Name: लेखक स्पॉटलाइट: श्वसन वायरस के मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन में प्रगति
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

इस काम को किंग अब्दुल्ला यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी द्वारा कोर फंडिंग और एसएमएच को नेशनल टर्म ग्रैंड चैलेंज (एनटीजीसी) के माध्यम से समर्थित किया गया था।

1. Taq पोलीमरेज़ अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण
<ol><li>एंजाइम के सी-टर्मिनस पर एक दरार हेक्सा-हिस्टिडाइन टैग के साथ एक प्लाज्मिड का निर्माण करें।</li>
	<li>मानक प्रोटोकॉल38 के बाद ई कोलाई BL21- (DE3) तनाव में ?...

मल्टीप्लेक्स RT-qPCR श्वसन वायरस का पता लगाने के लिए परख

SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A/B और MERS-CoV वेरिएंट 12,19,20 जैसे सामान्य श्वसन वायरस के प्रसार के कारण उच्च संक्रमण और मृत्यु दर के परिणामस्वरूप दुनिया भर में स्वास्थ्य सेवा प्रणाली पर भ?...

चल रहे कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) की महामारी गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2)1 के रूप में जानी जाने वाली नॉवल कोरोनावायरस के कारण होती है। SAR-CoV-2 की मजबूत संक्रामकता और तेजी से संचरण की क्षमता के कारण, COVID-19 महामारी वुहान शहर, चीन में उभरी और दुनिया भर में तेजी से फैल गई। यह अंततः श्वसन संकट के संकेतों और यहां तक कि मृत्यु 2,3,4 की शुरुआत का कारण बना। COVID-19 को 213 से अधिक देशों में एक महामारी घोषित किया गया है, पुष्टि किए गए मामलों की संख्या में भारी वृद्धि की उम्मीद है, जैसा कि विभिन्न शोध अध्ययनों 3,5 द्वारा प्रकाशित पत्रों से स्पष्ट है। COVID-19 मुख्य रूप से छोटी श्वसन बूंदों द्वारा प्रेषित होता है जो संक्रमित व्यक्ति पर्यावरण में छोड़ते हैं और फिर दूषित सतहों के साथ साँस लेने या निकट संपर्क के माध्यम से कमजोर व्यक्तियों के संपर्क में आते हैं। जब ये बूंदें आंखों, मुंह या नाक के म्यूकोसा के संपर्क में आती हैं, तो एक व्यक्ति संक्रमित हो सकताहै। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा जारी आंकड़े बताते हैं कि दुनिया भर में महामारी के 76 मिलियन से अधिक पुष्ट मामले सामने आए हैं, जिसमें 7 मिलियन मौतें हुईहैं। इस प्रकार, संयुक्त राष्ट्र ने COVID-19 रोग के कारण होने वाली महामारी को एक आपदा के रूप में वर्गीकृत किया क्योंकि इसका दुनिया भर के अरबों लोगों के जीवन पर सीधा प्रभाव पड़ा और इसके दूरगामी आर्थिक, पर्यावरणीय और सामाजिक प्रभाव पड़े।
पूरी तरह से परीक्षण, प्रारंभिक पहचान, संपर्क अनुरेखण और मामले के अलगाव सहित सार्वजनिक स्वास्थ्य पहलों को इस महामारी को नियंत्रण में रखने में महत्वपूर्ण दिखाया गयाहै 8,9,10,11. सर्दियों के महीनों में इन्फ्लुएंजा ए और बी जैसे अन्य श्वसन वायरस के प्रसार में वृद्धि होगी, जिसमें COVID-19 जैसे लक्षण होंगे, जिससे COVID-19 मामलों को पहचानना, ट्रैक करना और अलग करना मुश्किल हो जाएगा। हर साल, इन्फ्लुएंजा ए और बी का प्रकोप देर से गिरने या जनवरी की शुरुआत में अनुमानित मौसमी12 के साथ शुरू होता है। SARS-CoV-2 और इन्फ्लुएंजा वायरस द्वारा कई महामारी विज्ञान लक्षण साझा किए जाते हैं। इसके अलावा, अतिसंवेदनशील आबादी में समानताएं साझा करना जिसमें बच्चे, बुजुर्ग, इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड और अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, कार्डियक और रीनल फेल्योर, या डायबिटीज12,13 जैसे क्रोनिक कॉमरेडिटी वाले व्यक्ति शामिल हैं। ये वायरस न केवल कमजोर आबादी को साझा करते हैं बल्कि संपर्क और श्वसन बूंदों के संचरण मार्गों को भी साझाकरते हैं। यह अनुमान लगाया गया है कि फ्लू के मौसममें 14 के करीब पहुंचने पर रोगियों को इनमें से एक से अधिक श्वसन वायरस की संभावना हो सकती है। इसके लिए, SARS-CoV-2 और इन्फ्लुएंजा वायरस की जांच रोगसूचक रोगियों पर अलग-थलग करने से पहले की जानी चाहिए। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और निदान के लिए संसाधनों की वैश्विक कमी के कारण तीन वायरस (SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, और इन्फ्लुएंजा B) के लिए अलग-अलग परीक्षण चलाना संभव नहीं है। उन सभी को एक प्रतिक्रिया में स्क्रीन करने के लिए, एक विधि या परीक्षण विकसित करने की आवश्यकता है।
मिडिल ईस्ट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम (MERS)-CoV एक मानव कोरोनावायरस (CoV) परिवार का सदस्य है। पहला MERS-CoV वायरस आइसोलेट्स सऊदी अरब में एक अस्पताल में भर्ती मरीज से आया था, जिसकी सितंबर 2012 में तीव्र श्वसन समस्याओंके कारण मृत्यु हो गई थी। ऐसे सबूत हैं जो बताते हैं कि MERS-CoV के लिए एक प्रमुख जलाशय मेजबान ड्रोमेडरी ऊंट है। यह साबित हो गया है कि संक्रमित ड्रोमेडरी ऊंटों से वायरस जूनोटिक हैं और इस प्रकार मनुष्योंको 16,17 संक्रमित कर सकते हैं। इस वायरस से संक्रमित मनुष्य निकट संपर्क18 के माध्यम से दूसरों को यह फैल सकता है. 26जनवरी, 2018 तक, MERS-CoV संक्रमण के 2143 प्रयोगशाला-पुष्ट मामले सामने आए थे,जिनमें विश्व स्तर पर 750 मौतें शामिल थीं। सबसे विशिष्ट MERS-CoV लक्षण खांसी, बुखार और सांस की तकलीफ हैं। MERS-CoV संक्रमण भी निमोनिया, दस्त और जठरांत्र संबंधी बीमारीके लक्षण 20 प्रदर्शित करने के लिए सूचित किया गया है. वर्तमान में, MERS-CoV के लिए कोई व्यावसायिक टीका या विशिष्ट उपचार उपलब्ध नहीं है। इसलिए, व्यापक MERS-CoV के प्रकोप को रोकने और MERS-CoV को SARS-CoV-2 रोग से अलग करने के लिए शीघ्र और सटीक निदान आवश्यक है।
आज तक, इन वायरस का पता लगाने के लिए कई दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं जैसे मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर 21,22,23,24,25, सीआरआईएसपीआर/सीएएस 1226,27, सीआरआईएसपीआर / कैस 928, और सीआरआईएसपीआर / कैस 329, पार्श्व प्रवाह इम्यूनोसे30, पेपर-आधारित बायोमोलेक्यूलर सेंसर31, एक पॉट32 में शेरलॉक परीक्षण, डीएनए एपटामर 33, लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (दीपक)19,34, आदि। उपरोक्त विधियों में से प्रत्येक में संवेदनशीलता और विशिष्टता के संदर्भ में अद्वितीय लाभ और कमियां हैं। इन विधियों में, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन-आधारित परीक्षण: मल्टीप्लेक्स qRT-PCR, सबसे आम है और इसे SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B और MERS-CoV के निदान के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है।
इस अध्ययन में, हमने मानक ट्विस्ट सिंथेटिक वायरल आरएनए का उपयोग करके SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV के प्रभावी, सटीक और एक साथ पता लगाने के लिए विभिन्न प्राइमर संयोजनों और जांचों का डिज़ाइन और मूल्यांकन किया। MERS-CoV या SARS-CoV-2 लक्ष्य जीन के लिए विकसित मल्टीप्लेक्स assays की सिफारिश विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) द्वारा की जाती है। ये जीन आम तौर पर प्रोटीन और कॉम्प्लेक्स को एन्कोड करते हैं जो प्रतिकृति/प्रतिलेखन परिसर (RTC)35 के निर्माण में योगदान करते हैं जैसे कि खुले रीडिंग फ्रेम 1a (ORF1a) के भीतर का क्षेत्र जिसका उपयोग MERS-CoV परख के लिए किया जाता है। इसके अलावा, संरचनात्मक प्रोटीन नैदानिक परख में उपयोग किए जाने वाले जीन द्वारा एन्कोड किए जाते हैं जैसे कि लिफाफा जीन (यूपीई) और न्यूक्लियोकैप्सिड जीन (एन) के अपस्ट्रीम क्षेत्र जो एमईआरएस-सीओवी और एसएआरएस-सीओवी -2 परख के लिए उपयोग किए जाते हैं, क्रमशः35,36। हमने वायरस37 का पता लगाने के लिए RT-qPCR स्थापित करने के लिए इन-हाउस R3T वन-स्टेप RT-qPCR किट का उपयोग किया। वायरस का पता लगाने, संवेदनशीलता, विशिष्टता, और हमारे R3T एक कदम RT-qPCR किट और प्राइमर सेट की गतिशील रेंज परीक्षण और मानक मोड़ सिंथेटिक RNAs के 10 गुना धारावाहिक dilutions का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया. सबसे कम व्यावहारिक पहचान सीमा प्रति प्रतिक्रिया लगभग 10 प्रतिलेख प्रतियां थी। नतीजतन, इन-हाउस R3T वन-स्टेप RT-qPCR किट और प्राइमर/प्रोब सेट को SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV के नियमित एक साथ निदान के लिए सफलतापूर्वक उपयोग और कार्यान्वित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) जो कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) का कारण बनता है, आम जनता के स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा है। इन्फ्लूएंजा के मौसम के दौरान, SARS-CoV-2 और अन्य श्वसन वायरस के प्रसार से श्वसन रोग का जनसंख्या-व्यापी बोझ हो सकता है जिसे प्रबंधित करना मुश्किल है। उसके लिए, श्वसन वायरस SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (MERS-CoV) को आगामी गिरावट और सर्दियों के मौसम में सावधानी से देखने की आवश्यकता होगी, विशेष रूप से SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा ए और इन्फ्लुएंजा बी के मामले में, जो अतिसंवेदनशील आबादी, संचरण के तरीके और नैदानिक सिंड्रोम जैसे समान महामारी विज्ञान कारकों को साझा करते हैं। लक्ष्य-विशिष्ट परख के बिना, इन वायरस के मामलों में उनकी समानता के कारण अंतर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। तदनुसार, एक संवेदनशील और लक्षित मल्टीप्लेक्स परख जो आसानी से इन वायरल लक्ष्यों के बीच अंतर कर सकती है, स्वास्थ्य चिकित्सकों के लिए उपयोगी होगी। इस अध्ययन में, हमने SARS-CoV-3, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV का एक साथ पता लगाने के लिए इन-हाउस विकसित R2T वन-स्टेप RT-qPCR किट का उपयोग करके एक रीयल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-PCR-आधारित परख विकसित की। उनके सिंथेटिक आरएनए की कम से कम 10 प्रतियों के साथ, हम 100% विशिष्टता के साथ एक साथ SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और MERS-CoV लक्ष्यों की सफलतापूर्वक पहचान कर सकते हैं। यह परख सटीक, विश्वसनीय, सरल, संवेदनशील और विशिष्ट पाया जाता है। विकसित विधि का उपयोग अस्पतालों, चिकित्सा केंद्रों और नैदानिक प्रयोगशालाओं के साथ-साथ अनुसंधान उद्देश्यों के लिए एक अनुकूलित SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV नैदानिक परख के रूप में किया जा सकता है।

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

लेखक स्पॉटलाइट: श्वसन वायरस के मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन में प्रगति 

SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A/B, और MERS-CoV का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम RT-qPCR परख का विकास

हाल के वर्षों में, पीसीआर दृष्टिकोण 21,22,23,24,25का उपयोग करके सामान्य श्वसन वायरस का पता लगाने के लिए नैदानिक दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण प्रगति ह?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

हम आम श्वसन वायरस के लिए दो जांच-आधारित इन-हाउस वन-स्टेप RT-qPCR किट पेश करते हैं। पहली परख SARS-CoV-2 (N), इन्फ्लुएंजा A (H1N1 और H3N2), और इन्फ्लुएंजा B के लिए है। दूसरा SARS-Cov-2 (N) और MERS (UpE और ORF1a) के लिए है। इन परखों को किसी भी विशेष प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है।

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%