Name: Yazar Spotlight: Kataraktın Sırlarını Çözmek – Lens Epitel Hücrelerinde Redoks Onarım Enzimlerinin Araştırılması
Uploaded: 2024-06-21T12:30:00
Description: Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

Bu çalışma NEI R21EY033941 (Hongli Wu'ya) tarafından desteklendi; Savunma Bakanlığı W81XWH2010896 (Hongli Wu'ya); R15GM123463-02 (Kayla Green ve Hongli Wu'ya)

Tüm hayvan deneyleri, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirildi. Prosedür onayı, Kuzey Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından verilmiştir (protokol numarası: IACUC-2022-0008). Bu çalışmalarda tipik olarak 2 haftalıktan küçük genç C57BL / 6J fareleri kullanılmıştır.
1. Kültür ortamı hazır...

Lens Epitel Hücrelerinin Yetiştirilmesi ve Karakterizasyonu

<ol>
	<li>Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).</li><li>Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallins+and+their+synthesis+in+human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).</li><li>Lee, C. M., Afshari, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+state+of+cataract+blindness.">The global state of cataract blindness.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).</li><li>Khairallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+people+blind+or+visually+impaired+by+cataract+worldwide+and+in+world+regions,+1990+to+2010.">Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).</li><li>Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+and+the+prevention+of+age-related+cataracts.">Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts.</a> Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+in+the+lens.">Redox regulation in the lens.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).</li><li>Charakidas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+apoptosis+and+cell+proliferation+in+human+age-related+cortical+cataract.">Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract.</a> European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutaredoxin+in+redox+regulation+and+cell+signaling+of+the+lens.">Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens.</a> Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).</li><li>Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+proliferation+of+lens+epithelial+cells+in+culture.">Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture.</a> Cell Biochemistry &amp; Function. 25 (3), 317-321 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+concerning+a+novel+intraocular+lens+for+the+prevention+of+posterior+capsular+opacification.">Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).</li><li>Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+experimental+studies.">Posterior capsule opacification: A review of experimental studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).</li><li>Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+the+aetiopathogenesis,+experimental+and+clinical+studies+and+factors+for+prevention.">Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+lens+epithelial+cells+suppress+proliferation+and+epithelial-mesenchymal+transition-relevance+for+posterior+capsule+opacification.">Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification.</a> Cells. 11 (13), 2001 (2022).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture--iv.+Some+characteristics+of+the+process,+including+possible+in+vitro+models+for+pathogenic+processes+in+cataractogenesis.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis.</a> Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.+(i)+effects+of+cell+density,+medium+and+embryonic+age+of+initial+culture.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture.</a> Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).</li><li>Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+lens+epithelial+cells+from+senile+cataract+patients.">Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).</li><li>Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+lens+epithelial+cells+from+cataract+patients+-+association+with+possible+risk+factors+for+posterior+capsule+opacification.">In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification.</a> The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+proliferative+studies+on+ex+vivo+cultured+human+anterior+lens+epithelial+cells+-+relevance+to+capsular+opacification.">Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+establishing+adherent+ex+vivo+explant+cultures+from+human+eye+pathologies+for+use+in+subsequent+calcium+imaging+and+inflammatory+studies.">A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).</li><li>Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+immortalization+of+human+lens+epithelial+cells+in+culture.">Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).</li><li>Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+proliferative+cells+exists+in+mouse+lens+epithelium:+Implications+for+lens+maintenance.">A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).</li><li>Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+shock.+Synthesis+of+heat-shock-like+proteins+in+fresh+primary+cell+cultures.">Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).</li><li>Haykin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimage+analysis+of+cell+physiology+of+primary+lens+epithelial+cells+from+diabetic+and+non-diabetic+cataract+patients.">Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).</li><li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens.">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li><li>Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+rat+lens+epithelial+explants+for+studying+terminal+differentiation.">Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).</li></ol>

Bu belgede sunulan protokol, birincil LEC'lerin başarılı izolasyonu, kültürü ve alt kültürü için kapsamlı, adım adım bir kılavuz ve beraberindeki video belgeleriyle birlikte sunulmaktadır. Yazılı talimatların yanı sıra ayrıntılı görsel kılavuz, protokolün netliğini ve erişilebilirliğini artırarak alandaki araştırmacılar arasında kullanımını ve tekrarlanabilirliğini teşvik eder. Nihai amaç, katarakt cerrahisini takiben yaygın bir komplikasyon olan katarakt oluşumu ve PCO'da LEC'le...

Göz merceği, gelen ışığı retinaya odaklayarak görmede çok önemli bir rol oynar. Lens epitel hücrelerinin (LEC'ler) anahtar oyuncular olduğu özel hücrelerden oluşan şeffaf, avasküler bir yapıdan oluşur. LEC'ler lensin ön yüzeyinde bulunur ve şeffaflığını korumaktan, su dengesini düzenlemekten ve lens büyümesine ve gelişimine katılmaktansorumludur 1,2. LEC'ler, lensin ön kısmında bulunan benzersiz bir hücre türüdür ve yaşam boyunca sürekli olarak lens lifleri üreterek lens netliğini ve işlevini korumada kritik bir rol oynar.
Katarakt, merceğin ilerleyici bulanıklaşması ile karakterizedir, bu da ışığın bozulmasına ve saçılmasına neden olarak görme bozukluğuna yol açar 3,4. Katarakt oluşumunun altında yatan kesin mekanizmalar, UV radyasyonu, oksidatif hasar ve glikasyon gibi çeşitli hücresel ve moleküler süreçleri içeren karmaşık ve çok faktörlüdür 5,6. LEC'lerin katarakt gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunduğu bulunmuştur ve bu da onları araştırmaların hayati bir odak noktası haline getirmiştir 1,2,7,8,9.
Ayrıca, günümüzde oftalmolojideki en acil konulardan biri, sekonder katarakt olarak da bilinen posterior kapsül opaklaşmasının (PCO) nispeten yüksek insidansıdır. PKO, katarakt ameliyatından sonra en sık görülen komplikasyon olmaya devam etmekte olup, ameliyattan sonraki 5 yıl içinde yetişkin hastaların %20-40'ını ve çocukların %100'ünü etkilemektedir10. PCO'ya öncelikle katarakt ekstraksiyonunu takiben kapsül torbasında kalan rezidüel LEC'ler neden olur. Bu hücreler, sadece epitelden mezenkimal geçişe (EMT) değil, aynı zamanda LEC'lerin lens liflerine farklılaşmasını da içeren çok yönlü bir patofizyolojik dönüşüme uğrar, bu da LEC'lerin, liflerin ve miyofibroblastların bir karışımı olan bir hücre popülasyonu ile sonuçlanır 11,12,13. Dönüştürülen hücreler çoğalır ve arka lens kapsülü boyunca göç ederek görme bozukluğuna yol açar. Kültür modellerinde LEC'lerin davranış ve kontrol mekanizmalarını anlamak, PKO'nun önlenmesi ve yönetimi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, LEC'lerin kültürlenmesine yönelik bu protokol, bu yaygın postoperatif komplikasyonu incelemeyi, anlamayı ve nihayetinde bunlarla mücadele etmeyi amaçlayan oftalmik araştırmacılar için hayati bir araç sunmaktadır.
LEC biyolojisinin inceliklerini ve katarakt oluşumu ve PCO'daki rolünü çözmek için sağlam ve tekrarlanabilir in vitro primer hücre kültürü sistemleri kurmak esastır. Birincil LEC kültürü, araştırmacılara LEC'lerin işlevlerini, sinyalizasyonunu ve moleküler özelliklerini incelemek için kontrollü bir ortam sağlar. Ayrıca, hücresel süreçlerin ve farklı deneysel koşulların etkilerinin araştırılmasına olanak tanıyarak lens fizyolojisi ve patolojisi hakkında değerli bilgiler sağlar.
Önceki araştırmalar, LEC kültür teknikleri 14,15,16,17,18,19,20 hakkındaki anlayışımızı zenginleştirdi. Bu çalışmalar çeşitli metodolojiler kullanmış ve LEC davranışı ve özellikleri hakkında önemli bulgular vermiş olsa da, mevcut literatürde LEC'leri kültürlemek için kapsamlı ve erişilebilir bir video kayıt protokolü yoktur. Bu sınırlama, acemi araştırmacıların teknikleri doğru bir şekilde yeniden üretme yeteneğini engelleyebilir ve deneysel sonuçlarda tutarsızlıklara ve farklılıklara yol açabilir. Bu araştırma makalesi, bir video kayıt protokolü sağlayarak bu boşluğu doldurmayı ve LEC kültürü alanında tekrarlanabilirliği artırabilecek ve bilgi aktarımını kolaylaştırabilecek standartlaştırılmış bir kaynak sağlamayı amaçlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#25300054</td>
			<td>For LECs dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Secondary Antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>#715-545-150</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-605-003</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver safety knife</td>
			<td>Beaver-Visitec International</td>
			<td>#3782235</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsulorhexis forceps</td>
			<td>Titan Medical Instruments</td>
			<td>TMF-124</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#D2650</td>
			<td>For making freezing medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#J67802</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiCGS-a (optional)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4182</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50&#160;mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#62249</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS-5983</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS5137&#160;</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11067-2-AP</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas micro-dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5608</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;A-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28306</td>
			<td>For cell validation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365256</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing mouse primary lens epithelial cell culture: a comprehensive guide to trypsinization

Lens epitel hücreleri (LEC'ler), lensin homeostazını ve normal fonksiyonunu korumada birçok önemli rol oynar. LEC'ler lens büyümesini, gelişimini, boyutunu ve şeffaflığını belirler. Tersine, işlevsiz LEC'ler katarakt oluşumuna ve arka kapsül opaklaşmasına (PCO) yol açabilir. Sonuç olarak, sağlam bir birincil LEC kültür sistemi oluşturmak, lens geliştirme, biyokimya, katarakt terapötikleri ve PCO önleme ile uğraşan araştırmacılar için önemlidir. Bununla birlikte, birincil LEC'lerin yetiştirilmesi, sınırlı kullanılabilirlikleri, yavaş çoğalma oranları ve hassas yapıları nedeniyle uzun süredir zorluklar ortaya çıkarmaktadır. 
Bu çalışma, birincil LEC kültürü için kapsamlı bir protokol sunarak bu engelleri ele almaktadır. Protokol, optimize edilmiş bir kültür ortamının formülasyonu, lens kapsüllerinin hassas izolasyonu, tripsinizasyon teknikleri, alt kültür prosedürleri, hasat protokolleri ve depolama ve sevkiyat kılavuzları gibi temel adımları kapsar. Kültür işlemi boyunca, hücre morfolojisi faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlendi. 
Kültürlenmiş LEC'lerin gerçekliğini doğrulamak için, kritik lens proteinlerinin, yani αA- ve γ-kristalinlerin varlığını ve hücre altı dağılımını tespit etmek için immünofloresan testleri yapılmıştır. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıları birincil LEC'leri geliştirmek ve karakterize etmek için değerli bir kaynakla donatarak, lens biyolojisini anlamamızda ve lensle ilgili bozukluklar için terapötik stratejilerin geliştirilmesinde ilerlemeler sağlar.

The lens of the eye plays a crucial role in vision by focusing incoming light onto the retina. It consists of a transparent, avascular structure composed of specialized cells, among which lens epithelial cells (LECs) are key players. LECs are located at the anterior surface of the lens and are responsible for maintaining its transparency, regulating water balance, and participating in lens growth and development1,2. LECs are a unique type of cells located at the anterior part of the lens, playing a critical role in maintaining lens clarity and function by continuously producing lens fibers throughout life.
Cataracts are characterized by the progressive clouding of the lens, resulting in the distortion and scattering of light, leading to compromised vision3,4. The precise mechanisms underlying cataract formation are complex and multifactorial, involving various cellular and molecular processes such as UV radiation, oxidative damage, and glycation5,6. LECs have been found to contribute significantly to the development of cataracts, making them a vital focus of research1,2,7,8,9.
Furthermore, one of the most pressing issues in ophthalmology today is the relatively high incidence of posterior capsule opacification (PCO), also known as secondary cataract. PCO remains the most common complication after cataract surgery, affecting up to 20-40% of adult patients and 100% of children within 5 years post surgery10. PCO is primarily caused by the residual LECs that remain in the capsular bag following cataract extraction. These cells undergo a multifaceted pathophysiological transformation involving not only epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) but also the differentiation of LECs to lens fibers, resulting in a cell population that is a mixture of LECs, fibers, and myofibroblasts11,12,13. The transformed cells proliferate and migrate across the posterior lens capsule, leading to visual impairment. Understanding the behavior and control mechanisms of LECs in culture models can provide valuable insights into the prevention and management of PCO. Therefore, this protocol of culturing LECs presents a vital tool for ophthalmic researchers aiming to study, understand, and ultimately combat this prevalent postoperative complication.
To unravel the intricacies of LEC biology and its role in cataract formation and PCO, it is essential to establish robust and reproducible in vitro primary cell culture systems. Primary LEC culture provides researchers with a controlled environment to study the functions, signaling, and molecular characteristics of LECs. Furthermore, it allows for the investigation of cellular processes and the effects of different experimental conditions, providing valuable insights into lens physiology and pathology.
Prior research has enriched our understanding of LEC culture techniques14,15,16,17,18,19,20. Although these studies have employed various methodologies and yielded significant findings on LEC behavior and characteristics, a comprehensive and accessible video recording protocol for culturing LECs is absent in the current literature. This limitation can hinder novice researchers&#39; ability to accurately reproduce the techniques and can lead to inconsistencies and variations in experimental results. By providing a video recording protocol, this research paper aims to bridge this gap and provide a standardized resource that can enhance reproducibility and facilitate knowledge transfer in the field of LEC culture.

Yazar Spotlight: Kataraktın Sırlarını Çözmek – Lens Epitel Hücrelerinde Redoks Onarım Enzimlerinin Araştırılması

Fare Primer Lens Epitel Hücre Kültürünü Optimize Etme: Tripsinizasyon için Kapsamlı Bir Kılavuz

Our research objective is to explore the underlying causes of cataracts with a particular emphasis on the function of redox repair enzymes. Our aim is to identify the critical role this enzyme play in lens protection, and to establish their potential as drug targets for cataract prevention and treatment. Among many exciting technologies, our research uses lens epithelial cells as a foundational platform.This approach is critical for unraveling the mechanism behind cataract formation, posterior capsule opacification, and the discovery of new anti-cataract drugs. Moving forward, we will focus on understanding the impact of antioxidant enzymes and aging on lens functionality. Our goal is to discover innovative antioxidant treatments that can delay lens aging, prevent cataracts, and provide effective intervention for PCO.

Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu protokolü izleyerek, C57BL / 6J farelerinden elde edilen birincil LEC'ler 4 saatlik bir süre içinde bulaşıklara yapıştı. Özellikle, arka kapsül kesitleri ve lens lifi hücreleri gibi diğer dokuların görünür kalıntıları vardı. Bununla birlikte, bu istenmeyen unsurlar yemeğe yapışmamıştır ve bu nedenle kültür ortamı değiştirilerek çıkarılabilir. Daha sonra, üçüncü ve beşinci günler arasında, LEC'ler çoğalma aşamalar...

Bu makale, katarakt ve arka kapsül opaklaşmasında (PCO) tekrarlanabilirliği iyileştirmeyi ve araştırmalara yardımcı olmayı amaçlayan primer lens epitel hücrelerinin (LEC'ler) kültürlenmesi için ayrıntılı bir video protokolünü özetlemektedir. Lens diseksiyonu, LEC izolasyonu ve validasyonu hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle bu alanda yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

Araştırma amacımız, redoks onarım enzimlerinin işlevine özel bir vurgu yaparak kataraktın altında yatan nedenleri araştırmaktır. Amacımız, bu enzimin lens korumasında oynadığı kritik rolü belirlemek ve kataraktın önlenmesi ve tedavisi için ilaç hedefleri olarak potansiyellerini belirlemektir. Birçok heyecan verici teknolojinin yanı sıra, araştırmamız lens epitel hücrelerini temel bir platform olarak kullanıyor.Bu yaklaşım, katarakt oluşumunun, arka kapsül opaklaşmasının ve yeni anti-katarakt ilaçlarının keşfinin arkasındaki mekanizmayı çözmek için kritik öneme sahiptir. İleriye dönük olarak, antioksidan enzimlerin ve yaşlanmanın gözlük camı işlevselliği üzerindeki etkisini anlamaya odaklanacağız. Amacımız, lens yaşlanmasını geciktirebilen, kataraktı önleyebilen ve PKO için etkili müdahale sağlayabilen yenilikçi antioksidan tedavileri keşfetmektir.

optimizing-mouse-primary-lens-epithelial-cell-culture-comprehensive

Research

JoVE Journal

Biology

Optimizing Mouse Primary Lens Epithelial Cell Culture: A Comprehensive Guide to Trypsinization

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, development, size, and transparency. Conversely, dysfunctional LECs can lead to cataract formation and posterior capsule opacification (PCO). Consequently, establishing a robust primary LEC culture system is important to researchers engaged in lens development, biochemistry, cataract therapeutics, and PCO prevention. However, cultivating primary LECs has long presented challenges due to their limited availability, slow proliferation rate, and delicate nature. 
This study addresses these hurdles by presenting a comprehensive protocol for primary LEC culture. The protocol encompasses essential steps such as the formulation of an optimized culture medium, precise isolation of lens capsules, trypsinization techniques, subculture procedures, harvest protocols, and guidelines for storage and shipment. Throughout the culture process, cell morphology was monitored using phase-contrast microscopy. 
To confirm the authenticity of the cultured LECs, immunofluorescence assays were conducted to detect the presence and subcellular distribution of critical lens proteins, namely &#945;A- and &#947;-crystallins. This detailed protocol equips researchers with a valuable resource for cultivating and characterizing primary LECs, enabling advancements in our comprehension of lens biology and the development of therapeutic strategies for lens-related disorders.

This manuscript outlines a detailed video protocol for culturing primary lens epithelial cells (LECs), aiming to improve reproducibility and aid research in cataracts and posterior capsule opacification (PCO). It offers step-by-step instructions on lens dissection, LECs isolation, and validation, serving as a valuable guide, especially for newcomers in the field.