Name: Autor em destaque: Avanços na detecção multiplex de vírus respiratórios
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Ciência e Tecnologia Rei Abdullah através do financiamento principal e do National Term Grand Challenge (NTGC) para S.M.H.

1. Expressão e purificação da Taq polimerase
<ol><li>Construir um plasmídeo com uma etiqueta hexa-histidina clivável no término C da enzima.</li>
	<li>Transformar 50 ng do vetor de expressão em cepa de E. coli BL21-(DE3) seguindo o protocolo padrão38.</li>
	<li>Inocular as células transformadas em quatro frascos de 6 L cada um contendo 2 L de caldo de meio 2YT a 37 °C com agitação a 170 rpm até atingir o OD 600 de 0,8 ou o número de célula 6,4 x 108<...

Ensaio multiplex de RT-qPCR para detecção de vírus respiratórios

Há uma pesada carga econômica sobre o sistema de saúde em todo o mundo resultante das altas taxas de infecção e mortalidade devido à disseminação de vírus respiratórios comuns, como as variantes SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivados pelo senso de responsabilidade em aliviar essa carga, percebemos a necessidade de um ensaio diagnóstico rápido, preciso e acessível, como o RT-qPCR, para distinguir en...

A pandemia da doença 2019 do coronavirus em curso (COVID-19) é causada pelo novo coronavirus conhecido como coronavirus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)1. Devido à forte contagiosidade do SAR-CoV-2 e à capacidade de transmissão rápida, a pandemia de COVID-19 surgiu na cidade de Wuhan, na China, e se espalhou rapidamente pelo mundo. Isso acabou levando ao aparecimento de sinais de desconforto respiratório e até mesmo à morte 2,3,4. A COVID-19 foi declarada pandemia em mais de 213 países, esperando-se um aumento acentuado no número de casos confirmados, como evidenciado pelos trabalhos publicados por diferentes estudos de pesquisa 3,5. A COVID-19 é transmitida principalmente por pequenas gotículas respiratórias que os indivíduos infectados liberam no ambiente e depois são expostos a indivíduos vulneráveis por inalação ou contato próximo com superfícies contaminadas. Quando essas gotículas entram em contato com a mucosa dos olhos, boca ou nariz, a pessoa pode se infectar6. Estatísticas divulgadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que houve mais de 76 milhões de casos confirmados da pandemia no mundo, com impressionantes 7 milhões demortes7. Assim, as Nações Unidas classificaram a pandemia causada pela doença COVID-19 como um desastre por causa de seu impacto direto na vida de bilhões de pessoas em todo o mundo e teve efeitos econômicos, ambientais e sociais de longo alcance.
Iniciativas de saúde pública, incluindo testes completos, detecção precoce, rastreamento de contatos e isolamento de casos, têm se mostrado cruciais para manter a pandemia sob controle 8,9,10,11. Os meses de inverno aumentarão a circulação de outros vírus respiratórios como Influenza A e B com sintomas semelhantes aos da COVID-19, dificultando a identificação, rastreamento e isolamento de casos de COVID-19 no início. Todos os anos, o surto de Influenza A e B inicia-se no final do outono ou início de janeiro, com uma sazonalidade previsível12. Numerosas características epidemiológicas são compartilhadas pelos vírus SARS-CoV-2 e Influenza. Além disso, compartilham semelhanças nas populações suscetíveis que incluem crianças, idosos, imunocomprometidos e indivíduos com comorbidades crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, insuficiência cardíaca e renal ou diabetes 12,13. Esses vírus não apenas compartilham populações vulneráveis, mas também vias de transmissão de contato e gotículas respiratórias14. Prevê-se que os pacientes possam provavelmente contrair mais de um desses vírus respiratórios à medida que a temporada de gripe se aproxima14. Para isso, o rastreamento do SARS-CoV-2 e dos vírus Influenza precisa ser feito em pacientes sintomáticos antes de serem isolados. A realização de testes separados para os três vírus (SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B) não é possível devido à falta global de recursos para extração e diagnóstico de ácidos nucleicos. A fim de triá-los todos em uma reação, um método ou teste precisa ser desenvolvido.
A síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)-CoV é um membro da família do coronavírus humano (CoV). Os primeiros isolados do vírus MERS-CoV vieram de um paciente hospitalizado na Arábia Saudita que morreu em setembro de 2012 devido a problemas respiratórios agudos15. Há evidências que sugerem que um hospedeiro reservatório proeminente para o MERS-CoV são os camelos dromedários. Está comprovado que vírus de camelos dromedários infectados são zoonóticos e, portanto, podem infectar humanos16,17. Humanos infectados com esse vírus podem transmiti-lo a outras pessoas por meio de contato próximo18. Até 26 de janeiro de 2018, havia 2143 casos confirmados laboratorialmente de infecção por MERS-CoV, incluindo 750 mortes em todo o mundo19. Os sintomas mais típicos do MERS-CoV são tosse, febre e falta de ar. Também foram relatados que infecções por MERS-CoV apresentam sintomas de pneumonia, diarreia e doença gastrointestinal20. Atualmente, nenhuma vacina comercial ou tratamento específico para MERS-CoV está disponível. Portanto, o diagnóstico rápido e preciso é essencial para prevenir os surtos generalizados de MERS-CoV e diferenciar o MERS-CoV da doença SARS-CoV-2.
Até o momento, muitas abordagens têm sido propostas para detectar esses vírus, tais como RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 e CRISPR/Cas329, imunoensaio de fluxo lateral30, sensores biomoleculares baseados em papel31, teste de SHERLOCK em um pote32, DNA aptamer33, isotérmico mediado por loop amplificação (LAMP)19,34, etc. Cada um dos métodos acima mencionados tem benefícios e desvantagens únicas em termos de sensibilidade e especificidade. Entre esses métodos, o teste baseado em amplificação de ácido nucleico: multiplex qRT-PCR, é o mais comum e é considerado o padrão-ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV.
Neste estudo, nós projectamos e avaliamos várias combinações do primer e sondas para a detecção eficaz, exacta, e simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizando RNAs virais sintéticos da torção padrão. Os ensaios multiplexados desenvolvidos para os genes-alvo do MERS-CoV ou do SARS-CoV-2 são recomendados pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Esses genes geralmente codificam proteínas e complexos que contribuem para a formação de um complexo de replicação/transcrição (RTC)35, como a região dentro do open reading frame 1a (ORF1a) que é usada para o ensaio MERS-CoV. Além disso, as proteínas estruturais são codificadas pelos genes utilizados em ensaios diagnósticos, tais como a região a montante do gene do envelope (upE) e o gene do nucleocapsídeo (N), que são usados para ensaios MERS-CoV e SARS-Cov-2, respectivamente 35,36. Usamos o kit interno de RT-qPCR de uma etapa R3T para estabelecer o RT-qPCR para a detecção de vírus37. A detecção do vírus, a sensibilidade, a especificidade e a faixa dinâmica do nosso kit RT-qPCR de uma etapa R3T e dos conjuntos de primers foram testados e avaliados usando diluições seriadas de 10 vezes dos RNAs sintéticos de torção padrão. O menor limite prático de detecção foi de aproximadamente 10 cópias transcritas por reação. Como resultado, o kit RT-qPCR de uma etapa R3T interno e conjuntos de primer/sonda podem ser usados e implementados com sucesso para diagnóstico simultâneo de rotina de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que causa a doença 2019 do coronavirus (COVID-19) é uma séria ameaça à saúde pública em geral. Durante as temporadas de gripe, a disseminação do SARS-CoV-2 e de outros vírus respiratórios pode causar uma carga populacional de doença respiratória difícil de controlar. Para isso, os vírus respiratórios SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) precisarão ser cuidadosamente observados nas próximas temporadas de outono e inverno, particularmente no caso do SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, que compartilham fatores epidemiológicos semelhantes, como populações suscetíveis, modo de transmissão e síndromes clínicas. Sem ensaios alvo-específicos, pode ser difícil diferenciar entre os casos desses vírus devido às suas semelhanças. Assim, um ensaio multiplex sensível e direcionado que possa facilmente diferenciar entre esses alvos virais será útil para os profissionais de saúde. Neste estudo, nós desenvolvemos um ensaio baseado em transcriptase reversa em tempo real utilizando um kit RT-qPCR de uma etapa R3T desenvolvido internamente para detecção simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Com apenas 10 cópias de seus RNAs sintéticos, podemos identificar com sucesso alvos SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV simultaneamente com 100% de especificidade. Este ensaio é encontrado para ser preciso, confiável, simples, sensível e específico. O método desenvolvido pode ser usado como um ensaio de diagnóstico SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2 otimizado em hospitais, centros médicos e laboratórios de diagnóstico, bem como para fins de pesquisa.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Autor em destaque: Avanços na detecção multiplex de vírus respiratórios 

Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

Nos últimos anos, houve avanços significativos na abordagem diagnóstica para detecção de vírus respiratórios comuns por meio de PCR21,22,23,24,25. No entanto, apesar desses avanços, a abordagem multiplexada, que permite detectar vários vírus em um único teste, não foi amplamente implementada, particularmente na plataforma RT-qPCR. Este método foi ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Biologia

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%