Name: Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la détection multiplex des virus respiratoires
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par l’Université des sciences et technologies du roi Abdallah par le biais d’un financement de base et du National Term Grand Challenge (NTGC) à S.M.H.

1. Expression et purification de la Taq polymérase
<ol><li>Construire un plasmide avec un marqueur d’hexa-histidine clivable à l’extrémité C de l’enzyme.</li>
	<li>Transformer 50 ng du vecteur d’expression en souche E. coli BL21-(DE3) en suivant le protocole standard38.</li>
	<li>Inoculer les cellules transformées dans quatre flacons de 6 L contenant chacun 2 L de bouillon de milieu 2YT à 37 °C en agitant à 170 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 de 0,8 o...

Test RT-qPCR multiplex pour la détection de virus respiratoires

Le système de santé du monde entier est lourdement chargé de l’économie en raison des taux élevés d’infection et de mortalité dus à la propagation de virus respiratoires courants tels que le SRAS-CoV-2, la grippe A/B et les variants MERS-CoV 12,19,20. Motivés par le sens des responsabilités vis-à-vis de l’allègement de ce fardeau, nous avons réalisé la nécessité d’un test de diagnostic rapide, précis et ...

La pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) en cours est causée par le nouveau coronavirus connu sous le nom de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)1. En raison de la forte contagiosité du SAR-CoV-2 et de sa capacité de transmission rapide, la pandémie de COVID-19 est apparue dans la ville de Wuhan, en Chine, et s’est propagée rapidement dans le monde entier. Cela a finalement conduit à l’apparition de signes de détresse respiratoire et même à la mort 2,3,4. La COVID-19 a été déclarée pandémie dans plus de 213 pays, ce qui devrait entraîner une forte augmentation du nombre de cas confirmés, comme en témoignent les articles publiés par différentes études de recherche 3,5. La COVID-19 se transmet principalement par de petites gouttelettes respiratoires que les personnes infectées libèrent dans l’environnement, puis sont exposées aux personnes vulnérables par inhalation ou par contact étroit avec des surfaces contaminées. Lorsque ces gouttelettes entrent en contact avec la muqueuse des yeux, de la bouche ou du nez, une personne peut être infectée6. Les statistiques publiées par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) montrent qu’il y a eu plus de 76 millions de cas confirmés de la pandémie dans le monde, avec un nombre stupéfiant de 7 millions de décès7. Ainsi, les Nations Unies ont classé la pandémie causée par la maladie COVID-19 comme une catastrophe en raison de son impact direct sur la vie de milliards de personnes dans le monde et de ses effets économiques, environnementaux et sociaux de grande portée.
Les initiatives de santé publique, y compris les tests approfondis, la détection précoce, la recherche des contacts et l’isolement des cas, se sont toutes avérées cruciales pour garder cette pandémie sous contrôle 8,9,10,11. Les mois d’hiver augmenteront la circulation d’autres virus respiratoires comme la grippe A et B avec des symptômes semblables à ceux de la COVID-19, ce qui rendra difficile l’identification, le suivi et l’isolement précoces des cas de COVID-19. Chaque année, les éclosions de grippe A et B commencent à la fin de l’automne ou au début de janvier avec une saisonnalité prévisible12. De nombreux traits épidémiologiques sont communs aux virus SARS-CoV-2 et grippal. En outre, partageant des similitudes dans les populations sensibles qui comprennent les enfants, les personnes âgées, les immunodéprimés et les personnes souffrant de comorbidités chroniques telles que l’asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive, l’insuffisance cardiaque et rénale ou le diabète12,13. Ces virus partagent non seulement des populations vulnérables, mais aussi des voies de transmission de contact et de gouttelettes respiratoires14. On s’attend à ce que les patients contractent plus d’un de ces virus respiratoires àl’approche de la saison de la grippe. Pour cela, le dépistage du SARS-CoV-2 et des virus de la grippe doit être effectué sur les patients symptomatiques avant qu’ils ne soient isolés. Il n’est pas possible d’effectuer des tests séparés pour les trois virus (SRAS-CoV-2, grippe A et grippe B) en raison du manque mondial de ressources pour l’extraction et le diagnostic des acides nucléiques. Afin de les dépister tous en une seule réaction, une méthode ou un test doit être développé.
Le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)-CoV est un membre de la famille des coronavirus humains (CoV). Les premiers isolats du virus MERS-CoV provenaient d’un patient hospitalisé en Arabie saoudite qui était décédé en septembre 2012 des suites de problèmes respiratoires aigus15. Il existe des preuves qui suggèrent que les dromadaires sont un hôte de réservoir important pour le MERS-CoV. Il a été prouvé que les virus des dromadaires infectés sont zoonotiques et peuvent donc infecter les humains16,17. Les humains infectés par ce virus peuvent le transmettre à d’autres personnes par contact étroit18. Au 26 janvier 2018, il y avait eu 2143 cas confirmés en laboratoire d’infection par le MERS-CoV, dont 750 décès dans lemonde. Les symptômes les plus typiques du MERS-CoV sont la toux, la fièvre et l’essoufflement. Des infections par le MERS-CoV ont également été signalées comme présentant des symptômes de pneumonie, de diarrhée et de maladies gastro-intestinales20. À l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin commercial ou de traitement spécifique contre le MERS-CoV. Par conséquent, un diagnostic rapide et précis est essentiel pour prévenir les épidémies généralisées de MERS-CoV et différencier le MERS-CoV de la maladie SARS-CoV-2.
À ce jour, de nombreuses approches ont été proposées pour détecter ces virus telles que la RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 et CRISPR/Cas329, le dosage immunologique à flux latéral30, les capteurs biomoléculaires à base de papier31, le test SHERLOCK dans un pot32, l’aptamère d’ADN33, l’isotherme médié par boucle amplification (LAMP)19,34, etc. Chacune des méthodes susmentionnées présente des avantages et des inconvénients uniques en termes de sensibilité et de spécificité. Parmi ces méthodes, le test basé sur l’amplification des acides nucléiques : qRT-PCR multiplex, est la plus courante et est considérée comme l’étalon-or pour le diagnostic du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du MERS-CoV.
Dans cette étude, nous avons conçu et évalué diverses combinaisons d’amorces et de sondes pour la détection efficace, précise et simultanée du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, du MERS-CoV à l’aide d’ARN viraux synthétiques à torsion standard. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) recommande les tests multiplexés développés pour les gènes cibles du MERS-CoV ou du SRAS-CoV-2. Ces gènes codent généralement pour des protéines et des complexes qui contribuent à la formation d’un complexe de réplication/transcription (RTC)35, comme la région du cadre de lecture ouvert 1a (ORF1a) utilisée pour le dosage du MERS-CoV. De plus, les protéines structurales sont codées par les gènes utilisés dans les tests diagnostiques tels que le gène de la région amont de l’enveloppe (upE) et le gène de la nucléocapside (N) qui sont utilisés pour les tests MERS-CoV et SARS-Cov-2, respectivement35,36. Nous avons utilisé le kit RT-qPCR en une étape R3T en interne pour établir la RT-qPCR pour la détection des virus37. La détection des virus, la sensibilité, la spécificité et la plage dynamique de notre kit RT-qPCR en une étape R3T et de nos ensembles d’amorces ont été testés et évalués à l’aide de dilutions en série 10 fois des ARN synthétiques à torsion standard. La limite pratique de détection la plus basse était d’environ 10 copies de transcription par réaction. En conséquence, le kit RT-qPCR en une étape R3T interne et les ensembles d’amorces/sondes peuvent être utilisés et mis en œuvre avec succès pour le diagnostic simultané de routine du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) qui cause la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) constitue une menace sérieuse pour la santé du grand public. Pendant les saisons grippales, la propagation du SRAS-CoV-2 et d’autres virus respiratoires peut entraîner un fardeau de maladies respiratoires difficile à gérer à l’échelle de la population. Pour cela, les virus respiratoires SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B et syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) devront être surveillés de près au cours des prochaines saisons d’automne et d’hiver, en particulier dans le cas du SRAS-CoV-2, de la grippe A et de la grippe B, qui partagent des facteurs épidémiologiques similaires tels que les populations sensibles, le mode de transmission et les syndromes cliniques. En l’absence de tests spécifiques à la cible, il peut être difficile de différencier les cas de ces virus en raison de leurs similitudes. Par conséquent, un test multiplex sensible et ciblé qui peut facilement différencier ces cibles virales sera utile pour les professionnels de la santé. Dans cette étude, nous avons développé un test en temps réel basé sur la transcriptase inverse et la PCR à l’aide d’un kit RT-qPCR en une étape R3T développé en interne pour la détection simultanée du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, MERS-CoV. Avec aussi peu que 10 copies de leurs ARN synthétiques, nous pouvons identifier avec succès les cibles du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du MERS-CoV simultanément avec une spécificité de 100 %. Ce test s’avère précis, fiable, simple, sensible et spécifique. La méthode développée peut être utilisée comme test de diagnostic optimisé du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, du MERS-CoV dans les hôpitaux, les centres médicaux et les laboratoires de diagnostic, ainsi qu’à des fins de recherche.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la détection multiplex des virus respiratoires 

Développement de tests RT-qPCR multiplex en temps réel pour la détection du SRAS-CoV-2, de la grippe A/B et du MERS-CoV

Au cours des dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans l’approche diagnostique pour la détection des virus respiratoires courants à l’aide des approches PCR 21,22,23,24,25. Cependant, malgré ces avancées, l’approche multiplexée, qui permet de détecter plusieurs virus en un seul test, n’a pas été largement mise en ...

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Nous présentons deux kits de RT-qPCR en une étape basés sur des sondes pour les virus respiratoires courants. Le premier test concerne le SRAS-CoV-2 (N), la grippe A (H1N1 et H3N2) et la grippe B. Le second concerne le SARS-Cov-2 (N) et le MERS (UpE et ORF1a). Ces tests peuvent être mis en œuvre avec succès dans n’importe quel laboratoire spécialisé.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Recherche

Biologie

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%