Name: Forfatter Spotlight: Fremskritt innen multipleksdeteksjon av luftveisvirus
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av King Abdullah University of Science and Technology gjennom kjernefinansiering og National Term Grand Challenge (NTGC) til SMH

1. Taq-polymeraseuttrykk og rensing
<ol><li>Konstruer et plasmid med en spaltbar heksa-histidin-tag ved C-terminalen av enzymet.</li>
	<li>Transformer 50 ng av ekspresjonsvektoren til E. coli BL21-(DE3) stamme etter standardprotokollen38.</li>
	<li>Inokuler de transformerte cellene i fire 6 L kolber som hver inneholder 2 L 2YT mediebuljong ved 37 ° C med risting ved 170 o / min til OD 600 på 0,8 eller cellenummer 6,4 x 108 er nådd.</li>
	<li>Indusere Taq-p...

Multipleks RT-qPCR-analyse for påvisning av luftveisvirus

Det er en stor økonomisk byrde på helsevesenet over hele verden som følge av de høye infeksjons- og dødelighetsratene på grunn av spredningen av vanlige luftveisvirus som SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV-variantene 12,19,20. Motivert av ansvarsfølelsen for å lette denne byrden, innså vi behovet for en rask, presis og tilgjengelig diagnostisk analyse som RT-qPCR for å skille mellom disse vanlige virusene i en test....

Pandemien av den pågående koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) er forårsaket av det nye koronaviruset kjent som alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grunn av SAR-CoV-2s sterke smittsomhet og kapasitet for rask overføring, oppsto COVID-19-pandemien i Wuhan City, Kina, og spredte seg raskt over hele verden. Dette førte til slutt til starten av respiratoriske nødtegn og til og med død 2,3,4. COVID-19 har blitt erklært en pandemi i mer enn 213 land, og forventer en bratt økning i antall bekreftede tilfeller, som det fremgår av papirene publisert av forskjellige forskningsstudier 3,5. COVID-19 overføres primært av små luftveisdråper som infiserte individer slipper ut i miljøet og deretter blir utsatt for sårbare individer gjennom innånding eller nær kontakt med forurensede overflater. Når disse dråpene kommer i kontakt med slimhinnen i øynene, munnen eller nesen, kan en person bli smittet6. Statistikk utgitt av Verdens helseorganisasjon (WHO) viser at det har vært mer enn 76 millioner bekreftede tilfeller av pandemien over hele verden, med svimlende 7 millioner dødsfall7. Dermed klassifiserte FN pandemien forårsaket av COVID-19-sykdommen som en katastrofe på grunn av dens direkte innvirkning på livene til milliarder av mennesker over hele verden og hadde vidtrekkende økonomiske, miljømessige og sosiale effekter.
Folkehelseinitiativer, inkludert grundig testing, tidlig oppdagelse, kontaktsporing og isolering av tilfeller, har alle vist seg å være avgjørende for å holde denne pandemien under kontroll 8,9,10,11. Vintermånedene vil øke sirkulasjonen av andre luftveisvirus som influensa A og B med COVID-19-lignende symptomer, noe som gjør det vanskelig å identifisere, spore opp og isolere COVID-19-tilfeller tidlig. Hvert år starter influensa A- og B-utbruddet sent på høsten eller begynnelsen av januar med en forutsigbar sesongmessighet12. Tallrike epidemiologiske trekk deles av SARS-CoV-2 og influensavirus. Dessuten deler likheter i de mottakelige populasjonene som inkluderer barn, eldre, immunkompromitterte og personer med kroniske comorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, hjerte- og nyresvikt eller diabetes12,13. Disse virusene deler ikke bare sårbare befolkninger, men også overføringsruter for kontakt og luftveisdråper14. Det forventes at pasienter sannsynligvis kan få mer enn ett av disse respiratoriske virusene når influensasesongen nærmer seg14. For det må screeningen av SARS-CoV-2 og influensavirusene gjøres på symptomatiske pasienter før de isoleres. Å kjøre separate tester for de tre virusene (SARS-CoV-2, influensa A og influensa B) er ikke mulig på grunn av den globale mangelen på ressurser for nukleinsyreekstraksjon og diagnostikk. For å skjerme dem alle i en reaksjon, må en metode eller test utvikles.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV er et familiemedlem av humant koronavirus (CoV). De første MERS-CoV-virusisolatene kom fra en innlagt pasient i Saudi-Arabia som døde i september 2012 på grunn av akutte luftveisproblemer15. Det er bevis som tyder på at en fremtredende reservoarvert for MERS-CoV er dromedarkameler. Det er bevist at virus fra infiserte dromedarkameler er zoonotiske og dermed kan infisere mennesker16,17. Mennesker smittet med dette viruset kan spre det til andre gjennom nær kontakt18. Per 26. januar 2018 hadde det vært 2143 laboratoriebekreftede tilfeller av MERS-CoV-infeksjon, inkludert 750 dødsfall globalt19. De mest typiske MERS-CoV-symptomene er hoste, feber og kortpustethet. MERS-CoV-infeksjoner har også blitt rapportert å vise lungebetennelse, diaré og gastrointestinale sykdomssymptomer20. For tiden er ingen kommersiell vaksine eller spesifikk behandling for MERS-CoV tilgjengelig. Derfor er rask og presis diagnose avgjørende for å forhindre de utbredte MERS-CoV-utbruddene og skille MERS-CoV fra SARS-CoV-2-sykdom.
Til dags dato har mange tilnærminger blitt foreslått for å oppdage disse virusene som multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR / Cas1226,27, CRISPR / Cas928 og CRISPR / Cas329, lateral flow immunoassay30, papirbaserte biomolekylære sensorer31, SHERLOCK-testing i en pott 32, DNA-aptamer33, loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP)19,34 osv. Hver av de nevnte metodene har unike fordeler og ulemper når det gjelder følsomhet og spesifisitet. Blant disse metodene er nukleinsyreforsterkningsbasert test: multiplex qRT-PCR, den vanligste og anses å være gullstandarden for diagnostisering av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV.
I denne studien designet og vurderte vi ulike primerkombinasjoner og prober for effektiv, nøyaktig og samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV ved bruk av standard vri syntetiske virale RNAer. De multipleksede analysene utviklet for enten MERS-CoV- eller SARS-CoV-2-målgener anbefales av Verdens helseorganisasjon (WHO). Disse genene koder generelt for proteiner og komplekser som bidrar til dannelsen av et replikasjons-/transkripsjonskompleks (RTC)35, slik som regionen innenfor den åpne leserammen 1a (ORF1a) som brukes til MERS-CoV-analyse. I tillegg er strukturelle proteiner kodet av gener som brukes i diagnostiske analyser som oppstrøms region av konvoluttgen (upE) og nukleokapsidgen (N) som brukes til MERS-CoV og SARS-Cov-2 analyser, henholdsvis35,36. Vi brukte internt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for å etablere RT-qPCR for påvisning av virus37. Virusdeteksjon, følsomhet, spesifisitet og dynamisk område for vårt R3T ett-trinns RT-qPCR-sett og primersett ble testet og evaluert ved hjelp av 10 ganger serielle fortynninger av standard vri syntetiske RNA-er. Den laveste praktiske deteksjonsgrensen var ca. 10 transkripsjonskopier per reaksjon. Som et resultat kan det interne R3T ett-trinns RT-qPCR-settet og primer-/sondesettene med hell brukes og implementeres for rutinemessig samtidig diagnose av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

Det alvorlige akutte luftveissyndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som forårsaker Coronavirus sykdom 2019 (COVID-19) er en alvorlig trussel mot allmennhetens helse. Under influensasesonger kan spredning av SARS-CoV-2 og andre respiratoriske virus forårsake en populasjonsomfattende byrde av luftveissykdom som er vanskelig å håndtere. For det må respiratoriske virus SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og Midtøsten respiratorisk syndrom (MERS-CoV) overvåkes nøye i de kommende høst- og vintersesongene, spesielt når det gjelder SARS-CoV-2, influensa A og influensa B, som deler lignende epidemiologiske faktorer som følsomme populasjoner, overføringsmåte og kliniske syndromer. Uten målspesifikke analyser kan det være utfordrende å skille mellom tilfeller av disse virusene på grunn av deres likheter. Følgelig vil en sensitiv og målrettet multipleksanalyse som lett kan skille mellom disse virale målene, være nyttig for helsepersonell. I denne studien utviklet vi en sanntids revers transkriptase-PCR-basert analyse ved hjelp av et internt utviklet R3T ett-trinns RT-qPCR-sett for samtidig påvisning av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopier av deres syntetiske RNA kan vi med hell identifisere SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og MERS-CoV-mål samtidig med 100% spesifisitet. Denne analysen er funnet å være nøyaktig, pålitelig, enkel, sensitiv og spesifikk. Den utviklede metoden kan brukes som en optimalisert SARS-CoV-2, influensa A, influensa B og SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk analyse på sykehus, medisinske sentre og diagnostiske laboratorier, samt til forskningsformål.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Forfatter Spotlight: Fremskritt innen multipleksdeteksjon av luftveisvirus 

Utvikling av multiplekse sanntids RT-qPCR-analyser for påvisning av SARS-CoV-2, influensa A/B og MERS-CoV

De siste årene har det vært betydelige fremskritt i den diagnostiske tilnærmingen for å oppdage vanlige luftveisvirus ved hjelp av PCR-tilnærminger 21,22,23,24,25. Til tross for disse fremskrittene har imidlertid den multipleksede tilnærmingen, som gjør det mulig å oppdage flere virus i en enkelt test, ikke blitt mye implementert, spesielt i RT-qPCR-pl...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Vi presenterer to sondebaserte interne ett-trinns RT-qPCR-sett for vanlige luftveisvirus. Den første analysen er for SARS-CoV-2 (N), influensa A (H1N1 og H3N2) og influensa B. Den andre er for SARS-Cov-2 (N) og MERS (UpE og ORF1a). Disse analysene kan med hell implementeres i ethvert spesialisert laboratorium.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%