Name: Auteur in de schijnwerpers: Vooruitgang in multiplexdetectie van respiratoire virussen
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology door middel van kernfinanciering en de National Term Grand Challenge (NTGC) aan SMH.

1. Taq-polymerase-expressie en -zuivering
<ol><li>Construeer een plasmide met een splitsbare hexa-histidine-tag aan de C-terminus van het enzym.</li>
	<li>Transformeer 50 ng van de expressievector in E. coli BL21-(DE3)-stam volgens het standaardprotocol38.</li>
	<li>Inoculeer de getransformeerde cellen in vier kolven van 6 l met elk 2 l 2YT-mediabouillon bij 37 °C en schud bij 170 omw/min totdat de OD 600 van 0,8 of celnummer 6,4 x10,8 is bereikt.</li>
	<li>...

Multiplex RT-qPCR-test voor detectie van respiratoire virussen

Er is wereldwijd een zware economische last voor het gezondheidszorgsysteem als gevolg van de hoge infectie- en sterftecijfers als gevolg van de verspreiding van veel voorkomende respiratoire virussen zoals SARS-CoV-2, Influenza A/B en MERS-CoV-varianten 12,19,20. Gemotiveerd door het verantwoordelijkheidsgevoel om deze last te verlichten, realiseerden we ons de noodzaak van een snelle, nauwkeurige en toegankelijke diagnostische...

De pandemie van de aanhoudende coronavirusziekte 2019 (COVID-19) wordt veroorzaakt door het nieuwe coronavirus dat bekend staat als het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Vanwege de sterke besmettelijkheid van SAR-CoV-2 en het vermogen tot snelle overdracht, ontstond de COVID-19-pandemie in Wuhan City, China, en verspreidde zich snel over de hele wereld. Dit leidde uiteindelijk tot het begin van tekenen van ademnood en zelfs de dood 2,3,4. COVID-19 is in meer dan 213 landen uitgeroepen tot pandemie, waarbij een sterke toename van het aantal bevestigde gevallen wordt verwacht, zoals blijkt uit de artikelen die door verschillende onderzoeken zijn gepubliceerd 3,5. COVID-19 wordt voornamelijk overgedragen door kleine ademhalingsdruppeltjes die geïnfecteerde personen in het milieu afgeven en vervolgens worden blootgesteld aan kwetsbare personen door inademing of nauw contact met besmette oppervlakken. Wanneer deze druppeltjes in contact komen met het slijmvlies van de ogen, mond of neus, kan een persoon besmet raken6. Uit statistieken van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) blijkt dat er wereldwijd meer dan 76 miljoen bevestigde gevallen van de pandemie zijn geweest, met maar liefst 7 miljoen doden7. Zo classificeerden de Verenigde Naties de pandemie veroorzaakt door de ziekte COVID-19 als een ramp vanwege de directe impact op het leven van miljarden mensen over de hele wereld en had verstrekkende economische, ecologische en sociale gevolgen.
Initiatieven op het gebied van de volksgezondheid, waaronder grondige tests, vroege opsporing, contactopsporing en isolatie van gevallen, blijken allemaal cruciaal te zijn om deze pandemie onder controle te houden 8,9,10,11. De wintermaanden zullen de circulatie van andere respiratoire virussen zoals Influenza A en B met COVID-19-achtige symptomen verhogen, waardoor het moeilijk wordt om COVID-19-gevallen in een vroeg stadium te identificeren, op te sporen en te isoleren. Elk jaar begint de uitbraak van influenza A en B in de late herfst of begin januari met een voorspelbare seizoensgebondenheid12. Talrijke epidemiologische kenmerken worden gedeeld door SARS-CoV-2- en influenzavirussen. Bovendien delen ze overeenkomsten in de vatbare populaties, waaronder kinderen, ouderen, immuungecompromitteerden en personen met chronische comorbiditeiten zoals astma, chronische obstructieve longziekte, hart- en nierfalen of diabetes12,13. Deze virussen delen niet alleen kwetsbare populaties, maar ook transmissieroutes van contact en ademhalingsdruppeltjes14. Verwacht wordt dat patiënten waarschijnlijk meer dan één van deze respiratoire virussen kunnen oplopen naarmate het griepseizoennadert 14. Daarvoor moet de screening van SARS-CoV-2 en de influenzavirussen worden uitgevoerd op symptomatische patiënten voordat ze worden geïsoleerd. Het uitvoeren van afzonderlijke tests voor de drie virussen (SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B) is niet mogelijk vanwege het wereldwijde gebrek aan middelen voor nucleïnezuurextractie en diagnostiek. Om ze allemaal in één reactie te screenen, moet een methode of test worden ontwikkeld.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is een familielid van het menselijke coronavirus (CoV). De eerste isolaten van het MERS-CoV-virus waren afkomstig van een gehospitaliseerde patiënt in Saoedi-Arabië die in september 2012 was overleden als gevolg van acute ademhalingsproblemen. Er zijn aanwijzingen dat dromedariskamelen een prominente reservoirgastheer voor MERS-CoV zijn. Het is bewezen dat virussen van geïnfecteerde dromedariskamelen zoönotisch zijn en dus mensen kunnen infecteren16,17. Mensen die met dit virus zijn besmet, kunnen het via nauw contact naar anderen verspreiden18. Op 26 januari 2018 waren er 2143 laboratoriumbevestigde gevallen van MERS-CoV-infectie, waaronder 750 sterfgevallen wereldwijd. De meest typische MERS-CoV-symptomen zijn hoesten, koorts en kortademigheid. Er is ook gemeld dat MERS-CoV-infecties symptomen van longontsteking, diarree en gastro-intestinale misselijkheid vertonen20. Momenteel is er geen commercieel vaccin of specifieke behandeling voor MERS-CoV beschikbaar. Daarom is een snelle en nauwkeurige diagnose essentieel om de wijdverbreide MERS-CoV-uitbraken te voorkomen en MERS-CoV te onderscheiden van de ziekte SARS-CoV-2.
Tot op heden zijn er veel benaderingen voorgesteld om deze virussen te detecteren, zoals multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 en CRISPR/Cas329, laterale flow-immunoassay30, op papier gebaseerde biomoleculaire sensoren31, SHERLOCK-testen in één pot32, DNA-aptameer 33, lusgemedieerde isotherme versterking (LAMP)19,34, enz. Elk van de bovengenoemde methoden heeft unieke voor- en nadelen op het gebied van gevoeligheid en specificiteit. Van deze methoden is de op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde test: multiplex qRT-PCR, de meest voorkomende en wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en MERS-CoV.
In deze studie hebben we verschillende primercombinaties en sondes ontworpen en beoordeeld voor de effectieve, nauwkeurige en gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV met behulp van standaard twist synthetische virale RNA's. De gemultiplexte tests die zijn ontwikkeld voor MERS-CoV- of SARS-CoV-2-doelgenen worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze genen coderen over het algemeen voor eiwitten en complexen die bijdragen aan de vorming van een replicatie/transcriptiecomplex (RTC)35, zoals het gebied binnen het open leesframe 1a (ORF1a) dat wordt gebruikt voor de MERS-CoV-test. Bovendien worden structurele eiwitten gecodeerd door de genen die worden gebruikt in diagnostische tests, zoals het stroomopwaartse gebied van het envelopgen (upE) en het nucleocapside-gen (N) die worden gebruikt voor respectievelijk MERS-CoV- en SARS-Cov-2-assays35,36. We gebruikten de interne R3T eenstaps RT-qPCR-kit om de RT-qPCR voor de detectie van virussen vast te stellen37. Virusdetectie, gevoeligheid, specificiteit en dynamisch bereik van onze R3T one-step RT-qPCR kit en primersets werden getest en geëvalueerd met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van de standaard twist synthetische RNA's. De laagste praktische detectielimiet was ongeveer 10 transcriptiekopieën per reactie. Als gevolg hiervan kunnen de interne R3T-eenstaps RT-qPCR-kit en primer-/sondesets met succes worden gebruikt en geïmplementeerd voor routinematige gelijktijdige diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

Het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt, vormt een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in het algemeen. Tijdens griepseizoenen kan de verspreiding van SARS-CoV-2 en andere respiratoire virussen een bevolkingsbrede last van luchtwegaandoeningen veroorzaken die moeilijk te beheersen is. Daarvoor zullen de respiratoire virussen SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) in de komende herfst- en winterseizoenen zorgvuldig in de gaten moeten worden gehouden, met name in het geval van SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B, die vergelijkbare epidemiologische factoren delen, zoals vatbare populaties, wijze van overdracht en klinische syndromen. Zonder doelwitspecifieke tests kan het een uitdaging zijn om onderscheid te maken tussen gevallen van deze virussen vanwege hun overeenkomsten. Dienovereenkomstig zal een gevoelige en gerichte multiplextest die gemakkelijk onderscheid kan maken tussen deze virale doelwitten nuttig zijn voor beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg. In deze studie ontwikkelden we een real-time reverse transcriptase-PCR-gebaseerde assay met behulp van een in-house ontwikkelde R3T eenstaps RT-qPCR-kit voor gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV. Met slechts 10 kopieën van hun synthetische RNA's kunnen we met succes SARS-CoV-2-, Influenza A-, Influenza B- en MERS-CoV-doelen tegelijkertijd identificeren met 100% specificiteit. Deze test blijkt nauwkeurig, betrouwbaar, eenvoudig, gevoelig en specifiek te zijn. De ontwikkelde methode kan worden gebruikt als een geoptimaliseerde SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostische test in ziekenhuizen, medische centra en diagnostische laboratoria, evenals voor onderzoeksdoeleinden.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Auteur in de schijnwerpers: Vooruitgang in multiplexdetectie van respiratoire virussen 

Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de diagnostische benadering voor het detecteren van veel voorkomende respiratoire virussen met behulp van PCR-benaderingen 21,22,23,24,25. Ondanks deze vooruitgang is de multiplex-benadering, die het mogelijk maakt om meerdere virussen in één test te detecteren, echter niet op grote schaal geïm...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%