Name: 著者スポットライト:呼吸器系ウイルスのマルチプレックス検出の進歩
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

この研究は、キング・アブドゥッラー科学技術大学(King Abdullah University of Science and Technology)が中核資金とS.M.H.へのNational Term Grand Challenge(NTGC)を通じて支援しました。

1. Taqポリメラーゼの発現と精製
<ol><li>酵素のC末端に切断可能なヘキサ-ヒスチジンタグを有するプラスミドを構築します。</li>
	<li>発現ベクター50ngを標準プロトコル38に従って大腸菌BL21-(DE3)株に形質転換する。</li>
	<li>37°Cでそれぞれ2Lの2YT培地ブロスが入った4つの6Lフラスコに、OD 600が0.8または細胞番号6.4 x 108 に達するまで170rpmで振とうしなが?...

呼吸器ウイルス検出のためのマルチプレックスRT-qPCRアッセイ

SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoV変異株などの一般的な呼吸器系ウイルスの蔓延による高い感染率と死亡率により、世界中の医療システムに大きな経済的負担がかかっています12,19,20。この負担を軽減する責任感に突き動かされ、1回の検査でこれらの一般的なウイルスを区別するためのRT-qPCRなどの迅速で正確でアクセ?...

現在進行中の新型コロナウイルス感染症2019(COVID-19)のパンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)1として知られる新型コロナウイルスによって引き起こされています。SAR-CoV-2の強い伝染性と急速な感染力により、COVID-19のパンデミックは中国の武漢市で発生し、世界中に急速に広がりました。これは最終的に呼吸困難の徴候の始まりにつながり、死にさえつながりました2,3,4。COVID-19は213カ国以上でパンデミックと宣言されており、さまざまな調査研究で発表された論文からも明らかなように、確認された症例数の急激な増加が予想されています3,5。COVID-19は、主に感染者が環境中に放出する小さな呼吸器飛沫によって感染し、吸入や汚染された表面との密接な接触によって脆弱な個人に曝露します。これらの飛沫が目、口、鼻の粘膜に接触すると、人は感染する可能性があります6。世界保健機関(WHO)が発表した統計によると、世界中で7,600万人以上の感染が確認され、700万人という驚異的な死者が出ています7。このように、国連は、COVID-19によるパンデミックは、世界中の何十億もの人々の生活に直接影響を与え、経済的、環境的、社会的に広範囲に影響を及ぼしたため、災害に分類しました。
徹底的な検査、早期発見、接触者追跡、症例隔離などの公衆衛生イニシアチブはすべて、このパンデミックを制御下に置く上で重要であることが示されています8,9,10,11。冬季は、COVID-19に似た症状を持つインフルエンザAやBなどの他の呼吸器系ウイルスの循環が増加し、COVID-19の症例を早期に特定、追跡、隔離することが困難になります。毎年、インフルエンザAおよびBの流行は晩秋または1月上旬に始まり、季節性は予測可能です12。SARS-CoV-2ウイルスとインフルエンザウイルスには多くの疫学的特徴が共通しています。さらに、子供、高齢者、免疫不全、喘息、慢性閉塞性肺疾患、心不全および腎不全、糖尿病などの慢性併存疾患を持つ個人を含む感受性集団の類似性を共有しています12,13。これらのウイルスは、脆弱な集団だけでなく、接触経路や呼吸器飛沫の感染経路も共有しています14。インフルエンザの季節が近づくにつれて、患者はこれらの呼吸器系ウイルスの1つ以上に感染する可能性が高いと予想されます14。そのためには、SARS-CoV-2とインフルエンザウイルスのスクリーニングを、症状のある患者を隔離する前に行う必要があります。3つのウイルス(SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB)について個別に検査を行うことは、核酸の抽出と診断のためのリソースが世界的に不足しているため、不可能です。1回の反応でそれらをすべてスクリーニングするには、メソッドまたはテストを開発する必要があります。
中東呼吸器症候群(MERS)-CoVは、ヒトコロナウイルス(CoV)ファミリーのメンバーです。最初のMERS-CoVウイルス分離株は、2012年9月に急性呼吸器疾患により死亡したサウジアラビアの入院患者から採取された15。MERS-CoVの顕著なリザーバー宿主がヒトコブラクダであることを示唆する証拠があります。感染したヒトコブラクダ由来のウイルスは人畜共通感染症であり、したがって人間に感染する可能性があることが証明されています16,17。このウイルスに感染した人間は、密接な接触によって他の人に感染させる可能性があります18。2018年1月26日現在、MERS-CoVの検査で確認された症例は2143例で、そのうち750人が死亡しています19。最も典型的なMERS-CoVの症状は、咳、発熱、息切れです。MERS-CoV感染症は、肺炎、下痢、胃腸病の症状を示すことも報告されています20。現在、MERS-CoVの市販のワクチンや特異的な治療法はありません。したがって、MERS-CoVの蔓延を予防し、MERS-CoVとSARS-CoV-2疾患を区別するためには、迅速かつ正確な診断が不可欠です。
現在までに、マルチプレックスRT-PCR 21,22,23,24,25、CRISPR/Cas1226,27、CRISPR/Cas928、CRISPR/Cas329、ラテラルフロー免疫測定法30、紙ベースの生体分子センサー31、ワンポットでのシャーロック検査32、DNAアプタマー33、ループ媒介等温など、これらのウイルスを検出するための多くのアプローチが提案されている増幅(LAMP)19,34など前述の各方法には、感度と特異性の点で独自の利点と欠点があります。これらの方法の中で、核酸増幅ベースの検査であるマルチプレックスqRT-PCRが最も一般的であり、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびMERS-CoVの診断のゴールドスタンダードであると考えられています。
本研究では、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVを標準ツイスト合成ウイルスRNAを用いて効果的かつ正確かつ同時に検出するための様々なプライマーの組み合わせとプローブを設計・評価しました。MERS-CoVまたはSARS-CoV-2の標的遺伝子に対して開発されたマルチプレックスアッセイは、世界保健機関(WHO)によって推奨されています。これらの遺伝子は一般に、MERS−CoVアッセイに使用されるオープンリーディングフレーム1a(ORF1a)内の領域など、複製/転写複合体(RTC)35の形成に寄与するタンパク質および複合体をコードする。さらに、構造タンパク質は、MERS-CoVおよびSARS-Cov-2アッセイにそれぞれ使用されるエンベロープ遺伝子の上流領域(upE)およびヌクレオカプシド遺伝子(N)などの診断アッセイに利用される遺伝子によってコードされています35,36。社内のR3TワンステップRT-qPCRキットを使用して、ウイルス検出用のRT-qPCRを確立しました37。R3T ワンステップ RT-qPCR キットおよびプライマーセットのウイルス検出、感度、特異性、およびダイナミックレンジは、標準 Twist 合成 RNA の 10 倍段階希釈を使用して試験および評価されました。実用的検出の最低限界は、1反応あたり約10個の転写産物コピーでした。その結果、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびSARS-CoV-2、MERS-CoVのルーチン同時診断に、社内のR3TワンステップRT-qPCRキットとプライマー/プローブセットを正常に使用および実装できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

コロナウイルス病2019(COVID-19)を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、一般市民の健康に対する深刻な脅威です。インフルエンザの季節には、SARS-CoV-2やその他の呼吸器系ウイルスの蔓延により、管理が困難な呼吸器疾患の集団的負担を引き起こす可能性があります。そのためには、呼吸器系ウイルスであるSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、中東呼吸器症候群(MERS-CoV)を、特にSARS-CoV-2、インフルエンザA、B型インフルエンザの場合、感受性集団、感染様式、臨床症候群などの同様の疫学的要因を共有するため、今後の秋から冬にかけて注意深く監視する必要があります。標的特異的なアッセイを行わないと、これらのウイルスの類似性から症例を区別することが困難になる可能性があります。したがって、これらのウイルス標的を容易に区別できる高感度で標的を絞ったマルチプレックスアッセイは、医療従事者にとって有用である。本研究では、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、SARS-CoV-2、MERS-CoVを同時に検出するために、自社開発のR3TワンステップRT-qPCRキットを利用したリアルタイム逆転写酵素PCRベースのアッセイを開発しました。わずか10コピーの合成RNAで、SARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、MERS-CoVのターゲットを100%の特異性で同時に同定することに成功しました。このアッセイは、正確で信頼性が高く、シンプルで、高感度で、特異的であることがわかっています。開発された分析法は、病院、医療センター、診断ラボ、および研究目的で、最適化されたSARS-CoV-2、インフルエンザA、インフルエンザB、およびSARS-CoV-2、MERS-CoV診断アッセイとして使用できます。

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

著者スポットライト:呼吸器系ウイルスのマルチプレックス検出の進歩 

SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoVを検出するためのマルチプレックスリアルタイムRT-qPCRアッセイの開発

近年、PCRアプローチ21、22、23、24、25を使用して一般的な呼吸器ウイルスを検出するための診断アプローチに大きな進歩がありました。しかし、これらの進歩にもかかわらず、1回の検査で複数のウイルスを検出できるマルチプレックスアプローチは、特にRT-qPCRプラット?...

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一般的な呼吸器系ウイルス用の2つのプローブベースのワンステップRT-qPCRキットを紹介します。最初のアッセイは、SARS-CoV-2(N)、インフルエンザA(H1N1およびH3N2)、およびインフルエンザBに対するものです。2つ目は、SARS-Cov-2(N)とMERS(UpEとORF1a)です。これらのアッセイは、あらゆる専門ラボでうまく実施できます。

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

生物学

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%