Name: Yazar Spot Işığı: İç Kulak İlaç Dağıtım Araştırmasını Kolaylaştırmak İçin Kobay Yuvarlak Pencere Zarının Çıkarılması
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Bu çalışma kısmen NIDCD Hibeleri No. 1K08DC020780 ve 5T32DC000027-33 ve Rubenstein İşitme Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (GP18M226) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada Hartley albino kobayları (hem erkek hem de dişi, 500-700 g ağırlığında) kullanıldı.
1. Prosedür kurulumu ve hazırlığı
<ol><li>Deneye başlamadan önce tüm aletleri etilen oksit ile sterilize edin.</li>
	<li>Kurumsal olarak onaylanmış protokolü izleyerek hayvanlara ötenazi yapın. NOT: Bu çalışmada, ticari bir silindirden% 10...

Gine Domuzu Yuvarlak Pencere Membran Eksplantasyonu

<ol>
	<li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery:+our+own+findings+and+literature+review.">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li><li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane.">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li><li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear:+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications.">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li><li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+delivery:+Challenges+and+opportunities.">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li><li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane.">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li><li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery.">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li><li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs.">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li><li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations.">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs.">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li><li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles:+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant.">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li><li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals:+2020+Edition.">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li><li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li><li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone.">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li><li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes.">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).</li><li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery).">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li><li>Lundman, L., Bagger-Sj&#246;b&#228;ck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model.">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li><li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model.">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789 (2023).</li><li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane.">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).</li><li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL.">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).</li></ol>

Kulağa lokal ilaç dağıtımında, RWM, terapötiklerin iç kulağa ulaşması için birincil geçiş yoludur. Yeni dağıtım araçlarında taşıma mekanizmalarını ve geçirgenliği daha iyi anlamak ve ilaç geliştirme için doğru ve güvenilir bir tezgah üstü modele ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, kobay RWM eksplantasyonunun, ilaç-membran etkileşimlerinin sistematik olarak araştırılmasına izin vermek için uygulanabilir ve güvenilir bir prosedür olduğunu gösterdik. Lundman ve ark. ve Kelso ve ark....

Sensörinöral işitme kaybının tedavisi için yeni terapötik sınıflar ortaya çıkmıştır. Bu terapötiklerin klinik popülasyonlara çevrilmesi, iç kulağa güvenli ve etkili taşıma yolları ile sınırlıdır. Hayvan çalışmalarında mevcut in vivo uygulama yöntemleri, ya iç kulağa fenestrasyona ya da orta kulak boşluğunu kokleadan ayıran kemik olmayan bir bariyer olan yuvarlak pencere zarından (RWM) difüzyona dayanır1.
Cerrahi pencere ve iç kulağa mikroenjeksiyon hem invazivdir hem de rezidüel iç kulak fonksiyonu için risk oluşturabilir2. Bu nedenle, RWM, yerel ilaç dağıtımı için önemli bir yoldur ve kobaylar, farmasötik geliştirme için RWM boyunca ve iç kulakta yerel ilaç farmakokinetiğini incelemek için kullanılan birincil klinik öncesi hayvan modelidir 3,4. İnsan RWM'sinden daha ince olmasına rağmen, kobay RWM aynı üç katmanlı yapıyı paylaşır. Yaklaşık 1 mm çapında, 15-25 μm kalınlığındadır ve bir bağ dokusu tabakasını5 sandviçleyen iki epitel hücre tabakasından oluşur. Orta kulağa bakan epitel tabakası yoğun bir şekilde paketlenir ve sıkı bağlantılarla bağlanırken, iç kulağa bakan tabaka ve skala timpani daha gevşek bir mimariye sahiptir ve önemli hücreler arası yapışıklıklara sahip değildir.
Kobay RWM'de ilaç geçirgenliğini araştıran mevcut klinik öncesi çalışmalar, in vivo orta kulak enjeksiyonlarına ve ardından iç kulaktaki perilenf sıvısının örneklenmesine dayanmaktadır, bu da RWM transportunun spesifik çalışmasına izin vermemektedir 6,7. RWM eksplantlarının fragmanları klinik öncesi çalışmalarda kullanılmıştır, ancak kırılganlıkları ve küçük boyutları nedeniyle, RWM2 boyunca su geçirmez bir sızdırmazlık gerektiren ilaç ve araç taşımacılığının sistematik, mikroakışkan araştırmaları için uygun değildirler. Diğer gruplar, RWM 8,9,10'a yaklaşmak için kültürlenmiş insan epitel hücreleri ile in vitro modeller kullanmışlardır. Bununla birlikte, bu yapıların çoğu yalnızca dış epitel tabakasına odaklanır ve doğal doku mimarisinin karmaşıklığını yakalamaz. RWM boyunca taşıma mekanizmalarının daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması için, hedefli, ex vivo çalışmalar gereklidir.
Bu çalışmada, membran bütünlüğünü korumak için bir kobay RWM'nin çevreleyen kemik desteği ile eksplantasyonunu gösteriyoruz ve ilaç dağıtım araçlarının RWM taşınmasının spesifik çalışması için tasarlanmış deneysel bir paradigmada kullanımlarını gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>1SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>2SD-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm Diamond Ball Drill Bit</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>6D-G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td>
			<td>Anspach</td>
			<td>EMAX2PLUS</td>
			<td>Any bone cutting drilling system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Co.&#160;</td>
			<td>382903057894</td>
			<td>Any 27-28 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gorilla Epoxy</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>4200101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-CAST</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guinea pig round window membrane explantation for ex vivo studies

İç kulağa etkili ve minimal invaziv ilaç iletimi önemli bir zorluktur. İç kulağa birkaç giriş noktasından biri olan yuvarlak pencere membranı (RWM), araştırmaların hayati bir odağı haline gelmiştir. Bununla birlikte, RWM'yi izole etmenin karmaşıklığı nedeniyle, farmakokinetiği hakkındaki anlayışımız sınırlı kalmaktadır. RWM üç farklı katmandan oluşur: dış epitel, orta bağ dokusu katmanı ve iç epitel katmanı, her biri potansiyel olarak benzersiz dağıtım özelliklerine sahiptir.
RWM boyunca taşınmayı araştırmak için mevcut modeller, hücre kültürlerine veya membran parçalarına dayanan in vivo hayvan modellerini veya ex vivo RWM modellerini kullanır. Gine domuzları, iç kulaktaki ilaç farmakokinetiğinin araştırılması için doğrulanmış bir klinik öncesi model olarak hizmet eder ve kokleaya dağıtım araçlarının translasyonel gelişimi için önemli bir hayvan modelidir. Bu çalışmada, bir kobay RWM'nin tezgah üstü ilaç salım deneyleri için çevresindeki koklear kemik ile eksplantasyonuna yönelik bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu yöntem, yerel RWM mimarisinin korunmasına izin verir ve mevcut tezgah üstü modellere göre taşıma engellerinin daha gerçekçi bir temsilini sağlayabilir.

Novel classes of therapeutics have emerged for the treatment of sensorineural hearing loss. The translation of these therapeutics to clinical populations is limited by safe and efficacious routes of transport into the inner ear. Current methods of in vivo delivery in animal studies rely on either fenestration into the inner ear or diffusion through the round window membrane (RWM), a non-osseous barrier that separates the middle ear space from the cochlea1.
Surgical fenestration and microinjection into the inner ear are both invasive and can pose risks to residual inner ear function2. Therefore, the RWM is an important route for local drug delivery, and guinea pigs are the primary preclinical animal model used to study local drug pharmacokinetics across the RWM and in the inner ear for pharmaceutical development3,4. Although thinner than the human RWM, the guinea pig RWM shares an identical three-layered structure. It is approximately 1 mm in diameter, 15-25 &#181;m thick, and comprised of two epithelial cell layers sandwiching a connective tissue layer5. The epithelial layer facing the middle ear is densely packed and connected via tight junctions, while the layer facing the inner ear and scala tympani has looser architecture and does not have significant intercellular adhesions.
Current pre-clinical studies investigating drug permeability in the guinea pig RWM rely on in vivo middle ear injections followed by the sampling of the perilymph fluid within the inner ear, which does not allow for the specific study of RWM transport6,7. Fragments of RWM explants have been used in preclinical studies, but due to their fragility and small size, they are not suitable for systematic, microfluidic investigations of drug and vehicle transport requiring a watertight seal across the RWM2. Other groups have employed in vitro models with cultured human epithelial cells to approximate the RWM8,9,10. However, the majority of these constructs focus solely on the outer epithelial layer and do not capture the complexity of native tissue architecture. For a more detailed understanding of transport mechanisms across the RWM, targeted, ex vivo studies are required.
In this study, we demonstrate the explantation of a guinea pig RWM with surrounding bony support to preserve membrane integrity and illustrate their use in an experimental paradigm designed for the specific study of the RWM transport of drug delivery vehicles.

Yazar Spot Işığı: İç Kulak İlaç Dağıtım Araştırmasını Kolaylaştırmak İçin Kobay Yuvarlak Pencere Zarının Çıkarılması

Ex Vivo Çalışmalar için Gine Domuzu Yuvarlak Pencere Membran Eksplantasyonu

Our group is investigating drugs and drug delivery vehicles for the treatment of inner ear diseases such as hearing loss. The round window membrane is the critical barrier that prevents locally applied drugs from getting into the cochlea and we're currently working to understand how nanoparticle delivery vehicles can be engineered to pass through this barrier. Understanding how the round window membrane works in terms of drug transport is crucial in developing effective drug delivery strategies to the ear.Guinea pig is an important preclinical animal model for studying drug delivery to the ear. However, isolating this fragile membrane, which is only 17 microns thick, for drug transport studies remains a significant challenge. Here, we describe a method for extracting the guinea pig round window membrane that allows for efficient bench top drug transport studies.Current investigations of drug delivery to the inner year rely primarily on in vivo experimental models followed by perilymph sampling which do not allow for a specific and targeted study of round window membrane transport mechanisms. In this study, we demonstrate the extraction of the guinea pig round window membrane with surrounding bony support. This method preserves native tissue architecture integrity and allows for precise and targeted studies of drug delivery across the round window membrane.

Şekil 3A'da gösterildiği gibi, bu yöntem, bozulmamış kobay yuvarlak pencere zarının, çevreleyen bir sert kemik halkası ile eksplantasyonuna izin verir. RWM, kemiksi halkaya çevresel olarak tam olarak bağlanmalıdır. Koklear kemik kırığı görülmemelidir. İnsan yuvarlak pencere örnekleriyle karşılaştırıldığında, kobay RWM'nin üzerinde bir psödomembran yoktur. Ek olarak, insanlardan farklı olarak, kobay stapeslerinin crura'sı arasında, stapes üst yapısının ?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Extraction of Guinea Pig Round Window Membrane to Facilitate Inner Ear Drug Delivery Research at JoVE.com

Bu protokol, kobay temporal kemiklerinden yuvarlak pencere zarının eksplantasyonu için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir ve ex vivo çalışmalar için değerli bir kaynak sağlar.

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Grubumuz, işitme kaybı gibi iç kulak hastalıklarının tedavisi için ilaçları ve ilaç dağıtım araçlarını araştırmaktadır. Yuvarlak pencere membranı, lokal olarak uygulanan ilaçların kokleaya girmesini önleyen kritik bir bariyerdir ve şu anda nanopartikül dağıtım araçlarının bu bariyerden geçecek şekilde nasıl tasarlanabileceğini anlamak için çalışıyoruz. Yuvarlak pencere zarının ilaç taşınması açısından nasıl çalıştığını anlamak, kulağa etkili ilaç verme stratejileri geliştirmede çok önemlidir.Gine domuzu, kulağa ilaç dağıtımını incelemek için önemli bir klinik öncesi hayvan modelidir. Bununla birlikte, sadece 17 mikron kalınlığındaki bu kırılgan zarın ilaç taşıma çalışmaları için izole edilmesi önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, verimli tezgah üstü ilaç taşıma çalışmalarına izin veren kobay yuvarlak pencere zarının çıkarılması için bir yöntem açıklıyoruz.İç yıla ilaç dağıtımına ilişkin mevcut araştırmalar, öncelikle in vivo deneysel modellere ve ardından yuvarlak pencere zarı taşıma mekanizmalarının spesifik ve hedefli bir çalışmasına izin vermeyen perilenf örneklemesine dayanmaktadır. Bu çalışmada, kobay yuvarlak pencere zarının çevresindeki kemiksi destekle ekstraksiyonunu gösterdik. Bu yöntem, doğal doku mimarisi bütünlüğünü korur ve yuvarlak pencere zarı boyunca ilaç dağıtımının kesin ve hedefli çalışmalarına izin verir.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry points to the inner ear, has become a vital focus of investigation. However, due to the complexities of isolating the RWM, our understanding of its pharmacokinetics remains limited. The RWM comprises three distinct layers: the outer epithelium, the middle connective tissue layer, and the inner epithelial layer, each potentially possessing unique delivery properties.
Current models for investigating transport across the RWM utilize in vivo animal models or ex vivo RWM models which rely on cell cultures or membrane fragments. Guinea pigs serve as a validated preclinical model for the investigation of drug pharmacokinetics within the inner ear and are an important animal model for the translational development of delivery vehicles to the cochlea. In this study, we describe an approach for explantation of a guinea pig RWM with surrounding cochlear bone for benchtop drug delivery experiments. This method allows for preservation of native RWM architecture and may provide a more realistic representation of barriers to transport than current benchtop models.

This protocol outlines a method for the explantation of the round window membrane from guinea pig temporal bones, providing a valuable resource for ex vivo studies.