedimiento
<ol><li>Esterilice todos los instrumentos con óxido de etileno antes de comenzar el experimento.</li>
	<li>Sacrificar a los animales siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente. NOTA: E...

Conejillo de Indias Explantación de membrana de ventana redonda

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

En la administración local de fármacos al oído, la RWM es la principal vía de paso para que la terapéutica llegue al oído interno. Se necesita un modelo de sobremesa preciso y fiable para comprender mejor los mecanismos de transporte y la permeabilidad a través de nuevos vehículos de administración y para el desarrollo de fármacos. En este estudio, demostramos que la explantación de RWM de cobaya es un procedimiento factible y confiable para permitir investigaciones sistemáticas de las interacciones fármaco-...

Han surgido nuevas clases de terapias para el tratamiento de la pérdida auditiva neurosensorial. La traslación de estas terapias a poblaciones clínicas está limitada por rutas seguras y eficaces de transporte al oído interno. Los métodos actuales de administración in vivo en estudios con animales se basan en la fenestración en el oído interno o en la difusión a través de la membrana de ventana redonda (RWM), una barrera no ósea que separa el espacio del oído medio de la cóclea1.
La fenestración quirúrgica y la microinyección en el oído interno son invasivas y pueden presentar riesgos para la función residual del oído interno2. Por lo tanto, la RWM es una ruta importante para la administración local de fármacos, y los conejillos de indias son el principal modelo animal preclínico utilizado para estudiar la farmacocinética local de fármacos en la RWM y en el oído interno para el desarrollo farmacéutico 3,4. Aunque es más delgado que el RWM humano, el conejillo de indias RWM comparte una estructura idéntica de tres capas. Tiene aproximadamente 1 mm de diámetro, 15-25 μm de espesor y está compuesto por dos capas de células epiteliales que intercalan una capa de tejido conectivo5. La capa epitelial que se enfrenta al oído medio está densamente empaquetada y conectada a través de uniones estrechas, mientras que la capa que se enfrenta al oído interno y al escalón del tímpano tiene una arquitectura más laxa y no tiene adherencias intercelulares significativas.
Los estudios preclínicos actuales que investigan la permeabilidad del fármaco en el RWM del conejillo de indias se basan en inyecciones in vivo en el oído medio seguidas de la toma de muestras del líquido perilinfático dentro del oído interno, lo que no permite el estudio específico del transporte de RWM 6,7. Los fragmentos de explantes de RWM se han utilizado en estudios preclínicos, pero debido a su fragilidad y pequeño tamaño, no son adecuados para investigaciones sistemáticas y microfluídicas de transporte de fármacos y vehículos que requieran un sello hermético a través del RWM2. Otros grupos han empleado modelos in vitro con células epiteliales humanas cultivadas para aproximarse a la RWM 8,9,10. Sin embargo, la mayoría de estas construcciones se centran únicamente en la capa epitelial externa y no capturan la complejidad de la arquitectura de los tejidos nativos. Para una comprensión más detallada de los mecanismos de transporte a través de la RWM, se requieren estudios ex vivo específicos.
En este estudio, demostramos la explantación de un RWM de cobaya con soporte óseo circundante para preservar la integridad de la membrana e ilustramos su uso en un paradigma experimental diseñado para el estudio específico del transporte de RWM de vehículos de administración de fármacos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

La administración eficiente y mínimamente invasiva de fármacos al oído interno es un desafío importante. La membrana de ventana redonda (RWM), al ser uno de los pocos puntos de entrada al oído interno, se ha convertido en un foco vital de investigación. Sin embargo, debido a las complejidades de aislar el RWM, nuestra comprensión de su farmacocinética sigue siendo limitada. El RWM comprende tres capas distintas: el epitelio externo, la capa de tejido conectivo medio y la capa epitelial interna, cada una de las cuales posee propiedades de administración únicas.
Los modelos actuales para investigar el transporte a través de la RWM utilizan modelos animales in vivo o modelos RWM ex vivo que se basan en cultivos celulares o fragmentos de membrana. Los conejillos de indias sirven como un modelo preclínico validado para la investigación de la farmacocinética de fármacos en el oído interno y son un modelo animal importante para el desarrollo traslacional de vehículos de administración a la cóclea. En este estudio, describimos un enfoque para la explantación de un RWM de conejillo de indias con hueso coclear circundante para experimentos de administración de fármacos en el laboratorio. Este método permite la preservación de la arquitectura RWM nativa y puede proporcionar una representación más realista de las barreras al transporte que los modelos de sobremesa actuales.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Autor destacado: Extracción de la membrana de ventana redonda de conejillo de indias para facilitar la investigación de la administración de fármacos en el oído interno

Explantación de membrana de ventana redonda de conejillo de indias para estudios ex vivo

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Como se demuestra en la Figura 3A, este método permite la explantación de la membrana de ventana redonda intacta del conejillo de indias con un anillo circundante de hueso rígido. El RWM debe estar completamente conectado circunferencialmente al anillo óseo. No se deben apreciar fracturas del hueso coclear. En comparación con los especímenes humanos de ventana redonda, el conejillo de indias RWM no tiene una pseudomembrana suprayacente. Además, a diferencia de los humanos, existe un p...

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Este protocolo describe un método para la explantación de la membrana de ventana redonda de huesos temporales de conejillos de indias, proporcionando un recurso valioso para estudios ex vivo .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Nuestro grupo está investigando medicamentos y vehículos de administración de medicamentos para el tratamiento de enfermedades del oído interno, como la pérdida de audición. La membrana de ventana redonda es la barrera crítica que impide que los fármacos aplicados localmente entren en la cóclea y actualmente estamos trabajando para comprender cómo se pueden diseñar los vehículos de administración de nanopartículas para que atraviesen esta barrera. Comprender cómo funciona la membrana de ventana redonda en términos de transporte de fármacos es crucial para desarrollar estrategias eficaces de administración de fármacos en el oído.El conejillo de indias es un modelo animal preclínico importante para estudiar la administración de fármacos al oído. Sin embargo, aislar esta frágil membrana, de solo 17 micras de grosor, para estudios de transporte de fármacos sigue siendo un reto importante. Aquí, describimos un método para extraer la membrana de la ventana redonda del conejillo de indias que permite estudios eficientes de transporte de fármacos en el laboratorio.Las investigaciones actuales sobre la administración de fármacos en el interior del año se basan principalmente en modelos experimentales in vivo seguidos de muestreos perilinfáticos que no permiten un estudio específico y dirigido de los mecanismos de transporte de la membrana de ventana redonda. En este estudio, demostramos la extracción de la membrana de la ventana redonda del conejillo de indias con soporte óseo circundante. Este método preserva la integridad de la arquitectura del tejido nativo y permite realizar estudios precisos y específicos de la administración de fármacos a través de la membrana de ventana redonda.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.