Name: В центре внимания автора: Достижения в мультиплексном обнаружении респираторных вирусов
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Эта работа была поддержана Научно-технологическим университетом имени короля Абдаллы за счет основного финансирования и National Term Grand Challenge (NTGC) для S.M.H.

1. Экспрессия и очистка Taq-полимеразы
<ol><li>Сконструировать плазмиду с расщепляемой гекса-гистидиновой меткой на С-конце фермента.</li>
	<li>Трансформируют 50 нг вектора экспрессии в штамм E. coli BL21-(DE3) в соответствии со стандартным протоколом38.</li>
	<li>Высевать трансфо...

Мультиплексный анализ ОТ-кПЦР для выявления респираторных вирусов

В связи с распространением распространенных респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, грипп A/B и варианты БВРС-КоВ 12,19,20, на систему здравоохранения во всем мире ложится тяжелая экономическая нагрузка. Руководствуясь чувством ответствен...

Пандемия продолжающейся коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) вызвана новым коронавирусом, известным как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)1. Из-за высокой заразности и способности SAR-CoV-2 к быстрой передаче пандемия COVID-19 возникла в городе Ухань (Китай) и быстро распространилась по всему миру. Это в конечном итоге привело к появлению респираторных дистресс-признаков и даже смерти 2,3,4. COVID-19 был объявлен пандемией более чем в 213 странах, ожидая резкого увеличения числа подтвержденных случаев, о чем свидетельствуют статьи, опубликованные различными научными исследованиями 3,5. COVID-19 передается в основном мелкими респираторными каплями, которые инфицированные люди выделяют в окружающую среду, а затем подвергаются воздействию уязвимых лиц при вдыхании или тесном контакте с зараженными поверхностями. При попадании этих капель на слизистую оболочку глаз, рта или носа человек может заразиться6. Статистические данные, опубликованные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), показывают, что во всем мире зарегистрировано более 76 миллионов подтвержденных случаев пандемии, из которых 7миллионов закончились смертельным исходом7. Таким образом, Организация Объединенных Наций классифицировала пандемию, вызванную COVID-19, как бедствие из-за ее прямого воздействия на жизнь миллиардов людей во всем мире и имеющего далеко идущие экономические, экологические и социальные последствия.
Инициативы в области общественного здравоохранения, включая тщательное тестирование, раннее выявление, отслеживание контактов и изоляцию заболевших, сыграли решающую роль в удержании этой пандемии под контролем 8,9,10,11. В зимние месяцы циркуляция других респираторных вирусов, таких как грипп А и В, с симптомами, похожими на COVID-19, затруднит выявление, отслеживание и изоляцию случаев COVID-19 на ранних стадиях. Каждый год вспышка гриппа А и В начинается поздней осенью или в начале января с предсказуемой сезонностью12. Вирусы SARS-CoV-2 и гриппа имеют множество общих эпидемиологических признаков. Кроме того, сходство между восприимчивыми популяциями, к которым относятся дети, пожилые люди, люди с ослабленным иммунитетом и лица с хроническими сопутствующими заболеваниями, такими как астма, хроническая обструктивная болезнь легких, сердечная и почечная недостаточность или диабет12,13. Эти вирусы не только являются общими для уязвимых групп населения, но и имеют пути передачи контактным и воздушно-капельнымпутем14. Ожидается, что пациенты, вероятно, могут заразиться более чем одним из этих респираторных вирусов по мере приближения сезона гриппа к14 годам. Для этого необходимо провести скрининг на SARS-CoV-2 и вирусы гриппа у пациентов с симптомами, прежде чем они будут изолированы. Проведение отдельных тестов на три вируса (SARS-CoV-2, грипп А и грипп В) невозможно из-за глобальной нехватки ресурсов для экстракции и диагностики нуклеиновых кислот. Для того, чтобы отсеять их все в одной реакции, необходимо разработать метод или тест.
Ближневосточный респираторный синдром (БВРС)-КоВ является членом семейства коронавирусов человека (CoV). Первые изоляты вируса БВРС-КоВ были получены от госпитализированного пациента в Саудовской Аравии, который умер в сентябре 2012 г. из-за острых респираторныхзаболеваний15. Имеются данные, свидетельствующие о том, что основным резервуарным хозяином БВРС-КоВ являются одногорбые верблюды. Было доказано, что вирусы инфицированных одногорбых верблюдов являются зоонозными и, таким образом, могут инфицировать человека16,17. Люди, инфицированные этим вирусом, могут передавать его другим людям при тесном контакте18. По состоянию на 26 января 2018 г. в мире зарегистрировано 2143 лабораторно подтвержденных случая инфицирования БВРС-КоВ, из которых 750 закончились смертельным исходом19. Наиболее типичными симптомами БВРС-КоВ являются кашель, лихорадка и одышка. Сообщалось также, что у инфицированных БВРС-КоВ проявляются симптомы пневмонии, диареи и желудочно-кишечного недуга20. В настоящее время не существует ни коммерческой вакцины, ни специфического лечения БВРС-КоВ. Поэтому оперативная и точная диагностика имеет важнейшее значение для предотвращения широкомасштабных вспышек БВРС-КоВ и дифференциации БВРС-КоВ от SARS-CoV-2.
На сегодняшний день предложено множество подходов к выявлению этих вирусов, таких как мультиплексная ОТ-ПЦР 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 и CRISPR/Cas329, иммуноферментный анализбокового потока 30, бумажные биомолекулярные сенсоры31, тестирование SHERLOCK в одном котле32, ДНК-аптамер 33, петлево-опосредованный изотермический усиление (LAMP)19,34 и т.д. Каждый из вышеупомянутых методов имеет уникальные преимущества и недостатки с точки зрения чувствительности и специфичности. Среди этих методов наиболее распространенным является тест на основе амплификации нуклеиновых кислот: мультиплексная кОТ-ПЦР, который считается золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV.
В этом исследовании мы разработали и оценили различные комбинации праймеров и зондов для эффективного, точного и одновременного обнаружения SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV с использованием стандартных синтетических вирусных РНК. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует мультиплексные анализы, разработанные для генов-мишеней БВРС-КоВ или SARS-CoV-2. Эти гены, как правило, кодируют белки и комплексы, которые способствуют образованию комплекса репликации/транскрипции (RTC)35, такого как область в открытой рамке считывания 1a (ORF1a), которая используется для анализа на БВРС-КоВ. Кроме того, структурные белки кодируются генами, используемыми в диагностических анализах, такими как восходящая область гена оболочки (upE) и ген нуклеокапсида (N), которые используются для анализов на MERS-CoV и SARS-Cov-2 соответственно35,36. Мы использовали собственный одноэтапный набор RT-qPCR R3T для создания RT-qPCR для обнаружения вирусов37. Обнаружение вирусов, чувствительность, специфичность и динамический диапазон нашего набора для одноэтапной ОТ-кПЦР R3T и наборов праймеров были протестированы и оценены с использованием 10-кратных серийных разведений стандартных скрутенных синтетических РНК. Самый низкий практический предел обнаружения составлял примерно 10 копий расшифровки на реакцию. В результате для рутинной одновременной диагностики SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, БВРС-КоВ можно успешно использовать и внедрять собственный одноэтапный набор для ОТ-кПЦР R3T.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), представляет серьезную угрозу для здоровья населения в целом. Во время сезонов гриппа распространение SARS-CoV-2 и других респираторных вирусов может привести к тяжелому бремени респираторных заболеваний в масштабах всего населения, с которым трудно справиться. Для этого в предстоящие осенние и зимние сезоны необходимо будет тщательно следить за респираторными вирусами SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), особенно в случае SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В, которые имеют схожие эпидемиологические факторы, такие как восприимчивые популяции, способ передачи и клинические синдромы. Без таргетно-специфических анализов может быть сложно дифференцировать случаи этих вирусов из-за их сходства. Соответственно, чувствительный и таргетный мультиплексный анализ, который может легко дифференцировать эти вирусные мишени, будет полезен для практикующих врачей. В этом исследовании мы разработали анализ на основе ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени с использованием разработанного нами одноэтапного набора R3T RT-qPCR для одновременного выявления SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV. Имея всего 10 копий их синтетических РНК, мы можем успешно идентифицировать мишени SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV одновременно со 100% специфичностью. Этот анализ признан точным, надежным, простым, чувствительным и специфичным. Разработанный метод может быть использован в качестве оптимизированного диагностического анализа SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, MERS-CoV в больницах, медицинских центрах и диагностических лабораториях, а также в исследовательских целях.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

В центре внимания автора: Достижения в мультиплексном обнаружении респираторных вирусов 

Разработка мультиплексных ОТ-кПЦР-анализов в режиме реального времени для выявления SARS-CoV-2, гриппа A/B и БВРС-КоВ

В последние годы были достигнуты значительные успехи в диагностическом подходе к выявлению распространенных респираторных вирусов с использованием подходов ПЦР 21,22,23,24,25. Однако, несмотря на эти д...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Мы представляем два собственных одноэтапных набора для ОТ-кПЦР на основе зондов для распространенных респираторных вирусов. Первый анализ проводится на SARS-CoV-2 (N), грипп A (H1N1 и H3N2) и грипп B. Второй — для SARS-Cov-2 (N) и MERS (UpE и ORF1a). Эти анализы могут быть успешно реализованы в любой специализированной лаборатории.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

Подготовка и тестирование компонентов набора Multiplex R3T One-Step RT-qPCR  

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%