Name: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في الكشف المتعدد عن فيروسات الجهاز التنفسي
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية من خلال التمويل الأساسي والتحدي الوطني الكبير (NTGC) ل SMH.

1. تق البلمرة التعبير والتنقية
<ol><li>بناء البلازميد مع علامة سداسية الهستيدين قابلة للانقسام في المحطة C للإنزيم.</li>
	<li>قم بتحويل 50 نانوغرام من متجه التعبير إلى سلالة E. coli BL21- (DE3) باتباع البروتوكول القياسي38.</li>
	<li>قم بتلقيح الخلايا المحولة في أربع قوارير سعة 6 لتر ت?...

مقايسة RT-qPCR متعددة الإرسال للكشف عن فيروسات الجهاز التنفسي

هناك عبء اقتصادي ثقيل على نظام الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ناتج عن ارتفاع معدلات العدوى والوفيات بسبب انتشار فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة مثل SARS-CoV-2 و Influenza A / B ومتغيرات MERS-CoV12،19،20. بدافع من الشعور بالمسؤولية تجاه تخفيف هذا العب?...

تنجم جائحة مرض فيروس كورونا المستمر 2019 (COVID-19) عن فيروس كورونا الجديد المعروف باسم فيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) 1. نظرا للعدوى القوية ل SAR-CoV-2 وقدرتها على الانتقال السريع ، ظهر جائحة COVID-19 في مدينة ووهان ، الصين ، وانتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم. أدى هذا في النهاية إلى ظهور علامات الضائقة التنفسية وحتى الموت2،3،4. تم إعلان COVID-19 جائحة في أكثر من 213 دولة ، متوقعا زيادة حادة في عدد الحالات المؤكدة ، كما يتضح من الأوراق المنشورة في دراسات بحثية مختلفة 3,5. ينتقل COVID-19 بشكل أساسي عن طريق قطرات الجهاز التنفسي الصغيرة التي يطلقها الأفراد المصابون في البيئة ثم يتعرضون للأفراد الضعفاء من خلال الاستنشاق أو الاتصال الوثيق بالأسطح الملوثة. عندما تتلامس هذه القطرات مع الغشاء المخاطي للعينين أو الفم أو الأنف ، قد يصاب الشخصبالعدوى 6. تظهر الإحصاءات الصادرة عن منظمة الصحة العالمية (WHO) أن هناك أكثر من 76 مليون حالة مؤكدة للوباء في جميع أنحاء العالم ، مع 7 ملايين حالة وفاةمذهلة 7. وهكذا، صنفت الأمم المتحدة الوباء الناجم عن مرض كوفيد-19 على أنه كارثة بسبب تأثيره المباشر على حياة مليارات الأشخاص حول العالم وكان له آثار اقتصادية وبيئية واجتماعية بعيدة المدى.
وقد ثبت أن مبادرات الصحة العمومية، بما في ذلك الاختبار الشامل، والكشف المبكر، وتتبع المخالطين، وعزل الحالات حاسمة في إبقاء هذا الوباء تحت السيطرة8،9،10،11. ستزيد أشهر الشتاء من تداول فيروسات الجهاز التنفسي الأخرى مثل الأنفلونزا A و B مع أعراض تشبه COVID-19 مما يجعل من الصعب تحديد حالات COVID-19 وتعقبها وعزلها في وقت مبكر. كل عام ، يبدأ تفشي الأنفلونزا A و B في أواخر الخريف أو أوائل يناير مع موسمية يمكن التنبؤ بها12. تشترك فيروسات SARS-CoV-2 وفيروسات الأنفلونزا في العديد من السمات الوبائية. إلى جانب ذلك ، تقاسم أوجه التشابه في السكان المعرضين للإصابة والتي تشمل الأطفال وكبار السن ونقص المناعة والأفراد الذين يعانون من أمراض مصاحبة مزمنة مثل الربو أو مرض الانسداد الرئوي المزمن أو الفشل القلبي والكلوي أو مرض السكري12,13. ولا تشترك هذه الفيروسات في الفئات السكانية الضعيفة فحسب، بل تشترك أيضا في طرق انتقال الاتصال والرذاذ التنفسي14. من المتوقع أن يصاب المرضى على الأرجح بأكثر من واحد من فيروسات الجهاز التنفسي هذه مع اقتراب موسم الأنفلونزا14. لذلك ، يجب إجراء فحص SARS-CoV-2 وفيروسات الأنفلونزا على المرضى الذين تظهر عليهم الأعراض قبل عزلهم. لا يمكن إجراء اختبارات منفصلة للفيروسات الثلاثة (SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B) بسبب النقص العالمي في الموارد اللازمة لاستخراج الحمض النووي وتشخيصه. من أجل فحصها جميعا في تفاعل واحد ، يجب تطوير طريقة أو اختبار.
متلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS) -CoV هي أحد أفراد عائلة فيروس كورونا البشري (CoV). وجاءت أولى حالات عزل فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية من مريض أدخل المستشفى في المملكة العربية السعودية وتوفي في أيلول/ سبتمبر 2012 بسبب مشاكل تنفسيةحادة15. وهناك بينات تشير إلى أن الجمال العربية هي موطن المستودع البارز لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. لقد ثبت أن الفيروسات من الجمال العربية المصابة هي حيوانية المنشأ وبالتالي يمكن أن تصيب البشر16,17. يمكن للبشر المصابين بهذا الفيروس أن ينشروه للآخرين من خلال الاتصال الوثيق18. وحتى 26 كانون الثاني/يناير 2018، كانت هناك 2143 حالة مؤكدة مختبريا للإصابة بعدوى فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية، بما في ذلك 750 حالة وفاة على مستوىالعالم 19 حالة. والأعراض الأكثر شيوعا للإصابة بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية هي السعال والحمى وضيق التنفس. كما أبلغ عن ظهور أعراض الالتهاب الرئوي والإسهال وأمراض الجهاز الهضمي20 عدوى بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. ولا يتوفر حاليا لقاح تجاري أو علاج محدد لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. ولذلك، فإن التشخيص الفوري والدقيق ضروري للوقاية من فاشيات فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية على نطاق واسع والتمييز بين فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ومرض كورونا-سارس-2.
حتى الآن ، تم اقتراح العديد من الأساليب للكشف عن هذه الفيروسات مثل تعدد الإرسال RT-PCR21،22،23،24،25 ، CRISPR / Cas1226،27 ، CRISPR / Cas928 ، و CRISPR / Cas329 ، المقايسة المناعية للتدفق الجانبي30 ، المستشعرات الجزيئية الحيويةالورقية 31 ، اختبار شيرلوك في وعاء واحد32 ، أبتامير الحمض النووي33 ، متساوي الحرارة بوساطة الحلقة التضخيم (LAMP) 19،34 ، إلخ. كل طريقة من الطرق المذكورة أعلاه لها مزايا وعيوب فريدة من حيث الحساسية والخصوصية. من بين هذه الطرق ، الاختبار القائم على تضخيم الحمض النووي: متعدد الإرسال qRT-PCR ، هو الأكثر شيوعا ويعتبر المعيار الذهبي لتشخيص SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV.
في هذه الدراسة ، قمنا بتصميم وتقييم مجموعات وتحقيقات أولية مختلفة للكشف الفعال والدقيق والمتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي الاصطناعي الملتوي القياسي. وتوصي منظمة الصحة العالمية بإجراء المقايسات المتعددة الإرسال التي وضعت إما للجينات المستهدفة لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية أو لفيروس كورونا-سارس-2. وتشفر هذه الجينات عموما البروتينات والمعقدات التي تسهم في تكوين مركب النسخ المتماثل/النسخ (RTC)35 مثل المنطقة داخل إطار القراءة المفتوح 1a (ORF1a) المستخدم في مقايسة فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تشفير البروتينات الهيكلية بواسطة الجينات المستخدمة في المقايسات التشخيصية مثل منطقة المنبع لجين المغلف (upE) وجين nucleocapsid (N) اللذين يستخدمان في مقايسات فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية و SARS-Cov-2 ، على التوالي35,36. استخدمنا مجموعة R3T الداخلية ذات الخطوة الواحدة RT-qPCR لإنشاء RT-qPCR للكشف عن الفيروسات37. تم اختبار وتقييم الكشف عن الفيروسات والحساسية والنوعية والنطاق الديناميكي لمجموعة R3T RT-qPCR ذات الخطوة الواحدة ومجموعات التمهيدي باستخدام التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف للحمض النووي الريبي الاصطناعي الملتوي القياسي. كان أدنى حد للكشف العملي حوالي 10 نسخ نسخ لكل تفاعل. ونتيجة لذلك، يمكن استخدام مجموعة R3T RT-qPCR الداخلية ذات الخطوة الواحدة ومجموعات التمهيدي/المسبار وتنفيذها بنجاح من أجل التشخيص المتزامن الروتيني لفيروس كورونا-سارس-2 والأنفلونزا A والأنفلونزا B وفيروس كورونا-سارس-2 وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

يشكل فيروس كورونا 2 المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) تهديدا خطيرا لصحة عامة الناس. خلال مواسم الأنفلونزا ، قد يتسبب انتشار SARS-CoV-2 وفيروسات الجهاز التنفسي الأخرى في عبء أمراض الجهاز التنفسي على مستوى السكان يصعب إدارته. لذلك، ستحتاج فيروسات الجهاز التنفسي SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا B ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV) إلى مراقبة دقيقة في فصلي الخريف والشتاء المقبلين، لا سيما في حالة SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B، التي تشترك في عوامل وبائية مماثلة مثل السكان المعرضين للإصابة وطريقة الانتقال والمتلازمات السريرية. بدون مقايسات محددة الهدف ، قد يكون من الصعب التمييز بين حالات هذه الفيروسات بسبب أوجه التشابه بينها. وفقا لذلك ، فإن مقايسة تعدد الإرسال الحساسة والمستهدفة التي يمكن أن تفرق بسهولة بين هذه الأهداف الفيروسية ستكون مفيدة لممارسي الرعاية الصحية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير اختبار قائم على النسخ العكسي في الوقت الفعلي باستخدام مجموعة R3T بخطوة واحدة RT-qPCR المطورة داخليا للكشف المتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV. مع ما لا يقل عن 10 نسخ من الحمض النووي الريبي الاصطناعي ، يمكننا تحديد أهداف SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV بنجاح في وقت واحد بدقة 100٪. تم العثور على هذا الفحص ليكون دقيقا وموثوقا وبسيطا وحساسا ومحددا. يمكن استخدام الطريقة المطورة كاختبار تشخيصي محسن ل SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV في المستشفيات والمراكز الطبية ومختبرات التشخيص وكذلك لأغراض البحث.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في الكشف المتعدد عن فيروسات الجهاز التنفسي 

تطوير مقايسات RT-qPCR متعددة الإرسال في الوقت الحقيقي للكشف عن SARS-CoV-2 وأنفلونزا A / B و MERS-CoV

في السنوات الأخيرة ، كان هناك تقدم كبير في النهج التشخيصي للكشف عن فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة باستخدام نهج تفاعل البوليميراز المتسلسل21،22،23،24،25. ومع ذلك، وعلى الرغم من هذه التطورات، فإن النهج ال...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

نقدم مجموعتين داخليتين من RT-qPCR بخطوة واحدة قائمة على المسبار لفيروسات الجهاز التنفسي الشائعة. الفحص الأول هو ل SARS-CoV-2 (N) ، والإنفلونزا A (H1N1 و H3N2) ، والإنفلونزا B. والثاني هو ل SARS-Cov-2 (N) و MERS (UpE و ORF1a). يمكن تنفيذ هذه المقايسات بنجاح في أي مختبر متخصص.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%