Name: Författare i fokus: Extraktion av marsvinsmembran med runt fönster för att underlätta forskning om läkemedelstillförsel i innerörat
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av NIDCD Grants No. 1K08DC020780 och 5T32DC000027-33 och Rubenstein Hearing Research Fund.

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albinomarsvin (både hanar och honor, som väger 500-700 g) användes i den aktuella studien.
1. Procedurinställning och förberedelse
<ol><li>Sterilisera alla instrument med etylenoxid innan experimentet påbörjas.</li>
	<li>Avliva djuren i enlighet med det institutionellt godkända protokollet. OBS: I den aktuella studien användes en icke-förladdad kammare för att släpp...

Marsvin Runt Fönster Membran Explantation

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

Vid lokal läkemedelstillförsel till örat är RWM den primära passagevägen för läkemedel att nå innerörat. En noggrann och tillförlitlig bänkmodell behövs för att bättre förstå transportmekanismer och permeabilitet i nya leveransfordon och för läkemedelsutveckling. I denna studie visar vi att RWM-explantation av marsvin är en genomförbar och pålitlig procedur för att möjliggöra systematiska undersökningar av läkemedels-membraninteraktioner. Lundman et al. och Kelso et al. har tidigare beskrivit a...

Nya klasser av terapier har dykt upp för behandling av sensorineural hörselnedsättning. Överföringen av dessa läkemedel till kliniska populationer begränsas av säkra och effektiva transportvägar till innerörat. Nuvarande metoder för in vivo-tillförsel i djurstudier bygger på antingen fenestration i innerörat eller diffusion genom det runda fönstermembranet (RWM), en icke-benös barriär som separerar mellanörats utrymme från cochlean1.
Kirurgisk fenestrering och mikroinjektion i innerörat är båda invasiva och kan innebära risker för kvarvarande innerörats funktion2. Därför är RWM en viktig väg för lokal läkemedelstillförsel, och marsvin är den primära prekliniska djurmodellen som används för att studera lokal läkemedelsfarmakokinetik över RWM och i innerörat för läkemedelsutveckling 3,4. Även om marsvins-RWM är tunnare än den mänskliga RWM:n har den en identisk treskiktsstruktur. Den är cirka 1 mm i diameter, 15-25 μm tjock och består av två epitelcellskikt som ligger intill ett bindvävsskikt5. Epitelskiktet som vetter mot mellanörat är tätt packat och sammankopplat via täta korsningar, medan skiktet som vetter mot innerörat och scala tympani har lösare arkitektur och inte har betydande intercellulära sammanväxningar.
Aktuella prekliniska studier som undersöker läkemedelspermeabilitet hos RWM hos marsvin bygger på injektioner i mellanörat in vivo följt av provtagning av perilymfvätskan i innerörat, vilket inte möjliggör den specifika studien av RWM-transport 6,7. Fragment av RWM-explantat har använts i prekliniska studier, men på grund av deras bräcklighet och lilla storlek är de inte lämpliga för systematiska, mikrofluidiska undersökningar av läkemedels- och fordonstransport som kräver en vattentät tätning över RWM2. Andra grupper har använt in vitro-modeller med odlade humana epitelceller för att approximera RWM 8,9,10. Majoriteten av dessa konstruktioner fokuserar dock enbart på det yttre epitelskiktet och fångar inte komplexiteten i den naturliga vävnadsarkitekturen. För en mer detaljerad förståelse av transportmekanismerna i RWM krävs riktade ex vivo-studier.
I denna studie demonstrerar vi explantationen av en marsvins-RWM med omgivande benstöd för att bevara membranintegriteten och illustrerar deras användning i ett experimentellt paradigm utformat för den specifika studien av RWM-transport av läkemedelsleveransfordon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

Effektiv och minimalt invasiv läkemedelstillförsel till innerörat är en stor utmaning. Det runda fönstermembranet (RWM), som är en av de få ingångarna till innerörat, har blivit ett viktigt fokus för forskning. På grund av komplexiteten i att isolera RWM är dock vår förståelse av dess farmakokinetik fortfarande begränsad. RWM består av tre distinkta lager: det yttre epitelet, det mellersta bindvävsskiktet och det inre epitelskiktet, som var och en potentiellt har unika leveransegenskaper.
Nuvarande modeller för att undersöka transport över RWM använder in vivo-djurmodeller eller ex vivo RWM-modeller som bygger på cellkulturer eller membranfragment. Marsvin fungerar som en validerad preklinisk modell för undersökning av läkemedelsfarmakokinetik i innerörat och är en viktig djurmodell för translationell utveckling av bärare till cochlean. I den här studien beskriver vi ett tillvägagångssätt för explantation av ett marsvin RWM med omgivande cochleaben för läkemedelstillförselexperiment. Denna metod gör det möjligt att bevara den ursprungliga RWM-arkitekturen och kan ge en mer realistisk representation av transporthinder än nuvarande stationära modeller.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Författare i fokus: Extraktion av marsvinsmembran med runt fönster för att underlätta forskning om läkemedelstillförsel i innerörat

Marsvin Membranexplantation med runda fönster för Ex Vivo-studier

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Som visas i figur 3A gör denna metod det möjligt att explantationera det intakta runda fönstermembranet hos marsvin med en omgivande ring av styvt ben. RWM ska vara helt ansluten till den beniga ringen omkrets. Inga frakturer på cochleabenet bör uppskattas. I jämförelse med mänskliga exemplar med runda fönster har marsvin RWM inget överliggande pseudomembran. Dessutom, till skillnad från människor, finns det en benig bro mellan marsvinsstapes, vilket kräver sprickbildning och av...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Detta protokoll beskriver en metod för explantation av det runda fönstermembranet från marsvins tinningben, vilket ger en värdefull resurs för ex vivo-studier .

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Vår grupp undersöker läkemedel och läkemedelsbärare för behandling av sjukdomar i innerörat som hörselnedsättning. Det runda fönstermembranet är den kritiska barriär som hindrar lokalt applicerade läkemedel från att komma in i cochlean och vi arbetar för närvarande med att förstå hur bärare av nanopartiklar kan konstrueras för att passera genom denna barriär. Att förstå hur det runda fönstermembranet fungerar när det gäller läkemedelstransport är avgörande för att utveckla effektiva strategier för läkemedelstillförsel till örat.Marsvin är en viktig preklinisk djurmodell för att studera läkemedelstillförsel till örat. Att isolera detta ömtåliga membran, som bara är 17 mikrometer tjockt, för läkemedelstransportstudier är dock fortfarande en stor utmaning. Här beskriver vi en metod för att extrahera marsvinets runda fönstermembran som möjliggör effektiva läkemedelstransportstudier på bänkskiva.Nuvarande undersökningar av läkemedelstillförsel till det inre året förlitar sig främst på experimentella modeller in vivo följt av perilymfprovtagning som inte tillåter en specifik och riktad studie av membrantransportmekanismer med runda fönster. I den här studien demonstrerar vi extraktionen av marsvinets runda fönstermembran med omgivande benstöd. Denna metod bevarar den naturliga vävnadsarkitekturens integritet och möjliggör exakta och riktade studier av läkemedelstillförsel över det runda fönstermembranet.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.