Name: Författare i fokus: Framsteg inom multiplex-detektion av luftvägsvirus
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Detta arbete stöddes av King Abdullah University of Science and Technology genom kärnfinansiering och National Term Grand Challenge (NTGC) till S.M.H.

1. Taq-polymerasuttryck och rening
<ol><li>Konstruera en plasmid med en klyvbar hexa-histidintagg vid enzymets C-terminal.</li>
	<li>Transformera 50 ng av expressionsvektorn till E. coli BL21-(DE3) stam enligt standardprotokollet38.</li>
	<li>Inokulera de transformerade cellerna i fyra 6-literskolvar som var och en innehåller 2 liter 2 liter 2-litersbuljong vid 37 °C med skakning vid 170 varv per minut tills OD 600 på 0,8 eller cellnummer 6,4 x 108 uppnås...

Multiplex RT-qPCR-analys för detektion av luftvägsvirus

Hälso- och sjukvårdssystemet i hela världen har en tung ekonomisk börda till följd av de höga infektions- och dödstalen på grund av spridningen av vanliga luftvägsvirus som SARS-CoV-2, influensa A/B och MERS-CoV-varianterna 12,19,20. Motiverade av ansvarskänslan för att lindra denna börda insåg vi behovet av en snabb, exakt och tillgänglig diagnostisk analys som RT-qPCR för att skilja mellan dessa vanliga virus i ...

Pandemin av den pågående coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) orsakas av det nya coronaviruset som kallas severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grund av SAR-CoV-2:s starka smittsamhet och förmåga till snabb överföring uppstod covid-19-pandemin i staden Wuhan i Kina och spred sig snabbt över hela världen. Detta ledde så småningom till att man började få tecken på andnöd och till och med dödsfall 2,3,4. Covid-19 har förklarats vara en pandemi i mer än 213 länder, vilket tyder på en kraftig ökning av antalet bekräftade fall, vilket framgår av de artiklar som publicerats i olika forskningsstudier 3,5. COVID-19 överförs främst genom små luftvägsdroppar som infekterade individer släpper ut i miljön och sedan exponeras för sårbara individer genom inandning eller nära kontakt med kontaminerade ytor. När dessa droppar kommer i kontakt med slemhinnan i ögon, mun eller näsa kan en person bli infekterad6. Statistik från Världshälsoorganisationen (WHO) visar att det har funnits mer än 76 miljoner bekräftade fall av pandemin över hela världen, med häpnadsväckande 7 miljoner dödsfall7. Således klassificerade FN pandemin orsakad av COVID-19-sjukdomen som en katastrof på grund av dess direkta inverkan på livet för miljarder människor runt om i världen och hade långtgående ekonomiska, miljömässiga och sociala effekter.
Folkhälsoinitiativ som grundlig testning, tidig upptäckt, kontaktspårning och fallisolering har alla visat sig vara avgörande för att hålla denna pandemi under kontroll 8,9,10,11. Vintermånaderna kommer att öka cirkulationen av andra luftvägsvirus som influensa A och B med covid-19-liknande symtom som gör det svårt att identifiera, spåra och isolera covid-19-fall tidigt. Varje år börjar utbrott av influensa A och B i slutet av hösten eller början av januari med en förutsägbar säsongsvariation12. Många epidemiologiska egenskaper delas av SARS-CoV-2 och influensavirus. Dessutom delar likheter i de mottagliga populationerna som inkluderar barn, äldre, immunsupprimerade och individer med kroniska komorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, hjärt- och njursvikt eller diabetes12,13. Dessa virus delar inte bara sårbara populationer utan även smittvägar för kontakt och droppsmitta14. Det förväntas att patienter sannolikt kan drabbas av mer än ett av dessa luftvägsvirus när influensasäsongen närmar sig14. För det måste screening av SARS-CoV-2 och influensavirus göras på symtomatiska patienter innan de isoleras. Att köra separata tester för de tre virusen (SARS-CoV-2, influensa A och influensa B) är inte möjligt på grund av den globala bristen på resurser för nukleinsyraextraktion och diagnostik. För att screena dem alla i en reaktion behöver en metod eller ett test utvecklas.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV är en familjemedlem till humant coronavirus (CoV). De första isolaten av MERS-CoV-viruset kom från en patient som var inlagd på sjukhus i Saudiarabien och som hade avlidit i september 2012 på grund av akutaandningsproblem. Det finns bevis som tyder på att en framträdande reservoarvärd för MERS-CoV är dromedarer. Det har bevisats att virus från infekterade dromedarer är zoonotiska och därmed kan infektera människor16,17. Människor som är infekterade med detta virus kan sprida det till andra genom nära kontakt18. Fram till den 26 januari 2018 hade det förekommit 2143 laboratoriebekräftade fall av MERS-CoV-infektion inklusive 750 dödsfall globalt19. De mest typiska MERS-CoV-symtomen är hosta, feber och andnöd. MERS-CoV-infektioner har också rapporterats uppvisa symtom på lunginflammation, diarré och gastrointestinala sjukdomar20. För närvarande finns inget kommersiellt vaccin eller specifik behandling för MERS-CoV tillgängligt. Därför är snabb och exakt diagnos avgörande för att förhindra de utbredda MERS-CoV-utbrotten och skilja MERS-CoV från SARS-CoV-2-sjukdomen.
Hittills har många metoder föreslagits för att detektera dessa virus, t.ex. multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 och CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, pappersbaserade biomolekylära sensorer31, SHERLOCK-testning i en kruka 32, DNA-aptamer33, loopmedierad isoterm förstärkning (LAMPA)19,34, etc. Var och en av de ovan nämnda metoderna har unika fördelar och nackdelar när det gäller känslighet och specificitet. Bland dessa metoder är det nukleinsyraamplifieringsbaserade testet: multiplex qRT-PCR, det vanligaste och anses vara guldstandarden för diagnos av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och MERS-CoV.
I denna studie designade och utvärderade vi olika primerkombinationer och sonder för effektiv, exakt och samtidig detektion av SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV med hjälp av standard twist syntetiska virala RNA. De multiplexade analyserna som utvecklats för antingen MERS-CoV- eller SARS-CoV-2-målgener rekommenderas av Världshälsoorganisationen (WHO). Dessa gener kodar i allmänhet för proteiner och komplex som bidrar till bildandet av ett replikations-/transkriptionskomplex (RTC)35, såsom regionen inom den öppna läsramen 1a (ORF1a) som används för MERS-CoV-analys. Dessutom kodas strukturella proteiner av de gener som används i diagnostiska analyser, t.ex. uppströmsregionen av höljegenen (upE) och nukleokapsidgenen (N) som används för MERS-CoV- och SARS-Cov-2-analyser, respektive35,36. Vi använde vårt interna R3T-kit i ett steg RT-qPCR-kit för att etablera RT-qPCR för detektering av virus37. Virusdetektion, känslighet, specificitet och dynamiskt omfång för vårt R3T enstegs RT-qPCR-kit och primer-set testades och utvärderades med hjälp av 10-faldiga serieutspädningar av de syntetiska standard-RNA:erna. Den lägsta praktiska detektionsgränsen var cirka 10 transkriptkopior per reaktion. Som ett resultat kan det interna R3T-enstegs RT-qPCR-kitet och primer-/sonduppsättningarna framgångsrikt användas och implementeras för rutinmässig samtidig diagnos av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

Det svåra akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som orsakar Coronavirus disease 2019 (COVID-19) är ett allvarligt hot mot allmänhetens hälsa. Under influensasäsonger kan spridningen av SARS-CoV-2 och andra luftvägsvirus orsaka en befolkningsomfattande börda av luftvägssjukdomar som är svår att hantera. För det kommer luftvägsvirusen SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) att behöva övervakas noggrant under de kommande höst- och vintersäsongerna, särskilt när det gäller SARS-CoV-2, influensa A och influensa B, som delar liknande epidemiologiska faktorer som mottagliga populationer, överföringssätt och kliniska syndrom. Utan målspecifika analyser kan det vara svårt att skilja mellan fall av dessa virus på grund av deras likheter. Följaktligen kommer en känslig och riktad multiplexanalys som enkelt kan skilja mellan dessa virala mål att vara användbar för vårdpersonal. I denna studie utvecklade vi en realtidsanalys av omvänt transkriptas-PCR med hjälp av ett egenutvecklat R3T enstegs RT-qPCR-kit för samtidig detektion av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopior av deras syntetiska RNA kan vi framgångsrikt identifiera SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och MERS-CoV-mål samtidigt med 100 % specificitet. Denna analys visar sig vara korrekt, pålitlig, enkel, känslig och specifik. Den utvecklade metoden kan användas som en optimerad SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk analys på sjukhus, medicinska centra och diagnostiska laboratorier samt för forskningsändamål.

The pandemic of the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the novel coronavirus known as the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Due to SAR-CoV-2&#39;s strong contagiousness and capacity for rapid transmission, the COVID-19 pandemic emerged in Wuhan City, China, and spread quickly throughout the world. This eventually led to the start of respiratory distress signs and even death2,3,4. COVID-19 has been declared a pandemic in more than 213 countries, expecting a steep increase in the number of confirmed cases, as evidenced by the papers published by different research studies3,5. COVID-19 is transmitted primarily by small respiratory droplets that infected individuals release into the environment and then get exposed to vulnerable individuals through inhalation or close contact with contaminated surfaces. When these droplets come into contact with the mucosa of the eyes, mouth, or nose, a person may become infected6. Statistics released by the World Health Organization (WHO) show that there have been more than 76 million confirmed cases of the pandemic worldwide, with a staggering 7 million deaths7. Thus, the United Nations classified the pandemic caused by COVID-19 disease as a disaster because of its direct impact on the lives of billions of people around the globe and had far-reaching economic, environmental, and social effects.
Public health initiatives including thorough testing, early detection, contact tracing, and case isolation have all been shown to be crucial in keeping this pandemic under control8,9,10,11. The winter months will increase the circulation of other respiratory viruses like Influenza A and B with COVID-19-like symptoms making it difficult to identify, track down, and isolate COVID-19 instances early on. Every year, Influenza A and B outbreak starts in the late fall or early January with a predictable seasonality12. Numerous epidemiological traits are shared by SARS-CoV-2 and Influenza viruses. Besides, sharing similarities in the susceptible populations which include children, the elderly, immunocompromised, and individuals with chronic comorbidities such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cardiac and renal failure, or diabetes12,13. These viruses not only share vulnerable populations but also transmission routes of contact and respiratory droplets14. It is anticipated that patients may likely contract more than one of these respiratory viruses as flu season approaches14. For that, the screening of SARS-CoV-2 and the Influenza viruses needs to be done on symptomatic patients before they are isolated. Running separate tests for the three viruses (SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B) is not possible due to the global lack of resources for nucleic acid extraction and diagnostics. In order to screen them all in one reaction, a method or test needs to be developed.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is a human coronavirus (CoV) family member. The first MERS-CoV virus isolates came from a hospitalized patient in Saudi Arabia who had died in September 2012 due to acute respiratory issues15. There is evidence that suggests that a prominent reservoir host for MERS-CoV is dromedary camels. It has been proven that viruses from infected dromedary camels are zoonotic and thus can infect humans16,17. Humans infected with this virus can spread it to others through close contact18. As of January 26th,&#160;2018, there had been 2143 laboratory-confirmed cases of MERS-CoV infection including 750 deaths globally19. The most typical MERS-CoV symptoms are coughing, fever, and shortness of breath. MERS-CoV infections have also been reported to exhibit pneumonia, diarrhea and gastrointestinal sickness symptoms20. Currently, no commercial vaccine or specific treatment for MERS-CoV is available. Therefore, prompt and precise diagnosis is essential for preventing the widespread MERS-CoV outbreaks and differentiating MERS-CoV from SARS-CoV-2 disease.
To date, many approaches have been proposed to detect these viruses such as multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, paper-based biomolecular sensors31, SHERLOCK testing in one pot32, DNA aptamer33, loop-mediated isothermal amplification (LAMP)19,34, etc. Each of the aforementioned methods has unique benefits and drawbacks in terms of sensitivity and specificity. Among these methods, the nucleic acid amplification-based test: multiplex qRT-PCR, is the most common and is considered to be the gold standard for the diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV.
In this study, we designed and assessed various primer combinations and probes for the effective, accurate, and simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV utilizing standard twist synthetic viral RNAs. The multiplexed assays developed for either MERS-CoV or SARS-CoV-2 target genes are recommended by the World Health Organization (WHO). These genes generally encode proteins and complexes that contribute to the formation of a replication/transcription complex (RTC)35 such as the region within the open reading frame 1a (ORF1a) that is used for MERS-CoV assay. In addition, structural proteins are encoded by the genes utilized in diagnostic assays such as the upstream region of envelope gene (upE) and nucleocapsid gene (N) which are used for MERS-CoV and SARS-Cov-2 assays, respectively35,36. We used in-house R3T one-step RT-qPCR kit to establish the RT-qPCR for the detection of viruses37. Virus detection, sensitivity, specificity, and dynamic range of our R3T one-step RT-qPCR kit and primer sets were tested and evaluated using 10-fold serial dilutions of the standard twist synthetic RNAs. The lowest practical detection limit was approximately 10 transcripts copies per reaction. As a result, the in-house R3T one-step RT-qPCR kit and primer/probe sets can be successfully used and implemented for routine simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Författare i fokus: Framsteg inom multiplex-detektion av luftvägsvirus 

Utveckling av multiplexa realtids-RT-qPCR-analyser för detektion av SARS-CoV-2, influensa A/B och MERS-CoV

Under de senaste åren har det skett betydande framsteg i den diagnostiska metoden för att upptäcka vanliga luftvägsvirus med hjälp av PCR-metoder 21,22,23,24,25. Men trots dessa framsteg har den multiplexade metoden, som gör det möjligt att upptäcka flera virus i ett enda test, inte implementerats i någon större utsträckning, särskilt inte i RT-qPC...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Vi presenterar två probbaserade enstegs RT-qPCR-kit för vanliga luftvägsvirus. Den första analysen är för SARS-CoV-2 (N), influensa A (H1N1 och H3N2) och influensa B. Den andra är för SARS-Cov-2 (N) och MERS (UpE och ORF1a). Dessa analyser kan framgångsrikt implementeras i alla specialiserade laboratorier.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...

development-multiplex-real-time-rt-qpcr-assays-for-detection-sars-cov

Research

JoVE Journal

Biology

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general public&#39;s health. During influenza seasons, the spread of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses may cause a population-wide burden of respiratory disease that is difficult to manage. For that, the respiratory viruses SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) will need to be carefully watched over in the upcoming fall and winter seasons, particularly in the case of SARS-CoV-2, Influenza A, and Influenza B, which share similar epidemiological factors like susceptible populations, mode of transmission, and clinical syndromes. Without target-specific assays, it can be challenging to differentiate among cases of these viruses owing to their similarities. Accordingly, a sensitive and targeted multiplex assay that can easily differentiate between these viral targets will be useful for healthcare practitioners. In this study, we developed a real-time reverse transcriptase-PCR-based assay utilizing an in-house developed R3T one-step RT-qPCR kit for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV. With as few as 10 copies of their synthetic RNAs, we can successfully identify SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and MERS-CoV targets simultaneously with 100% specificity. This assay is found to be accurate, reliable, simple, sensitive, and specific. The developed method can be used as an optimized SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, and SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostic assay in hospitals, medical centers, and diagnostic laboratories as well as for research purposes.

We present two probe-based in-house one-step RT-qPCR kits for common respiratory viruses. The first assay is for SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 and H3N2), and Influenza B. The second is for SARS-Cov-2 (N) and MERS (UpE and ORF1a). These assays can be successfully implemented in any specialized laboratory.

Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

To begin, prepare the 2X buffer for RT-qPCR in DNase/RNase free water. Store the buffer at minus 20 degrees Celsius until further use. Next, mix the primers and the probes in a 1.5 milliliter tube.Make up the volume with elution buffer. Then store the tube at minus 20 degrees Celsius. Prepare an enzyme mix with Taq polymerase and M-MLV RT in a 1.5 milliliter tube on ice.Make up the volume with Taq polymerase storage buffer. Now re-suspend the viral synthetic RNAs in separate tubes with 100 microliters of Tris-EDTA buffer to make stocks of 10 to the sixth RNA copies per microliter. To mix the virus stocks, add five microliters each of SARS-CoV-2 influenza A and B to 50 microliters of Tris-EDTA buffer.Similarly, mix SARS-CoV-2 and MERS-CoV to obtain a second viral mix. Dilute both mixtures tenfold to obtain a final dilution of 10 RNA copies per microliter. To each well of a 96-well plate, pipette 2X buffer, primer, enzyme, DNase/RNase free water, and the corresponding RNA mixtures.Seal the plate with an adhesive plate seal. Then centrifuge the plate for one minute to collect the liquid at the well bottom. Next, program the PCR machine to accept the fast 96-well block type with the experimental type set to standard curve.Set the reagents to TaqMan reagents and select standard run properties. Define the gene targets and the reporter dye. Then define the sample names for each reaction to be tested and assign targets and samples to the plate layout.Now, input the cycle program into the instrument. Transfer the plate to the real-time qPCR machine in the correct orientation and press run to initiate the cycle. Choose the file location to save the experimental data.Then examine the amplification plots provided by the qPCR program. The two developed kits were able to successfully amplify all three target genes simultaneously with as low as 10 RNA copies per reaction. The amplification efficiencies for all viral titrations were above 99%