Name: מחבר זרקור: התקדמות בזיהוי מולטיפלקס של וירוסים נשימתיים
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה באמצעות מימון ליבה והאתגר הגדול של המונח הלאומי (NTGC) ל- S.M.H.

1. ביטוי וטיהור Taq פולימראז
<ol><li>בנו פלסמיד עם תג הקסה-היסטידין ב-C-terminus של האנזים.</li>
	<li>המר 50 ננוגרם של וקטור הביטוי לזן E. coli BL21-(DE3) בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי38.</li>
	<li>חסן את התאים שעברו טרנספורמציה בארבע צלוחיות 6 L שכל אחת מהן מכילה 2 L של מרק מדיה 2YT ב 37 ° C עם ניעור ב 170...

בדיקת RT-qPCR מולטיפלקס לזיהוי וירוסים נשימתיים

קיים נטל כלכלי כבד על מערכת הבריאות בעולם כתוצאה משיעורי ההדבקה והתמותה הגבוהים עקב התפשטות וירוסים נשימתיים נפוצים כגון SARS-CoV-2, שפעת A/B וגרסאות MERS-CoV 12,19,20. מתוך תחושת אחריות להקלת נטל זה, הבנו את הצורך בבדיקת אבחון מהירה, מדויקת ונגישה כגו...

המגיפה של מחלת הקורונה המתמשכת 2019 (COVID-19) נגרמת על ידי נגיף הקורונה החדש המכונה תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2)1. בשל ההדבקה החזקה של SAR-CoV-2 ויכולת ההעברה המהירה, מגיפת COVID-19 הופיעה בעיר ווהאן שבסין והתפשטה במהירות ברחבי העולם. זה הוביל בסופו של דבר לתחילת סימני מצוקה נשימתית ואפילו למוות 2,3,4. COVID-19 הוכרז כמגיפה ביותר מ -213 מדינות, בציפייה לעלייה תלולה במספר המקרים המאומתים, כפי שמעידים המאמרים שפורסמו על ידי מחקרים שונים 3,5. COVID-19 מועבר בעיקר על ידי טיפות נשימה קטנות שאנשים נגועים משחררים לסביבה ולאחר מכן נחשפים לאנשים פגיעים באמצעות שאיפה או מגע קרוב עם משטחים מזוהמים. כאשר טיפות אלה באות במגע עם רירית העיניים, הפה או האף, אדם עלול להידבק6. נתונים סטטיסטיים שפורסמו על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) מראים כי היו יותר מ -76 מיליון מקרים מאושרים של המגיפה ברחבי העולם, עם מדהים 7 מיליון מקרי מוות7. לפיכך, האו"ם סיווג את המגפה הנגרמת על ידי מחלת COVID-19 כאסון בשל השפעתה הישירה על חייהם של מיליארדי אנשים ברחבי העולם והיו לה השפעות כלכליות, סביבתיות וחברתיות מרחיקות לכת.
יוזמות בתחום בריאות הציבור, כולל בדיקות יסודיות, גילוי מוקדם, מעקב אחר מגעים ובידוד מקרים, הוכחו כולן כחיוניות בשמירה על המגיפה הזו תחת שליטה 8,9,10,11. חודשי החורף יגבירו את התפוצה של וירוסים נשימתיים אחרים כמו שפעת A ו- B עם תסמינים דמויי COVID-19 שיקשו על זיהוי, איתור ובידוד מקרי COVID-19 בשלב מוקדם. בכל שנה, התפרצות שפעת A ו- B מתחילה בסוף הסתיו או בתחילת ינואר עם עונתיות צפויה12. תכונות אפידמיולוגיות רבות משותפות לנגיפי SARS-CoV-2 ושפעת. חוץ מזה, שיתוף קווי דמיון באוכלוסיות רגישות הכוללות ילדים, קשישים, מדוכאי חיסון, ואנשים עם תחלואה נלווית כרונית כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, אי ספיקת לב וכליות, או סוכרת12,13. נגיפים אלה חולקים לא רק אוכלוסיות פגיעות אלא גם נתיבי העברה של מגע וטיפות נשימה14. הצפי הוא שחולים עלולים להידבק ביותר מנגיפים נשימתיים אחדים ככל שעונת השפעת מתקרבתל-14. לשם כך, ההקרנה של SARS-CoV-2 ונגיפי השפעת צריכה להיעשות על חולים סימפטומטיים לפני שהם מבודדים. ביצוע בדיקות נפרדות לשלושת הנגיפים (SARS-CoV-2, שפעת A ושפעת B) אינו אפשרי בשל המחסור העולמי במשאבים למיצוי ואבחון חומצות גרעין. כדי לסנן את כולם בתגובה אחת, יש לפתח שיטה או מבחן.
תסמונת הנשימה המזרח תיכונית (MERS)-CoV היא בת משפחה של נגיף הקורונה האנושי (CoV). המבודד הראשון של נגיף MERS-CoV הגיע מחולה מאושפז בערב הסעודית שמת בספטמבר 2012 עקב בעיות נשימה חריפות15. ישנן ראיות המצביעות על כך שמארח מאגר בולט עבור MERS-CoV הוא גמלים דרומטריים. הוכח כי וירוסים מגמלים דרומטריים נגועים הם זואונוטיים ולכן יכולים להדביק בני אדם16,17. בני אדם הנגועים בנגיף זה יכולים להפיץ אותו לאחרים באמצעות מגע קרוב18. נכון ל-26 בינואר 2018, היו 2143 מקרים מאושרים במעבדה של זיהום MERS-CoV, כולל 750 מקרי מוות ברחבי העולם,19. תסמיני MERS-CoV האופייניים ביותר הם שיעול, חום וקוצר נשימה. זיהומים MERS-CoV דווחו גם להציג דלקת ריאות, שלשולים ותסמינים של מחלת מערכת העיכול20. נכון לעכשיו, אין חיסון מסחרי או טיפול ספציפי עבור MERS-CoV זמין. לכן, אבחון מהיר ומדויק חיוני למניעת התפרצויות MERS-CoV נרחבות ולהבחנה בין MERS-CoV למחלת SARS-CoV-2.
עד כה, גישות רבות הוצעו כדי לזהות וירוסים אלה כגון multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, ו CRISPR/Cas329, זרימה צידית immunoassay30, חיישנים ביומולקולריים מבוססי נייר31, בדיקת שרלוק בסיר אחד 32, DNA aptamer33, לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (LAMP)19,34 וכו'. לכל אחת מהשיטות הנ"ל יתרונות וחסרונות ייחודיים מבחינת רגישות וספציפיות. בין שיטות אלה, הבדיקה מבוססת הגברה של חומצות גרעין: multiplex qRT-PCR, היא הנפוצה ביותר ונחשבת לתקן הזהב לאבחון SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- MERS-CoV.
במחקר זה, תכננו והערכנו שילובי פריימר שונים ובדיקות לזיהוי יעיל, מדויק ובו-זמני של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, MERS-CoV תוך שימוש ב- RNA נגיפי סינתטי טוויסט סטנדרטי. הבדיקות המרובות שפותחו עבור גני המטרה MERS-CoV או SARS-CoV-2 מומלצות על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO). גנים אלה מקודדים בדרך כלל חלבונים וקומפלקסים התורמים להיווצרות קומפלקס שכפול/שעתוק (RTC)35, כגון האזור בתוך מסגרת הקריאה הפתוחה 1a (ORF1a) המשמש לבדיקת MERS-CoV. בנוסף, חלבונים מבניים מקודדים על ידי הגנים המשמשים בבדיקות אבחון כגון האזור במעלה הזרם של גן המעטפת (upE) וגן נוקלאוקפסידים (N) המשמשים לבדיקות MERS-CoV ו- SARS-Cov-2, בהתאמה35,36. השתמשנו בערכת RT-qPCR חד-שלבית R3T כדי להקים את RT-qPCR לזיהוי וירוסים37. זיהוי וירוסים, רגישות, ספציפיות וטווח דינמי של ערכת RT-qPCR בצעד אחד R3T וערכות פריימר נבדקו והוערכו באמצעות דילולים סדרתיים פי 10 של RNA סינתטי עם טוויסט סטנדרטי. מגבלת הזיהוי המעשית הנמוכה ביותר הייתה כ-10 עותקי תמלילים לכל תגובה. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בהצלחה בערכת RT-qPCR החד-שלבית R3T ובערכות פריימר/בדיקה וליישום לאבחון שגרתי בו זמנית של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

תסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) הגורמת למחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) מהווה איום חמור על בריאות הציבור הרחב. במהלך עונות השפעת, התפשטות SARS-CoV-2 ונגיפים נשימתיים אחרים עלולה לגרום לעומס כלל האוכלוסייה של מחלות נשימה שקשה להתמודד איתו. לשם כך, יהיה צורך להשגיח בקפידה על הנגיפים הנשימתיים SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ותסמונת הנשימה המזרח תיכונית (MERS-CoV) בעונות הסתיו והחורף הקרובות, במיוחד במקרה של SARS-CoV-2, שפעת A ושפעת B, החולקים גורמים אפידמיולוגיים דומים כמו אוכלוסיות רגישות, אופן העברה ותסמונות קליניות. ללא בדיקות ספציפיות למטרה, זה יכול להיות מאתגר להבדיל בין מקרים של וירוסים אלה בשל הדמיון ביניהם. בהתאם לכך, בדיקת מולטיפלקס רגישה וממוקדת שיכולה להבדיל בקלות בין מטרות ויראליות אלה תהיה שימושית עבור אנשי מקצוע בתחום הבריאות. במחקר זה, פיתחנו בדיקה מבוססת PCR בזמן אמת באמצעות ערכת RT-qPCR חד-שלבית שפותחה על ידי R3T לזיהוי סימולטני של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, MERS-CoV. עם 10 עותקים בלבד של הרנ"א הסינתטי שלהם, אנו יכולים לזהות בהצלחה מטרות SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- MERS-CoV בו זמנית עם 100% ספציפיות. בדיקה זו נמצאה מדויקת, אמינה, פשוטה, רגישה וספציפית. השיטה שפותחה יכולה לשמש כבדיקת אבחון אופטימלית של SARS-CoV-2, שפעת A, שפעת B ו- SARS-CoV-2, בדיקת אבחון MERS-CoV בבתי חולים, מרכזים רפואיים ומעבדות אבחון, כמו גם למטרות מחקר.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

מחבר זרקור: התקדמות בזיהוי מולטיפלקס של וירוסים נשימתיים 

פיתוח מבחני RT-qPCR בזמן אמת לזיהוי SARS-CoV-2, שפעת A/B ו-MERS-CoV

בשנים האחרונות חלה התקדמות משמעותית בגישת האבחון לאיתור נגיפים נשימתיים נפוצים בגישותPCR 21,22,23,24,25. עם זאת, למרות התקדמות זו, גישת המרובב, המאפשרת זיהוי וירוסים מרובים בבדיקה אחת, לא יושמה באופן נרחב, ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

אנו מציגים שתי ערכות RT-qPCR חד-שלביות מבוססות בדיקה עבור וירוסים נשימתיים נפוצים. הבדיקה הראשונה היא עבור SARS-CoV-2 (N), שפעת A (H1N1 ו- H3N2) ושפעת B. השני הוא עבור SARS-Cov-2 (N) ו- MERS (UpE ו- ORF1a). בדיקות אלה ניתן ליישם בהצלחה בכל מעבדה מיוחדת.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%