Name: Autor im Rampenlicht: Den Geheimnissen des Grauen Stars auf die Spur kommen – Untersuchung von Redox-Reparaturenzymen in Linsenepithelzellen
Uploaded: 2024-06-21T12:30:00
Description: Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

Diese Arbeit wurde unterstützt von NEI R21EY033941 (an Hongli Wu); W81XWH2010896 des Verteidigungsministeriums (an Hongli Wu); R15GM123463-02 (für Kayla Green und Hongli Wu)

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Die Verfahrensgenehmigung wurde vom Animal Care and Use Committee des Health Science Center der University of North Texas erteilt (Protokollnummer: IACUC-2022-0008). In diesen Studien wurden junge C57BL/6J-Mäuse verwendet, die in der Regel unter 2 Wochen alt waren.
1. Nährmediumvorbereitung...

Kultivierung und Charakterisierung von Linsenepithelzellen

<ol>
	<li>Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).</li><li>Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallins+and+their+synthesis+in+human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).</li><li>Lee, C. M., Afshari, N. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+and+the+prevention+of+age-related+cataracts.">Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts.</a> Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+in+the+lens.">Redox regulation in the lens.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).</li><li>Charakidas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+apoptosis+and+cell+proliferation+in+human+age-related+cortical+cataract.">Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract.</a> European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutaredoxin+in+redox+regulation+and+cell+signaling+of+the+lens.">Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens.</a> Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).</li><li>Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+proliferation+of+lens+epithelial+cells+in+culture.">Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture.</a> Cell Biochemistry &amp; Function. 25 (3), 317-321 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+concerning+a+novel+intraocular+lens+for+the+prevention+of+posterior+capsular+opacification.">Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).</li><li>Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+experimental+studies.">Posterior capsule opacification: A review of experimental studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).</li><li>Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. 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G., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture--iv.+Some+characteristics+of+the+process,+including+possible+in+vitro+models+for+pathogenic+processes+in+cataractogenesis.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis.</a> Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.+(i)+effects+of+cell+density,+medium+and+embryonic+age+of+initial+culture.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture.</a> Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).</li><li>Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+lens+epithelial+cells+from+senile+cataract+patients.">Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).</li><li>Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+lens+epithelial+cells+from+cataract+patients+-+association+with+possible+risk+factors+for+posterior+capsule+opacification.">In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification.</a> The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+proliferative+studies+on+ex+vivo+cultured+human+anterior+lens+epithelial+cells+-+relevance+to+capsular+opacification.">Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+establishing+adherent+ex+vivo+explant+cultures+from+human+eye+pathologies+for+use+in+subsequent+calcium+imaging+and+inflammatory+studies.">A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).</li><li>Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+immortalization+of+human+lens+epithelial+cells+in+culture.">Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).</li><li>Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+proliferative+cells+exists+in+mouse+lens+epithelium:+Implications+for+lens+maintenance.">A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).</li><li>Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+shock.+Synthesis+of+heat-shock-like+proteins+in+fresh+primary+cell+cultures.">Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).</li><li>Haykin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimage+analysis+of+cell+physiology+of+primary+lens+epithelial+cells+from+diabetic+and+non-diabetic+cataract+patients.">Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).</li><li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens.">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li><li>Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+rat+lens+epithelial+explants+for+studying+terminal+differentiation.">Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).</li></ol>

Das in diesem Dokument vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung für die erfolgreiche Isolierung, Kultur und Subkultur von primären LECs, komplett mit begleitender Videodokumentation. Der detaillierte visuelle Leitfaden neben den schriftlichen Anweisungen verbessert die Klarheit und Zugänglichkeit des Protokolls und fördert seine Verwendung und Reproduzierbarkeit bei Forschern auf diesem Gebiet. Das ultimative Ziel ist es, zum wachsenden Wissen über die Rolle von LECs bei der Katar...

Die Augenlinse spielt eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie das einfallende Licht auf die Netzhaut fokussiert. Es besteht aus einer transparenten, avaskulären Struktur, die aus spezialisierten Zellen besteht, unter denen Linsenepithelzellen (LECs) eine Schlüsselrolle spielen. LECs befinden sich an der vorderen Oberfläche der Linse und sind für die Aufrechterhaltung ihrer Transparenz, die Regulierung des Wasserhaushalts und die Teilnahme am Wachstum und der Entwicklung der Linseverantwortlich 1,2. LECs sind eine einzigartige Art von Zellen, die sich im vorderen Teil der Linse befinden und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit und Funktion der Linse spielen, indem sie während des gesamten Lebens kontinuierlich Linsenfasern produzieren.
Katarakte sind durch eine fortschreitende Trübung der Linse gekennzeichnet, die zu einer Verzerrung und Streuung des Lichts führt, was zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens führt 3,4. Die genauen Mechanismen, die der Kataraktbildung zugrunde liegen, sind komplex und multifaktoriell und umfassen verschiedene zelluläre und molekulare Prozesse wie UV-Strahlung, oxidative Schäden und Glykation 5,6. Es wurde festgestellt, dass LECs erheblich zur Entwicklung von Katarakten beitragen, was sie zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt macht 1,2,7,8,9.
Darüber hinaus ist eines der drängendsten Probleme in der heutigen Augenheilkunde die relativ hohe Inzidenz der hinteren Kapseltrübung (PCO), auch bekannt als sekundärer Katarakt. PCO ist nach wie vor die häufigste Komplikation nach Kataraktoperationen und betrifft bis zu 20-40% der erwachsenen Patienten und 100% der Kinder innerhalb von 5 Jahren nach der Operation10. PCO wird hauptsächlich durch die verbleibenden LECs verursacht, die nach der Kataraktextraktion im Kapselsack verbleiben. Diese Zellen durchlaufen eine facettenreiche pathophysiologische Transformation, die nicht nur den Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT), sondern auch die Differenzierung von LECs zu Linsenfasern umfasst, was zu einer Zellpopulation führt, die eine Mischung aus LECs, Fasern und Myofibroblasten ist 11,12,13. Die transformierten Zellen vermehren sich und wandern durch die hintere Linsenkapsel, was zu Sehstörungen führt. Das Verständnis des Verhaltens und der Kontrollmechanismen von LECs in Kulturmodellen kann wertvolle Einblicke in die Prävention und das Management von PCO liefern. Daher stellt dieses Protokoll zur Kultivierung von LECs ein wichtiges Werkzeug für Augenforscher dar, die darauf abzielen, diese weit verbreitete postoperative Komplikation zu untersuchen, zu verstehen und letztendlich zu bekämpfen.
Um die Feinheiten der LEC-Biologie und ihre Rolle bei der Kataraktbildung und PCO zu entschlüsseln, ist es wichtig, robuste und reproduzierbare In-vitro-Primärzellkultursysteme zu etablieren. Die primäre LEC-Kultur bietet Forschern eine kontrollierte Umgebung, um die Funktionen, Signalwege und molekularen Eigenschaften von LECs zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung zellulärer Prozesse und der Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen und liefert wertvolle Einblicke in die Linsenphysiologie und -pathologie.
Frühere Forschungen haben unser Verständnis der LEC-Kulturtechniken bereichert 14,15,16,17,18,19,20. Obwohl diese Studien verschiedene Methoden angewendet und signifikante Erkenntnisse über das Verhalten und die Eigenschaften von LECs geliefert haben, fehlt in der aktuellen Literatur ein umfassendes und zugängliches Videoaufzeichnungsprotokoll für die Kultivierung von LECs. Diese Einschränkung kann die Fähigkeit von Anfängern behindern, die Techniken genau zu reproduzieren, und kann zu Inkonsistenzen und Abweichungen in den experimentellen Ergebnissen führen. Durch die Bereitstellung eines Videoaufzeichnungsprotokolls zielt diese Forschungsarbeit darauf ab, diese Lücke zu schließen und eine standardisierte Ressource bereitzustellen, die die Reproduzierbarkeit verbessern und den Wissenstransfer im Bereich der LEC-Kultur erleichtern kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#25300054</td>
			<td>For LECs dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Secondary Antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>#715-545-150</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-605-003</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver safety knife</td>
			<td>Beaver-Visitec International</td>
			<td>#3782235</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsulorhexis forceps</td>
			<td>Titan Medical Instruments</td>
			<td>TMF-124</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#D2650</td>
			<td>For making freezing medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#J67802</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiCGS-a (optional)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4182</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50&#160;mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#62249</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS-5983</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS5137&#160;</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11067-2-AP</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas micro-dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5608</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;A-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28306</td>
			<td>For cell validation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365256</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing mouse primary lens epithelial cell culture: a comprehensive guide to trypsinization

Linsenepithelzellen (LECs) spielen mehrere wichtige Rollen bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion der Linse. LECs bestimmen das Wachstum, die Entwicklung, die Größe und die Transparenz von Linsen. Umgekehrt können dysfunktionale LECs zur Kataraktbildung und zur Trübung der hinteren Kapsel (PCO) führen. Daher ist die Etablierung eines robusten primären LEC-Kultursystems für Forscher wichtig, die sich mit Linsenentwicklung, Biochemie, Katarakttherapeutika und PCO-Prävention befassen. Der Anbau von primären LECs stellt jedoch aufgrund ihrer begrenzten Verfügbarkeit, langsamen Proliferationsrate und empfindlichen Natur seit langem eine Herausforderung dar. 
Diese Studie befasst sich mit diesen Hürden, indem sie ein umfassendes Protokoll für die primäre LEC-Kultur vorstellt. Das Protokoll umfasst wesentliche Schritte wie die Formulierung eines optimierten Nährmediums, die präzise Isolierung von Linsenkapseln, Trypsinisierungstechniken, Subkulturverfahren, Ernteprotokolle sowie Richtlinien für Lagerung und Versand. Während des gesamten Kulturprozesses wurde die Zellmorphologie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie überwacht. 
Um die Authentizität der kultivierten LECs zu bestätigen, wurden Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt, um das Vorhandensein und die subzelluläre Verteilung kritischer Linsenproteine, nämlich αA- und γ-Kristalline, nachzuweisen. Dieses detaillierte Protokoll stattet Forscher mit einer wertvollen Ressource für die Kultivierung und Charakterisierung primärer LECs aus und ermöglicht Fortschritte in unserem Verständnis der Linsenbiologie und der Entwicklung therapeutischer Strategien für linsenbedingte Erkrankungen.

The lens of the eye plays a crucial role in vision by focusing incoming light onto the retina. It consists of a transparent, avascular structure composed of specialized cells, among which lens epithelial cells (LECs) are key players. LECs are located at the anterior surface of the lens and are responsible for maintaining its transparency, regulating water balance, and participating in lens growth and development1,2. LECs are a unique type of cells located at the anterior part of the lens, playing a critical role in maintaining lens clarity and function by continuously producing lens fibers throughout life.
Cataracts are characterized by the progressive clouding of the lens, resulting in the distortion and scattering of light, leading to compromised vision3,4. The precise mechanisms underlying cataract formation are complex and multifactorial, involving various cellular and molecular processes such as UV radiation, oxidative damage, and glycation5,6. LECs have been found to contribute significantly to the development of cataracts, making them a vital focus of research1,2,7,8,9.
Furthermore, one of the most pressing issues in ophthalmology today is the relatively high incidence of posterior capsule opacification (PCO), also known as secondary cataract. PCO remains the most common complication after cataract surgery, affecting up to 20-40% of adult patients and 100% of children within 5 years post surgery10. PCO is primarily caused by the residual LECs that remain in the capsular bag following cataract extraction. These cells undergo a multifaceted pathophysiological transformation involving not only epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) but also the differentiation of LECs to lens fibers, resulting in a cell population that is a mixture of LECs, fibers, and myofibroblasts11,12,13. The transformed cells proliferate and migrate across the posterior lens capsule, leading to visual impairment. Understanding the behavior and control mechanisms of LECs in culture models can provide valuable insights into the prevention and management of PCO. Therefore, this protocol of culturing LECs presents a vital tool for ophthalmic researchers aiming to study, understand, and ultimately combat this prevalent postoperative complication.
To unravel the intricacies of LEC biology and its role in cataract formation and PCO, it is essential to establish robust and reproducible in vitro primary cell culture systems. Primary LEC culture provides researchers with a controlled environment to study the functions, signaling, and molecular characteristics of LECs. Furthermore, it allows for the investigation of cellular processes and the effects of different experimental conditions, providing valuable insights into lens physiology and pathology.
Prior research has enriched our understanding of LEC culture techniques14,15,16,17,18,19,20. Although these studies have employed various methodologies and yielded significant findings on LEC behavior and characteristics, a comprehensive and accessible video recording protocol for culturing LECs is absent in the current literature. This limitation can hinder novice researchers&#39; ability to accurately reproduce the techniques and can lead to inconsistencies and variations in experimental results. By providing a video recording protocol, this research paper aims to bridge this gap and provide a standardized resource that can enhance reproducibility and facilitate knowledge transfer in the field of LEC culture.

Autor im Rampenlicht: Den Geheimnissen des Grauen Stars auf die Spur kommen – Untersuchung von Redox-Reparaturenzymen in Linsenepithelzellen

Optimierung der Epithelzellkultur der Maus-Primärlinse: Ein umfassender Leitfaden zur Trypsinisierung

Our research objective is to explore the underlying causes of cataracts with a particular emphasis on the function of redox repair enzymes. Our aim is to identify the critical role this enzyme play in lens protection, and to establish their potential as drug targets for cataract prevention and treatment. Among many exciting technologies, our research uses lens epithelial cells as a foundational platform.This approach is critical for unraveling the mechanism behind cataract formation, posterior capsule opacification, and the discovery of new anti-cataract drugs. Moving forward, we will focus on understanding the impact of antioxidant enzymes and aging on lens functionality. Our goal is to discover innovative antioxidant treatments that can delay lens aging, prevent cataracts, and provide effective intervention for PCO.

Wie in Abbildung 2 gezeigt, hafteten die primären LECs von C57BL/6J-Mäusen innerhalb eines Zeitraums von 4 Stunden an den Schüsseln. Insbesondere gab es sichtbare Überreste anderer Gewebe wie Abschnitte der hinteren Kapsel und Linsenfaserzellen. Diese unbeabsichtigten Elemente hafteten jedoch nicht an der Schale und konnten daher durch einen Wechsel des Nährmediums entfernt werden. Anschließend, zwischen dem dritten und fünften Tag, leiteten die LECs ihre Proliferationsphase ein. Zwis...

Dieses Manuskript skizziert ein detailliertes Videoprotokoll für die Kultivierung von primären Linsenepithelzellen (LECs), das darauf abzielt, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Forschung bei Katarakten und hinterer Kapseltrübung (PCO) zu unterstützen. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Linsendissektion, LECs-Isolierung und Validierung und dient insbesondere für Neueinsteiger auf diesem Gebiet als wertvoller Leitfaden.

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

Unser Forschungsziel ist es, die zugrunde liegenden Ursachen von Katarakten zu erforschen, wobei der Schwerpunkt auf der Funktion von Redoxreparaturenzymen liegt. Unser Ziel ist es, die entscheidende Rolle dieses Enzyms beim Linsenschutz zu identifizieren und sein Potenzial als Wirkstoffziele für die Kataraktprävention und -behandlung zu ermitteln. Neben vielen aufregenden Technologien nutzt unsere Forschung Linsenepithelzellen als grundlegende Plattform.Dieser Ansatz ist entscheidend für die Entschlüsselung des Mechanismus hinter der Kataraktbildung, der Trübung der hinteren Kapsel und der Entdeckung neuer Medikamente gegen Katarakt. In Zukunft werden wir uns darauf konzentrieren, die Auswirkungen von antioxidativen Enzymen und dem Altern auf die Linsenfunktionalität zu verstehen. Unser Ziel ist es, innovative antioxidative Behandlungen zu entdecken, die die Linsenalterung verzögern, Katarakte verhindern und eine wirksame Intervention bei PCO bieten können.

optimizing-mouse-primary-lens-epithelial-cell-culture-comprehensive

Research

JoVE Journal

Biology

Optimizing Mouse Primary Lens Epithelial Cell Culture: A Comprehensive Guide to Trypsinization

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, development, size, and transparency. Conversely, dysfunctional LECs can lead to cataract formation and posterior capsule opacification (PCO). Consequently, establishing a robust primary LEC culture system is important to researchers engaged in lens development, biochemistry, cataract therapeutics, and PCO prevention. However, cultivating primary LECs has long presented challenges due to their limited availability, slow proliferation rate, and delicate nature. 
This study addresses these hurdles by presenting a comprehensive protocol for primary LEC culture. The protocol encompasses essential steps such as the formulation of an optimized culture medium, precise isolation of lens capsules, trypsinization techniques, subculture procedures, harvest protocols, and guidelines for storage and shipment. Throughout the culture process, cell morphology was monitored using phase-contrast microscopy. 
To confirm the authenticity of the cultured LECs, immunofluorescence assays were conducted to detect the presence and subcellular distribution of critical lens proteins, namely &#945;A- and &#947;-crystallins. This detailed protocol equips researchers with a valuable resource for cultivating and characterizing primary LECs, enabling advancements in our comprehension of lens biology and the development of therapeutic strategies for lens-related disorders.

This manuscript outlines a detailed video protocol for culturing primary lens epithelial cells (LECs), aiming to improve reproducibility and aid research in cataracts and posterior capsule opacification (PCO). It offers step-by-step instructions on lens dissection, LECs isolation, and validation, serving as a valuable guide, especially for newcomers in the field.