Name: A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation och Brain Injury Association of America. C.G. stöds av NIH F31NS130909. Figur 1A skapades med BioRender.com.

1. Differentiera iPSCs till iBBB-celler
OBS: Dessa differentieringsprotokoll har tidigare beskrivits i Mesentier-Louro et al.34.
<ol><li>Beläggning av cellodlingsplattor<ol><li>Upptining reducerade membranmatrisen med tillväxtfaktor (GF) över natten vid 4 °C. Späd 500 μl basalmembranmatris i 49,5 ml DMEM. Förvara denna lösning kall för att förhindra för tidig polymerisation av beläggningslösningen.</li>
		<li>Tillsätt 1-2 ml per brunn a...

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

BBB-dysfunktion är en komorbiditet och potentiellt en orsak eller förvärrande faktor i många neurologiska sjukdomar 7,40,41. Det är dock nästan omöjligt att studera den molekylär- och cellbiologi som ligger till grund för dysfunktion och nedbrytning av BBB hos människor med neurovaskulär sjukdom. Den inducerbara BBB (iBBB) som presenteras i detta protokoll ger ett in vitro-system som rekapitulerar viktiga cel...

Blod-hjärnbarriären (BBB) är ett viktigt mikrovaskulärt nätverk som separerar det centrala nervsystemet (CNS) från periferin för att upprätthålla en idealisk miljö för korrekt neuronal funktion. Det har en avgörande roll för att reglera inflödet och utflödet av ämnen till CNS genom att upprätthålla metabolisk homeostas 1,2,3,4, rensa avfall 4,5,6 och skydda hjärnan från patogener och toxiner 7,8.
Den primära celltypen av BBB är endotelcellen (EC). Endotelceller, härstammande från mesodermlinjen, bildar kärlväggarna 1,9. Mikrovaskulära EC:er bildar täta korsningar med varandra för att kraftigt minska permeabiliteten hos deras membran 10,11,12,13,14 samtidigt som transportörer uttrycks för att underlätta förflyttningen av näringsämnen in i och ut ur CNS 1,4,12,14 . Mikrovaskulära ECs är omgivna av pericyter (PCs)-muralceller som reglerar mikrovaskulär funktion och homeostas och är avgörande för att reglera permeabiliteten hos BBB för molekyler och immunceller 15,16,17. Astrocyten, en viktig gliacellstyp, är den slutliga celltypen som består av BBB. Astrocyternas ändfötter lindas runt EC-PC-kärlrören medan cellkropparna sträcker sig in i hjärnans parenkym och bildar en förbindelse mellan nervceller och kärl1. Distinkta lösta ämnen och substrattransportörer är lokaliserade på astrocyternas ändfötter (t.ex. aquaporin 4 [AQP-4]) som har en kritisk roll i BBB-funktion 18,19,20,21.
BBB är avgörande för att upprätthålla korrekt hjärnhälsofunktion, och dysfunktion av BBB har rapporterats vid många neurologiska sjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom (AD) 22,23,24,25, multipel skleros 7,26,27,28, epilepsi 29,30 och stroke31,32. Det är alltmer erkänt att cerebrovaskulära abnormiteter spelar en central roll i neurodegeneration, vilket bidrar till ökad känslighet för ischemiska och hemorragiska händelser. Till exempel har mer än 90 % av AD-patienterna cerebral amyloid angiopati (CAA), ett tillstånd som kännetecknas av avsättning av amyloid β (Aβ) längs hjärnans kärl. CAA ökar BBB-permeabiliteten och minskar BBB-funktionen, vilket gör CNS sårbart för ischemi, hemorragiska händelser och accelererad kognitiv försämring33.
Vi har nyligen utvecklat en in vitro-modell av humant BBB, härledd från patientinducerade pluripotenta stamceller, som innehåller EC, PC och astrocyter inkapslade i en 3D-matris (Figur 1A). iBBB rekapitulerar fysiologiskt relevanta interaktioner, inklusive kärlrörsbildning och lokalisering av astrocytändfötter med vaskulatur24. Vi använde iBBB för att modellera känsligheten hos CAA medierad av APOE4 (figur 1B). Detta gjorde det möjligt för oss att identifiera de kausala cellulära och molekylära mekanismerna genom vilka APOE4 främjar CAA, och utnyttja dessa insikter för att utveckla terapeutiska strategier som minskar CAA-patologi och förbättrar inlärning och minne in vivo i APOE4-möss24. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll och videohandledning för att rekonstruera BBB från humana iPSC:er och modellera CAA in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6e10 amyloid-&#946; antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SIG-39320</td>
			<td>Used at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>20-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Various</td>
			<td>Used at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amyloid-beta 40 fibril</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-24235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amyloid-beta 42 fibril</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquaporin-4 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-53234</td>
			<td>Used at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Astrocyte basal media and supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-05ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cyamn Chemical</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G slide mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100502-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1099/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom 48-well Culture Dishes</td>
			<td>Mattek Corporation</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial Serum-free medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>S30-100mL</td>
			<td>Use serum to match secondary antibody host</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF385</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF806</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>&#160;Catalog #168805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100B antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2532-100uL</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB43152</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>22870</td>
			<td>Used at 25uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-cadherin (CD144) antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF938</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA3-39100-A488</td>
			<td>Dilution = 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstruction of the blood-brain barrier in vitro to model and therapeutically target neurological disease

Blod-hjärnbarriären (BBB) är en viktig fysiologisk komponent i det centrala nervsystemet (CNS), som upprätthåller näringsämnen, rensar avfall och skyddar hjärnan från patogener. De inneboende barriäregenskaperna hos BBB utgör en utmaning för terapeutisk läkemedelsleverans till CNS för att behandla neurologiska sjukdomar. Nedsatt BBB-funktion har kopplats till neurologisk sjukdom. Cerebral amyloidangiopati (CAA), avsättning av amyloid i hjärnans kärl som leder till en komprometterad BBB, är en komorbiditet i de flesta fall av Alzheimers sjukdom (AD), vilket tyder på att BBB-dysfunktion eller nedbrytning kan vara involverad i neurodegeneration. På grund av begränsad tillgång till mänsklig BBB-vävnad är mekanismerna som bidrar till korrekt BBB-funktion och BBB-degeneration fortfarande okända. För att ta itu med dessa begränsningar har vi utvecklat en human pluripotent stamcellshärledd BBB (iBBB) genom att införliva endotelceller, pericyter och astrocyter i en 3D-matris. iBBB monterar sig själv för att rekapitulera anatomin och cellulära interaktioner som finns i BBB. Sådd av iBBB med amyloid fångar viktiga aspekter av CAA. Dessutom erbjuder iBBB en flexibel plattform för att modulera genetiska och miljömässiga faktorer som är inblandade i cerebrovaskulär sjukdom och neurodegeneration, för att undersöka hur genetik och livsstil påverkar sjukdomsrisken. Slutligen kan iBBB användas för läkemedelsscreening och läkemedelskemiska studier för att optimera terapeutisk leverans till CNS. I detta protokoll beskriver vi differentieringen av de tre typerna av celler (endotelceller, pericyter och astrocyter) som härrör från humana pluripotenta stamceller, hur man sätter ihop de differentierade cellerna till iBBB och hur man modellerar CAA in vitro med hjälp av exogent amyloid. Denna modell övervinner utmaningen att studera levande mänsklig hjärnvävnad med ett system som har både biologisk trohet och experimentell flexibilitet, och möjliggör förhör av den mänskliga BBB och dess roll i neurodegeneration.

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

En korrekt formad iBBB stelnar till en enda genomskinlig skiva (figur 3A). Det är normalt att iBBB lossnar från ytan där den först pipetterades efter några dagar. Detta kan inte undvikas, men är inte ett stort problem för den korrekta bildningen av iBBB om försiktighet iakttas vid byte av media för att inte oavsiktligt aspirera iBBB. Efter 24 timmar, jämnt fördelade, kan enskilda celler identifieras under ett ljusfältsmikroskop (figur 3B). Efter 2 ve...

Watch this Scientific Journal Video about A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model at JoVE.com

A Personalized Approach Towards Investigating Alzheimer's Disease Using an In Vitro Blood-Brain Barrier Model (Video) | JoVE

Blod-hjärnbarriären (BBB) har en avgörande roll för att upprätthålla en stabil och hälsosam hjärnmiljö. BBB-dysfunktion är förknippad med många neurologiska sjukdomar. Vi har utvecklat en 3D, stamcellsbaserad modell av BBB för att undersöka cerebrovaskulär patologi, BBB-integritet och hur BBB förändras av genetik och sjukdom.

Rekonstruktion av blod-hjärnbarriären in vitro för att modellera och terapeutiskt rikta in sig på neurologiska sjukdomar

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

Vårt mål är att bestämma de molekylära och cellulära mekanismerna som medierar Alzheimers sjukdomspatogenes för att avslöja terapeutiska och diagnostiska möjligheter. För närvarande är de molekylära vägar och mekanismer som är involverade i uppkomsten och utvecklingen av Alzheimers sjukdom dåligt kända. Detta beror på att musmodeller och andra in vitro-modeller för Alzheimers sjukdom misslyckas med att rekapitulera den unika mänskliga biologin som är avgörande för utvecklingen av sjukdomen.Vi har utvecklat en in vitro-modell av blod-hjärnbarriären som kan användas för att studera cerebrovaskulära patologier associerade med Alzheimers sjukdom, demens och andra former av neurodegeneration. Denna modell har använts för att visa att APOE4, den starkaste riskfaktorn för Alzheimers sjukdom, verkar delvis genom en parasitspecifik väg för att öka patogen amyloidbörda Med hjälp av inducerade pluripotenta stamceller kan vi konstruera mänsklig hjärnvävnad in vitro som kan användas för att undersöka sjukdomspatologi och läkemedelsscreening. En sådan in vitro-modell för blod-hjärnbarriären möjliggör personliga terapeutiska och diagnostiska metoder.Vår 3D in vitro blod-hjärnbarriärmodell visar fysiologiskt relevanta interaktioner, inklusive vaskulär rörbildning och lokalisering av astrocytändfötter med kärl. Det kan också modellera sjukdomsrelevanta fenotyper, inklusive amyloidpatologi. Slutligen möjliggör användningen av inducerade pluripotenta stamceller från patienter studier av vilken genetisk bakgrund som helst.Med hjälp av in vitro-blod-hjärnbarriärmodellen upptäckte vi signalvägar som medierar patologisk ackumulering av cerebrovaskulär amyloid. Detta ledde oss till att utforska terapeutiska strategier som kan vända denna patologi hos åldrade APOE4-möss, vilket vi för närvarande följer upp.