Dette arbejde blev støttet af den portugisiske fond for videnskab og teknologi (FCT) gennem de strategiske projekter, der blev tildelt MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 og UIDB/04292/2020) og Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT finansierede også de individuelle ph.d.-stipendier, der blev tildelt Marta V. Freitas (UI / BD / 150957/2021) og Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Dette arbejde blev også støttet økonomisk af projektet HP4A - SUND PASTA TIL ALLE (medfremme nr. 039952), medfinansieret af EFRU - Den Europæiske Fond for Regionaludvikling under Portugal 2020-programmet gennem det operationelle program COMPETE 2020 - konkurrenceevne og internationalisering.

1. Høst og forberedelse af biomasse
<ol><li>Høst prøverne af G. gracilis under lavvande og transporter dem hurtigt til laboratoriet i mørke, afkølede kasser for at undgå tørring, lys og lufteksponering.</li>
	<li>I laboratoriet vaskes hver thallus med rindende havvand og rengøres grundigt for at fjerne snavs, nekrotiske dele, epifytter og andre organismer fra overfladen.</li>
	<li>Opbevar den vilde biomasse i konstant luftet havvand (31-35 psu) i et klimarum (20 ± 1 °C) med lav bestråling fra dagsly...

Udnyttelse af Gracilaria gracilis: Bioaktivt potentiale for bæredygtig innovation

De antimikrobielle aktivitetstest i et flydende medium bruges til at evaluere effektiviteten af antimikrobielle stoffer mod mikroorganismer suspenderet i et flydende medium og udføres normalt for at bestemme et stofs evne til at hæmme vækst eller dræbe mikroorganismer35,36,37,38. De anvendes til at vurdere mikroorganismers følsomhed over for antimikrobielle stoffer og udføres i reagensgla...

Tang kan betragtes som et interessant naturligt råmateriale, der kan profiteres af medicinal-, fødevare-, foder- og miljøsektorerne. De biosyntetiserer en række molekyler, hvoraf mange ikke findes i landorganismer, med relevante biologiske egenskaber 1,2. Der skal dog implementeres tangoptimerede dyrkningsprotokoller for at sikre et stort biomasselager.
Dyrkningsmetoder skal altid tage hensyn til tangthalliens art og den overordnede morfologi. Gracilaria gracilis er et klonalt taxon, hvilket betyder, at fastgørelsesorganet producerer flere vegetative akser. Formering ved fragmentering (vegetativ reproduktion) opnås således, da hver af disse akser fuldt ud er i stand til at vedtage et uafhængigt liv fra hovedthallusen3. Klontaxa kan med succes integreres med enkle og hurtige et-trins dyrkningsmetoder, da store mængder biomasse opnås ved at opdele thallusen i små fragmenter, der hurtigt regenererer og vokser til nye, genetisk identiske individer. Både haplontisk og diplontisk thalli kan anvendes i denne proces. Selvom slægten udviser en kompleks haplo-diplontisk isomorf triphasisk livscyklus, er sporulation sjældent nødvendig, undtagen når genetisk fornyelse af bestandene er nødvendig for at opnå forbedrede afgrøder. I dette tilfælde giver både tetrasporer (haplontiske sporer dannet af meiose) og carposporer (diplontiske sporer dannet af mitose) anledning til makroskopiske thalli, som derefter kan dyrkes og formeres ved vegetativ reproduktion4. Vækstcyklusser dikteres af miljøforhold og individernes fysiologiske tilstand, blandt andre biologiske faktorer såsom fremkomsten af epifytter og vedhæftningen af andre organismer. Derfor er optimering af vækstbetingelser afgørende for at sikre høj produktivitet og producere biomasse af god kvalitet5.
Ekstraktion af bioaktive forbindelser fra tang, herunder G. gracilis, kan opnås ved forskellige metoder 6,7. Valget af ekstraktionsmetode afhænger af de specifikke forbindelser af interesse, målanvendelsen og tangens egenskaber. I denne undersøgelse fokuserede vi på opløsningsmiddelekstraktion, som involverer brug af grønne opløsningsmidler, såsom vand eller ethanol, til at opløse og ekstrahere bioaktive forbindelser fra tangbiomassen. Ekstraktionen kan udføres gennem maceration på en alsidig og effektiv måde og kan bruges til en lang række forbindelser. Det er en enkel og udbredt metode, der involverer iblødsætning af biomasse i et opløsningsmiddel i en længere periode, typisk ved stuetemperatur eller let forhøjede temperaturer. Opløsningsmidlet omrøres for at forbedre ekstraktionsprocessen. Efter den ønskede ekstraktionstid adskilles opløsningsmidlet fra det faste materiale ved filtrering eller centrifugering.
Vand er et almindeligt anvendt opløsningsmiddel i fødevareapplikationer på grund af dets sikkerhed, tilgængelighed og kompatibilitet med en lang række fødevarer. Vandekstraktion er velegnet til polære forbindelser såsom polysaccharider, peptider og visse phenoler. Det kan dog ikke effektivt ekstrahere ikke-polære forbindelser. Ethanol er også et meget anvendt opløsningsmiddel i fødevareapplikationer og kan være effektivt til ekstraktion af en række bioaktive molekyler, herunder phenolforbindelser, flavonoider og visse pigmenter. Ethanol er generelt anerkendt som sikkert til brug i fødevarer og kan let fordampes og efterlade de ekstraherede forbindelser. Det er værd at bemærke, at valget af ekstraktionsmetode bør overveje faktorer som effektivitet, selektivitet, omkostningseffektivitet og miljøpåvirkning. Optimering af ekstraktionsparametre, såsom opløsningsmiddelkoncentration, ekstraktionstid, temperatur og tryk, er afgørende for at opnå optimale udbytter af bioaktive forbindelser fra G. gracilis eller andre tangplanter.
Tang har vist sig at udvise antimikrobiel aktivitet mod en lang række mikroorganismer, herunder bakterier, svampe og vira8. Denne aktivitet tilskrives bioaktive komponenter, herunder phenoler, polysaccharider, peptider og fedtsyrer. Flere undersøgelser har vist deres effektivitet mod patogener som Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. og Pseudomonas aeruginosa, blandt andre9. Den antimikrobielle aktivitet af tang tilskrives tilstedeværelsen af bioaktive forbindelser, der kan forstyrre mikrobielle cellevægge, membraner, enzymer og signalveje10. Disse forbindelser kan forstyrre mikrobiel vækst, hæmme biofilmdannelse og modulere immunresponser.
Rød tang, også kendt som rhodophytes, er en gruppe alger, der kan udvise antimikrobiel aktivitet mod en række mikroorganismer. Inden for denne gruppe indeholder G. gracilis forskellige bioaktive forbindelser, der kan bidrage til dets rapporterede antimikrobielle aktivitet. Mens de specifikke molekyler kan variere, er de almindelige klasser, der er blevet rapporteret i G. gracilis og kan have antimikrobielle egenskaber, polysaccharider, phenoler, terpenoider og pigmenter11. Det er dog vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen og mængderne af disse komponenter kan variere afhængigt af faktorer som placeringen af tangopsamling, sæsonbestemthed, tallis fysiologiske tilstand og miljøforhold. Derfor kan den specifikke klasse og koncentration af antimikrobielle forbindelser i G. gracilis variere i overensstemmelse hermed.
G. gracilis har også vist sig at holde antioxidant egenskaber, der indeholder forskellige phenolforbindelser, som har vist sig at skylle frie radikaler og reducere oxidativt stress12.Antioxidanter hjælper med at beskytte celler mod skader forårsaget af reaktive iltarter og har potentielle sundhedsmæssige fordele. Antioxidantkapaciteten kan evalueres direkte ved hjælp af forskellige metoder, herunder 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) frie radikaler og indirekte gennem kvantificering af det samlede polyfenolindhold (TPC)13.
Selv om en ingrediens rapporteres at have en fremtrædende bioaktivitet, er dens cytotoksicitetsvurdering uundværlig ved vurderingen af naturlige og syntetiske stoffer, der skal anvendes i kontakt med levende celler eller væv. Der er flere metoder til måling af cytotoksicitet, hver med fordele og begrænsninger. Samlet set tilbyder de en række muligheder for at evaluere de skadelige virkninger af mange stoffer på celler og samtidig undersøge mekanismerne bag celleskader og død14.
I dette arbejde bruger vi 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, en kolorimetrisk metode introduceret af Mosmann (1983)15. Denne metode måler reduktionen af tetrazoliumsalte til et lilla formazanprodukt af metabolisk aktive celler. Jo højere mængden af formazankrystaller er, desto højere er antallet af levedygtige celler, hvilket giver et indirekte mål for cytotoksicitet14. Da G. gracilis vand og ethanolekstrakter i dette arbejde er beregnet til at blive inkorporeret i dermokosmetiske formuleringer, udføres in vitro cytotoksicitetsevalueringen i en keratinocyt (HaCaT) cellelinje.
Med hensyn til fødevareanvendelsen er tang generelt lav i kalorier og ernæringsmæssigt rig på kostfibre, essentielle elementer og aminosyrer, polysaccharider, flerumættede fedtsyrer, polyphenoler og vitaminer 2,16. G. gracilis er ingen undtagelse, der har en interessant næringsværdi. Freitas et al. (2021)4 fandt ud af, at dyrket G. gracilis havde højere niveauer af protein og C-vitamin og opretholdt niveauet af samlede lipider sammenlignet med vild tang. Dette kan udgøre en økonomisk og miljømæssig fordel, da produktion ernæringsmæssigt set er at foretrække frem for udnyttelse af vilde ressourcer. Derudover er forbrugerne i stigende grad bekymrede over den type mad, de spiser, så det er vigtigt at introducere nye ingredienser til fødevareberigelse og bruge nye ressourcer til at opnå ekstrakter, der kan tilføre værdi til et produkt og kræve en "ren etiket". Desuden er det nuværende marked meget konkurrencepræget og kræver udvikling af nye produkter og innovative strategier for at differentiere producenterne fra deres konkurrenter17.
Berigelse af produkter med ringe næringsværdi, såsom pasta, med marine ressourcer, herunder tang, er en strategi for at introducere denne ressource som en ny fødevare og en markedsdifferentieringsstrategi gennem et produkt med tydelig næringsværdi. På den anden side er G. gracilis en kilde til naturlige røde pigmenter såsom phycobiliproteiner18, der har et stort potentiale for anvendelser i fødevareindustrien. Denne tang har vist stor interesse i flere områder, og dens anvendelse kan ske ved hjælp af hele tang, ekstrakter og/eller den resterende biomasse. I dette arbejde demonstrerer vi nogle eksempler på sådanne applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Aga, Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale balance</td>
			<td>Sartorius, TE124S</td>
			<td>22105307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis subsp. spizizenii</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM 347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td>5811JH490481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Chamber</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Fluorescent Lamps</td>
			<td>OSRAM Lumilux Skywhite</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer McFarland</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>1898-66-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (DSM 5922)</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM5922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>AGA-Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (Whatman No.1)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA1001320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin-Ciocalteu</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>31360.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic Acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>149-91-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germanium (IV) Oxide, 99.999%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>1310-53-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaCaT cells &#8211; 300493</td>
			<td>CLS-Cell Lines Services, Germany&#160;</td>
			<td>300493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA, C-MAG HS7</td>
			<td>06.090564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>10124-49-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>TelStar, Portugal</td>
			<td>526013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listonella anguillarum</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>&#160;DSM 21597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7773.01.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>738-0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10022403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>&#160;Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA</td>
			<td>1611151E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth (MHB)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>90004-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, FD115</td>
			<td>12-04490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, BD115</td>
			<td>04-62615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1406-05-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter Inolab</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>15212099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippete tips</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>5412307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Bottles Media Storage</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>16157-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph, Laborota 4000</td>
			<td>80409287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor</td>
			<td>IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal</td>
			<td>07.524254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Normax Chem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMagic NX</td>
			<td>Konica Minolta, Japan</td>
			<td></td>
			<td>color data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA</td>
			<td>5A4T092004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-92-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>59-43-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>ICNA091010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>22091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water&#160;</td>
			<td>Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F5HA17360B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Buchi, Switzerland</td>
			<td>FIS05-402-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Merck</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

valorization of the red seaweed gracilaria gracilis through a biorefinery approach

Interessen for tang som et rigeligt råmateriale til at opnå værdifulde og multitarget bioaktive ingredienser vokser konstant. I dette arbejde undersøger vi potentialet i Gracilaria gracilis, en spiselig rød tang, der dyrkes over hele verden for sin kommercielle interesse som kilde til agar og andre ingredienser til kosmetiske, farmakologiske, fødevare- og foderapplikationer.
G. gracilis vækstbetingelser blev optimeret gennem vegetativ formering og sporulation, mens de fysisk-kemiske forhold blev manipuleret for at opnå en stor biomassebestand. Grønne ekstraktionsmetoder med ethanol og vand blev udført over tangbiomassen. Det bioaktive potentiale af ekstrakter blev vurderet gennem et sæt in vitro assays vedrørende deres cytotoksicitet, antioxidant og antimikrobielle egenskaber. Derudover blev tørret tangbiomasse inkorporeret i pastaformuleringer for at øge fødevarens næringsværdi. Pigmenter ekstraheret fra G. gracilis er også blevet indarbejdet i yoghurt som et naturligt farvestof, og deres stabilitet blev evalueret. Begge produkter blev påskønnet af et semi-trænet sensorisk panel, der sigter mod at opnå den bedste endelige formulering, før de når markedet.
Resultaterne understøtter alsidigheden af G. gracilis , uanset om det anvendes som en hel biomasse, ekstrakter og / eller pigmenter. Ved at implementere flere optimerede protokoller muliggør dette arbejde udvikling af produkter med potentiale til at gavne fødevare-, kosmetik- og akvakulturmarkederne, fremme miljømæssig bæredygtighed og en blå cirkulær økonomi.
Desuden og i overensstemmelse med en bioraffinaderitilgang vil den resterende tangbiomasse blive anvendt som biostimulans til plantevækst eller omdannet til kulstofmaterialer, der skal bruges til vandrensning af de interne akvakultursystemer i MARE-Polytechnic i Leiria, Portugal.

&#160;Seaweeds can be regarded as an interesting natural raw material to be profited by the pharmaceutical, food, feed, and environmental sectors. They biosynthesize a panoply of molecules, many not found in terrestrial organisms, with relevant biological properties1,2. However, seaweed-optimized cultivation protocols need to be implemented to ensure a large biomass stock.
Cultivation methods must always consider the nature of the seaweed thalli and overall morphology. Gracilaria gracilis is a clonal taxon, meaning the attachment organ produces multiple vegetative axes. Propagation by fragmentation (vegetative reproduction) is thus achieved, as each of these axes is fully able to adopt an independent life from the main thallus3. Clonal taxa can be successfully integrated with simple and fast one-step cultivation methodologies, as large amounts of biomass are obtained by splitting the thallus into small fragments that quickly regenerate and grow into new, genetically identical individuals. Both haplontic and diplontic thalli may be used in this process. Although the genus exhibits a complex haplo-diplontic isomorphic triphasic life cycle, sporulation is rarely necessary except when genetic renewal of the stocks is required to achieve improved crops. In this case, both tetraspores (haplontic spores formed by meiosis) and carpospores (diplontic spores formed by mitosis) give rise to macroscopic thalli that can then be grown and propagated by vegetative reproduction4. Growth cycles are dictated by environmental conditions and the physiological state of the individuals, among other biological factors such as the emergence of epiphytes and the adhesion of other organisms. Therefore, optimizing growing conditions is crucial to ensure high productivity and produce good quality biomass5.
The extraction of bioactive compounds from seaweed, including G. gracilis, can be achieved through various methods6,7. The choice of the extraction method depends on the specific compounds of interest, the target application, and the characteristics of the seaweed. In this study, we focused on solvent extraction, which involves using green solvents, such as water or ethanol, to dissolve and extract bioactive compounds from the seaweed biomass. The extraction can be carried out through maceration in a versatile and effective way and can be used for a wide range of compounds. It is a simple and widely used method involving soaking biomass in a solvent for an extended period, typically at room or slightly elevated temperatures. The solvent is stirred to enhance the extraction process. After the desired extraction time, the solvent is separated from the solid material by filtration or centrifugation.
Water is a commonly used solvent in food applications due to its safety, availability, and compatibility with a wide range of food products. Water extraction is suitable for polar compounds such as polysaccharides, peptides, and certain phenolics. However, it may not effectively extract non-polar compounds. Ethanol is also a widely used solvent in food applications and can be effective for extracting a variety of bioactive molecules, including phenolic compounds, flavonoids, and certain pigments. Ethanol is generally recognized as safe for use in food and can be easily evaporated, leaving behind the extracted compounds. It is worth noting that the choice of extraction method should consider factors such as efficiency, selectivity, cost-effectiveness, and environmental impact. The optimization of extraction parameters, such as solvent concentration, extraction time, temperature, and pressure, is crucial to achieving optimal yields of bioactive compounds from G. gracilis or other seaweeds.
Seaweeds have been found to exhibit antimicrobial activity against a wide range of microorganisms, including bacteria, fungi, and viruses8. This activity is attributed to bioactive components, including phenolics, polysaccharides, peptides, and fatty acids. Several studies have demonstrated their efficacy against pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., and Pseudomonas aeruginosa, among others9. The antimicrobial activity of seaweeds is attributed to the presence of bioactive compounds that can interfere with microbial cell walls, membranes, enzymes, and signaling pathways10. These compounds may disrupt microbial growth, inhibit biofilm formation, and modulate immune responses.
Red seaweeds, also known as rhodophytes, are a group of algae that can exhibit antimicrobial activity against a variety of microorganisms. Within this group, G. gracilis contains various bioactive compounds that may contribute to its reported antimicrobial activity. While the specific molecules can vary, the common classes that have been reported in G. gracilis and may possess antimicrobial properties are polysaccharides, phenolics, terpenoids, and pigments11. However, it is important to note that the presence and amounts of these components can vary depending on factors such as the location of seaweed collection, seasonality, physiological condition of the thalli, and environmental conditions. Therefore, the specific class and concentration of antimicrobial compounds in G. gracilis may vary accordingly.
G. gracilis has also been found to hold antioxidant properties, containing various phenolic compounds, which have been shown to scavenge free radicals and reduce oxidative stress12. Antioxidants help to protect cells from damage caused by reactive oxygen species and have potential health benefits. Antioxidant capacity can be evaluated directly through different methods, including the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity and, indirectly, through the quantification of total polyphenolic content (TPC)13.
Even though an ingredient is reported to have a prominent bioactivity, its cytotoxicity assessment is indispensable in evaluating natural and synthetic substances to be used in contact with living cells or tissues. There are several methods for measuring cytotoxicity, each one with advantages and limitations. Overall, they offer a range of options to evaluate the harmful effects of many substances on cells and, at the same time, to investigate the mechanisms of cell damage and death14.
In this work, we use the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a colorimetric method introduced by Mosmann (1983)15. This method measures the reduction of tetrazolium salts to a purple formazan product by metabolically active cells. The higher the amount of formazan crystals, the higher the number of viable cells, thus providing an indirect measure of cytotoxicity14. Since in this work, G. gracilis water and ethanol extracts are intended to be incorporated into dermo-cosmetic formulations, the in vitro cytotoxicity evaluation is performed in a keratinocyte (HaCaT) cell line.
Concerning the food application, seaweeds are generally low in calories and nutritionally rich in dietary fibers, essential elements and amino acids, polysaccharides, polyunsaturated fatty acids, polyphenols, and vitamins2,16. G. gracilis is no exception, having an interesting nutritional value. Freitas et al. (2021)4 found that cultivated G. gracilis had higher levels of protein and vitamin C and maintained the level of total lipids compared to wild seaweed. This may represent an economic and environmental advantage, as nutritionally speaking, production is preferable to the exploitation of wild resources. In addition, consumers are increasingly concerned about the type of food they eat, so it is important to introduce new ingredients for food enrichment and use new resources to obtain extracts that can add value to a product and claim a &#34;clean label.&#34; Besides, the current market is very competitive, requiring the development of new products and innovative strategies to differentiate manufacturers from their competitors17.
The enrichment of products with poor nutritional value, such as pasta, with marine resources, including seaweed, is a strategy to introduce this resource as a new food and a market differentiation strategy through a product with distinct nutritional value. On the other hand, G. gracilis is a source of natural red pigments such as phycobiliproteins18, having high potential for applications in the food industry. This seaweed has shown high interest in several areas, and its application can be made using the whole seaweed, extracts and/or the remaining biomass. In this work, we demonstrate some examples of such applications.

Forfatter Spotlight: Udforskning af tangs bioaktive forbindelser til bæredygtige innovationer i industrier 

Valorisering af den røde tang Gracilaria gracilis gennem en bioraffinaderitilgang

Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceutical drugs.One of the challenges of using seaweed in the development of new food products is to avoid using high amounts that could lead to unpleasant sensory properties in food. Using seaweed extracts is a way to get around this problem. With this protocol, we were able to develop pasta, wheat, add nutritional value by incorporating whole algae.Usually, the addition of these ingredients provides less common sensory properties. However, with the developed formulation, a consumer acceptance was still achieved.

Antimikrobiel aktivitet
Ved fortolkning af de opnåede resultater skal man huske på, at jo højere hæmningsprocenten er, desto større er ekstraktets effektivitet til at hæmme væksten af den specifikke stamme, og følgelig jo mere interessant er ekstraktet som et antimikrobielt stof. Gennem denne metode kan vi hurtigt identificere, hvilke ekstrakter der har større aktivitet på visse bakteriestammer, og ogs...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Her beskriver vi flere protokoller, der sigter mod en integreret valorisering af Gracilaria gracilis: høst af vilde arter, intern vækst og udvinding af bioaktive ingredienser. Ekstrakternes antioxidante, antimikrobielle og cytotoksiske virkninger evalueres sammen med ernærings- og stabilitetsvurderingen af fødevarer beriget med hele tangbiomasse og pigmenter.

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we ...

Vores forskning er fokuseret på prospektering af nye bioaktive forbindelser fra tang, der kan være nyttige i forskellige sektorer såsom fødevare-, kosmetik- og medicinalindustrien. Der er en voksende bevidsthed i samfundet om marine organismers potentiale til at levere bioaktive forbindelser. Disse forbindelser kan bruges til at producere bæredygtig og sikrere funktionel kosmetik for at forbedre kvaliteten af fødevarer og tjene som kilde til nye kemiske strukturer til udvikling af nye farmaceutiske lægemidler.En af udfordringerne ved at bruge tang i udviklingen af nye fødevarer er at undgå at bruge store mængder, der kan føre til ubehagelige sensoriske egenskaber i fødevarer. Brug af tangekstrakter er en måde at omgå dette problem på. Med denne protokol var vi i stand til at udvikle pasta, hvede, tilføje næringsværdi ved at inkorporere hele alger.Normalt giver tilsætningen af disse ingredienser mindre almindelige sensoriske egenskaber. Men med den udviklede formulering blev der stadig opnået en forbrugeraccept.

valorization-red-seaweed-gracilaria-gracilis-through-biorefinery

Research

JoVE Journal

Biology

Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach

1.4K Views.  Polytechnic University of Leiria. Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceuti...