Name: 저자 스포트라이트: 호흡기 바이러스의 다중 검출 발전
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

이 작업은 King Abdullah University of Science and Technology의 핵심 자금 지원과 NTGC(National Term Grand Challenge)를 통해 SMH에 지원되었습니다.

1. Taq 중합효소 발현 및 정제
<ol><li>효소의 C-말단에 절단 가능한 hexa-histidine tag를 가진 플라스미드를 구축합니다.</li>
	<li>발현 벡터의 50ng를 표준 프로토콜38에 따라 E. coli BL21-(DE3) 균주로 형질전환시킵니다.</li>
	<li>형질전환된 세포를 각각 2L의 2YT 배지 육수를 포함하는 4개의 6L 플라스크에 37°C에서 170rpm으로 진수하여 0.8의 OD 600 또는 세포 번호 6.4 x 108</sup...

호흡기 바이러스 검출을 위한 멀티플렉스 RT-qPCR 분석

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 변종과 같은 일반적인 호흡기 바이러스의 확산으로 인한 높은 감염률 및 사망률로 인해 전 세계 의료 시스템에 막대한 경제적 부담이 있습니다 12,19,20. 이러한 부담을 덜어주겠다는 책임감으로 우리는 RT-qPCR과 같은 빠르고 정확하며 접근 가능한 진단 분석법이 필요하다는 것을 깨달았습니다.?...

현재 진행 중인 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 팬데믹은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)1로 알려진 신종 코로나바이러스에 의해 발생합니다. SAR-CoV-2의 강력한 전염성과 빠른 전파 능력으로 인해 COVID-19 전염병은 중국 우한시에서 발생하여 전 세계로 빠르게 확산되었습니다. 이것은 결국 호흡 곤란 징후의 시작과 심지어 죽음으로 이어졌다 2,3,4. COVID-19는 213개국 이상에서 팬데믹으로 선언되었으며, 다양한 연구 조사에서 발표된 논문에서 알 수 있듯이 확진 사례의 수가 급격히 증가할 것으로 예상됩니다 3,5. COVID-19는 주로 감염된 개인이 환경으로 방출한 다음 흡입 또는 오염된 표면과의 밀접한 접촉을 통해 취약한 개인에게 노출되는 작은 호흡기 비말에 의해 전염됩니다. 이러한 비말이 눈, 입 또는 코의 점막에 닿으면 감염될 수 있다6. 세계보건기구(WHO)가 발표한 통계에 따르면 전 세계적으로 7,600만 건 이상의 팬데믹 확진 사례가 발생했으며 사망자는 700만 명에 달합니다7. 따라서 UN은 COVID-19 질병으로 인한 전염병이 전 세계 수십억 명의 삶에 직접적인 영향을 미치고 광범위한 경제적, 환경적, 사회적 영향을 미쳤기 때문에 재난으로 분류했습니다.
철저한 검사, 조기 발견, 접촉자 추적 및 사례 격리를 포함한 공중 보건 이니셔티브는 모두 이 전염병을 통제하는 데 중요한 것으로 나타났습니다 8,9,10,11. 겨울철에는 COVID-19와 유사한 증상을 보이는 인플루엔자 A 및 B와 같은 다른 호흡기 바이러스의 순환이 증가하여 COVID-19 사례를 조기에 식별, 추적 및 격리하기가 어렵습니다. 매년 A형 인플루엔자와 B형 인플루엔자는 늦가을이나 1월 초에 발생하며, 계절성을 예측할 수 있다12. SARS-CoV-2 및 인플루엔자 바이러스는 수많은 역학적 특성을 공유합니다. 또한 어린이, 노인, 면역 저하자, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 심부전 및 신부전, 당뇨병과 같은 만성 동반 질환이 있는 개인을 포함하는 감수성 인구에서 유사성을 공유합니다12,13. 이러한 바이러스는 취약한 인구 집단을 공유할 뿐만 아니라 접촉 및 호흡기 비말의 전염 경로도 공유한다14. 독감 시즌이 다가옴에 따라 환자는 이러한 호흡기 바이러스 중 하나 이상에 감염될 가능성이 있을 것으로 예상됩니다14. 이를 위해서는 증상이 있는 환자를 격리하기 전에 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 바이러스를 선별해야 합니다. 세 가지 바이러스(SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B)에 대해 별도의 테스트를 실행하는 것은 핵산 추출 및 진단을 위한 전 세계적인 리소스 부족으로 인해 불가능합니다. 한 번의 반응으로 모두 스크리닝하려면 방법 또는 테스트를 개발해야 합니다.
중동호흡기증후군(MERS)-CoV는 인간 코로나바이러스(CoV) 계열입니다. 최초의 MERS-CoV 바이러스 분리는 2012년 9월 급성 호흡기 질환으로 사망한 사우디아라비아의 입원 환자로부터 나왔다15. MERS-CoV의 두드러진 저수지 숙주가 단봉낙타임을 시사하는 증거가 있습니다. 감염된 단봉낙타의 바이러스는 인수공통감염병이므로 인간을 감염시킬 수 있음이 입증되었다16,17. 이 바이러스에 감염된 사람은 밀접 접촉을 통해 다른 사람에게 전염시킬 수 있다18. 2018년 1월 26일 현재, 전 세계적으로 750명의 사망자를 포함하여 2143명의 MERS-CoV 감염 사례가 확인되었습니다. 가장 전형적인 MERS-CoV 증상은 기침, 발열, 숨가쁨입니다. MERS-CoV 감염은 폐렴, 설사 및 위장 질환 증상을 나타내는 것으로 보고되었다20. 현재 MERS-CoV에 대한 상용 백신이나 특정 치료법은 없습니다. 따라서 MERS-CoV의 확산을 예방하고 SARS-CoV-2 질병과 MERS-CoV를 감별하기 위해서는 신속하고 정확한 진단이 필수적입니다.
현재까지 이러한 바이러스를 검출하기 위해 멀티플렉스 RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 및 CRISPR/Cas329, 측면 유동 면역분석법(30), 종이 기반 생체 분자 센서(31), SHERLOCK 테스트 in one pot32, DNA aptamer 33, loop-mediated isothermal 증폭 (LAMP)19,34 등 앞서 언급한 각 방법은 민감도와 특이성 측면에서 고유한 장점과 단점이 있습니다. 이러한 방법 중 핵산 증폭 기반 검사인 멀티플렉스 qRT-PCR이 가장 일반적이며 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 MERS-CoV 진단을 위한 황금 표준으로 간주됩니다.
이 연구에서는 표준 트위스트 합성 바이러스 RNA를 활용하여 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 SARS-CoV-2, MERS-CoV의 효과적이고 정확하며 동시 검출을 위한 다양한 프라이머 조합 및 프로브를 설계하고 평가했습니다. MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2 표적 유전자에 대해 개발된 다중 분석은 세계보건기구(WHO)에서 권장합니다. 이러한 유전자는 일반적으로 MERS-CoV 분석에 사용되는 개방 판독 프레임 1a(ORF1a) 내 영역과 같은 복제/전사 복합체(RTC)35 형성에 기여하는 단백질 및 복합체를 암호화합니다. 또한, 구조 단백질은 MERS-CoV 및 SARS-Cov-2 분석에 사용되는 외피 유전자(upE) 및 뉴클레오캡시드 유전자(N)의 업스트림 영역(upstream)과 같은 진단 분석에 사용되는 유전자에 의해 암호화됩니다(각각 35,36). 바이러스 검출을 위한 RT-qPCR을 구축하기 위해 자체 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트를 사용했다37. R3T 원스텝 RT-qPCR 키트 및 프라이머 세트의 바이러스 검출, 민감도, 특이성 및 동적 범위는 표준 트위스트 합성 RNA의 10배 연속 희석을 사용하여 테스트 및 평가되었습니다. 가장 낮은 실제 검출 한계는 반응당 약 10개의 전사체 사본이었습니다. 그 결과, SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 SARS-CoV-2, MERS-CoV의 일상적인 동시 진단에 자체 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트 및 프라이머/프로브 세트를 성공적으로 사용하고 구현할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 유발하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 일반 대중의 건강에 심각한 위협이 됩니다. 인플루엔자 시즌에는 SARS-CoV-2 및 기타 호흡기 바이러스의 확산으로 인해 관리하기 어려운 호흡기 질환에 대한 인구 전체의 부담이 발생할 수 있습니다. 이를 위해 다가오는 가을과 겨울철에 호흡기 바이러스인 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 중동호흡기증후군(MERS-CoV)을 주의 깊게 관찰해야 하며, 특히 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B의 경우 감염 취약 인구, 전염 방식 및 임상 증후군과 같은 유사한 역학적 요인을 공유합니다. 표적 특이적 분석이 없으면 이러한 바이러스의 유사성으로 인해 사례를 구별하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 이러한 바이러스 표적을 쉽게 구별할 수 있는 민감한 표적 다중 분석은 의료 종사자에게 유용할 것입니다. 본 연구에서는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, SARS-CoV-2, MERS-CoV의 동시 검출을 위해 자체 개발한 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트를 활용하여 실시간 역전사효소-PCR 기반 분석을 개발했습니다. 10개의 합성 RNA 사본만으로도 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 MERS-CoV 표적을 100% 특이성으로 동시에 성공적으로 식별할 수 있습니다. 이 분석은 정확하고, 신뢰할 수 있으며, 간단하고, 민감하고, 특이적인 것으로 밝혀졌습니다. 개발된 방법은 병원, 의료센터, 진단 실험실에서 최적화된 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, SARS-CoV-2, MERS-CoV 진단 분석법으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 연구 목적으로도 사용할 수 있습니다.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

저자 스포트라이트: 호흡기 바이러스의 다중 검출 발전 

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

최근 몇 년 동안 PCR 접근법 21,22,23,24,25를 사용하여 일반적인 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 진단 접근법이 크게 발전했습니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 단일 테스트에서 여러 바이러스를 검출할 수 있는 다중화 접근 방식은 특히 RT-qPCR 플랫폼에서 널리 구현되?...

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일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

연구

생물학

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%