Name: Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar de bioactieve stoffen van zeewier voor duurzame innovaties in industrieën
Uploaded: 2023-11-21T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT) via de strategische projecten die zijn toegekend aan MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 en UIDB/04292/2020) en Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT financierde ook de individuele doctoraatsbeurzen die werden toegekend aan Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) en Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Deze werkzaamheden werden ook financieel ondersteund door het project HP4A - GEZONDE PASTA VOOR IEDEREEN (co-promotie nr. 039952), medegefinancierd door het EFRO - Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling, in het kader van het Portugal 2020-programma, via COMPETE 2020 - operationeel programma voor concurrentievermogen en internationalisering.

1. Oogsten en voorbereiden van biomassa
<ol><li>Oogst de exemplaren van G. gracilis tijdens eb en vervoer ze snel naar het laboratorium in donkere, gekoelde dozen om uitdroging, licht en blootstelling aan de lucht te voorkomen.</li>
	<li>Was in het laboratorium elk thallus met stromend zeewater en reinig grondig om puin, necrotische delen, epifyten en andere organismen van het oppervlak te verwijderen.</li>
	<li>Bewaar de wilde biomassa in constant belucht zeewater (31-35 psu) in een klimaatruimte (20 ± 1 °C...

Gracilaria gracilis benutten: bioactief potentieel voor duurzame innovatie

De antimicrobiële activiteitstests in een vloeibaar medium worden gebruikt om de effectiviteit van antimicrobiële stoffen tegen micro-organismen gesuspendeerd in een vloeibaar medium te evalueren en worden meestal uitgevoerd om het vermogen van een stof te bepalen om de groei te remmen of micro-organismen te doden35,36,37,38. Ze worden gebruikt om de gevoeligheid van micro-organismen voor ant...

Zeewier kan worden beschouwd als een interessante natuurlijke grondstof die kan worden gebruikt door de farmaceutische, voedings-, diervoeder- en milieusector. Ze biosynthetiseren een arsenaal aan moleculen, waarvan er vele niet worden aangetroffen in terrestrische organismen, met relevante biologische eigenschappen 1,2. Er moeten echter voor zeewier geoptimaliseerde teeltprotocollen worden geïmplementeerd om een grote biomassavoorraad te garanderen.
Bij de teeltmethoden moet altijd rekening worden gehouden met de aard van de zeewierthalli en de algehele morfologie. Gracilaria gracilis is een klonaal taxon, wat betekent dat het aanhechtingsorgaan meerdere vegetatieve assen produceert. Voortplanting door fragmentatie (vegetatieve voortplanting) wordt dus bereikt, aangezien elk van deze assen volledig in staat is om een onafhankelijk leven aan te nemen van het hoofdthallus3. Klonale taxa kunnen met succes worden geïntegreerd met eenvoudige en snelle kweekmethoden in één stap, aangezien grote hoeveelheden biomassa worden verkregen door het thallus te splitsen in kleine fragmenten die snel regenereren en uitgroeien tot nieuwe, genetisch identieke individuen. Zowel haplontische als diplontische thalli kunnen in dit proces worden gebruikt. Hoewel het geslacht een complexe haplo-diplontische isomorfe trifasische levenscyclus vertoont, is sporulatie zelden nodig, behalve wanneer genetische vernieuwing van de bestanden nodig is om verbeterde gewassen te verkrijgen. In dit geval geven zowel tetrasporen (haplontische sporen gevormd door meiose) als carpospores (diplontische sporen gevormd door mitose) aanleiding tot macroscopische thalli die vervolgens kunnen worden gekweekt en vermeerderd door vegetatieve voortplanting4. Groeicycli worden bepaald door omgevingsomstandigheden en de fysiologische toestand van de individuen, naast andere biologische factoren zoals het ontstaan van epifyten en de hechting van andere organismen. Daarom is het optimaliseren van de groeiomstandigheden cruciaal om een hoge productiviteit te garanderen en biomassa van goede kwaliteit te produceren5.
De extractie van bioactieve stoffen uit zeewier, waaronder G. gracilis, kan op verschillende manieren worden bereikt 6,7. De keuze van de extractiemethode hangt af van de specifieke verbindingen die van belang zijn, de beoogde toepassing en de kenmerken van het zeewier. In deze studie hebben we ons gericht op oplosmiddelextractie, waarbij groene oplosmiddelen, zoals water of ethanol, worden gebruikt om bioactieve stoffen op te lossen en te extraheren uit de zeewierbiomassa. De extractie kan op een veelzijdige en effectieve manier worden uitgevoerd door middel van maceratie en kan worden gebruikt voor een breed scala aan verbindingen. Het is een eenvoudige en veelgebruikte methode waarbij biomassa gedurende een langere periode in een oplosmiddel wordt geweekt, meestal bij kamertemperatuur of licht verhoogde temperaturen. Het oplosmiddel wordt geroerd om het extractieproces te verbeteren. Na de gewenste extractietijd wordt het oplosmiddel door filtratie of centrifugatie gescheiden van het vaste materiaal.
Water is een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen vanwege de veiligheid, beschikbaarheid en compatibiliteit met een breed scala aan voedingsproducten. Waterextractie is geschikt voor polaire verbindingen zoals polysachariden, peptiden en bepaalde fenolen. Het is echter mogelijk dat het niet-polaire verbindingen niet effectief extraheert. Ethanol is ook een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen en kan effectief zijn voor het extraheren van een verscheidenheid aan bioactieve moleculen, waaronder fenolische verbindingen, flavonoïden en bepaalde pigmenten. Ethanol wordt algemeen erkend als veilig voor gebruik in voedsel en kan gemakkelijk worden verdampt, waarbij de geëxtraheerde verbindingen achterblijven. Het is vermeldenswaard dat bij de keuze van de winningsmethode rekening moet worden gehouden met factoren als efficiëntie, selectiviteit, kosteneffectiviteit en milieu-impact. De optimalisatie van extractieparameters, zoals oplosmiddelconcentratie, extractietijd, temperatuur en druk, is cruciaal voor het bereiken van optimale opbrengsten van bioactieve stoffen uit G. gracilis of andere zeewieren.
Zeewieren blijken antimicrobiële activiteit te vertonen tegen een breed scala aan micro-organismen, waaronder bacteriën, schimmelsen virussen. Deze activiteit wordt toegeschreven aan bioactieve componenten, waaronder fenolen, polysachariden, peptiden en vetzuren. Verschillende studies hebben hun werkzaamheid aangetoond tegen ziekteverwekkers zoals onderandere Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. en Pseudomonas aeruginosa. De antimicrobiële activiteit van zeewier wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van bioactieve stoffen die kunnen interfereren met microbiële celwanden, membranen, enzymen en signaalroutes10. Deze verbindingen kunnen de microbiële groei verstoren, de vorming van biofilms remmen en immuunresponsen moduleren.
Rode zeewieren, ook wel rhodofyten genoemd, zijn een groep algen die antimicrobiële activiteit kunnen vertonen tegen een verscheidenheid aan micro-organismen. Binnen deze groep bevat G. gracilis verschillende bioactieve stoffen die kunnen bijdragen aan de gerapporteerde antimicrobiële activiteit. Hoewel de specifieke moleculen kunnen variëren, zijn de gemeenschappelijke klassen die zijn gerapporteerd in G. gracilis en mogelijk antimicrobiële eigenschappen bezitten, polysachariden, fenolen, terpenoïden en pigmenten11. Het is echter belangrijk op te merken dat de aanwezigheid en hoeveelheden van deze componenten kunnen variëren, afhankelijk van factoren zoals de locatie van zeewierverzameling, seizoensgebondenheid, fysiologische toestand van de thalli en omgevingsomstandigheden. Daarom kunnen de specifieke klasse en concentratie van antimicrobiële verbindingen in G. gracilis dienovereenkomstig variëren.
G. gracilis blijkt ook antioxiderende eigenschappen te hebben, die verschillende fenolische verbindingen bevatten, waarvan is aangetoond dat ze vrije radicalen opruimen en oxidatieve stress verminderen12.Antioxidanten helpen cellen te beschermen tegen schade veroorzaakt door reactieve zuurstofsoorten en hebben potentiële gezondheidsvoordelen. De antioxiderende capaciteit kan direct worden geëvalueerd door middel van verschillende methoden, waaronder de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) vrije radicalenvanger en, indirect, door de kwantificering van het totale polyfenolgehalte (TPC)13.
Hoewel van een ingrediënt wordt gemeld dat het een prominente bioactiviteit heeft, is de cytotoxiciteitsbeoordeling ervan onmisbaar bij het beoordelen van natuurlijke en synthetische stoffen die in contact komen met levende cellen of weefsels. Er zijn verschillende methoden om cytotoxiciteit te meten, elk met voordelen en beperkingen. Over het algemeen bieden ze een scala aan opties om de schadelijke effecten van veel stoffen op cellen te evalueren en tegelijkertijd de mechanismen van celbeschadiging en -dood te onderzoeken14.
In dit werk gebruiken we de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test, een colorimetrische methode geïntroduceerd door Mosmann (1983)15. Deze methode meet de reductie van tetrazoliumzouten tot een paars formazanproduct door metabolisch actieve cellen. Hoe hoger de hoeveelheid formazankristallen, hoe hoger het aantal levensvatbare cellen, waardoor een indirecte maat voor cytotoxiciteit wordt geboden14. Aangezien in dit werk G. gracilis water- en ethanolextracten bedoeld zijn om te worden opgenomen in dermocosmetische formuleringen, wordt de in vitro cytotoxiciteitsevaluatie uitgevoerd in een keratinocyt (HaCaT) cellijn.
Wat de voedseltoepassing betreft, bevatten zeewieren over het algemeen weinig calorieën en zijn ze qua voedingswaarde rijk aan voedingsvezels, essentiële elementen en aminozuren, polysachariden, meervoudig onverzadigde vetzuren, polyfenolen en vitamines 2,16. G. gracilis is geen uitzondering, met een interessante voedingswaarde. Freitas et al. (2021)4 ontdekten dat gekweekte G. gracilis hogere niveaus van eiwitten en vitamine C had en het niveau van totale lipiden handhaafde in vergelijking met wild zeewier. Dit kan een economisch en ecologisch voordeel opleveren, aangezien de productie uit voedingsoogpunt de voorkeur verdient boven de exploitatie van wilde hulpbronnen. Bovendien maken consumenten zich steeds meer zorgen over het soort voedsel dat ze eten, dus het is belangrijk om nieuwe ingrediënten voor voedselverrijking te introduceren en nieuwe middelen te gebruiken om extracten te verkrijgen die waarde kunnen toevoegen aan een product en een "clean label" kunnen claimen. Bovendien is de huidige markt zeer concurrerend, waardoor de ontwikkeling van nieuwe producten en innovatieve strategieën nodig zijn om fabrikanten van hun concurrenten te onderscheiden17.
De verrijking van producten met een slechte voedingswaarde, zoals pasta, met mariene hulpbronnen, waaronder zeewier, is een strategie om deze hulpbron als een nieuw voedingsmiddel te introduceren en een strategie voor marktdifferentiatie door middel van een product met een duidelijke voedingswaarde. Aan de andere kant is G. gracilis een bron van natuurlijke rode pigmenten zoals phycobiliproteïnen18, met een groot potentieel voor toepassingen in de voedingsindustrie. Dit zeewier heeft op verschillende gebieden grote belangstelling getoond en kan worden toegepast met behulp van het hele zeewier, extracten en/of de resterende biomassa. In dit werk demonstreren we enkele voorbeelden van dergelijke toepassingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Aga, Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale balance</td>
			<td>Sartorius, TE124S</td>
			<td>22105307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis subsp. spizizenii</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM 347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td>5811JH490481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Chamber</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Fluorescent Lamps</td>
			<td>OSRAM Lumilux Skywhite</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer McFarland</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>1898-66-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (DSM 5922)</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM5922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>AGA-Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (Whatman No.1)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA1001320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin-Ciocalteu</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>31360.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic Acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>149-91-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germanium (IV) Oxide, 99.999%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>1310-53-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaCaT cells &#8211; 300493</td>
			<td>CLS-Cell Lines Services, Germany&#160;</td>
			<td>300493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA, C-MAG HS7</td>
			<td>06.090564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>10124-49-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>TelStar, Portugal</td>
			<td>526013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listonella anguillarum</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>&#160;DSM 21597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7773.01.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>738-0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10022403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>&#160;Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA</td>
			<td>1611151E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth (MHB)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>90004-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, FD115</td>
			<td>12-04490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, BD115</td>
			<td>04-62615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1406-05-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter Inolab</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>15212099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippete tips</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>5412307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Bottles Media Storage</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>16157-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph, Laborota 4000</td>
			<td>80409287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor</td>
			<td>IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal</td>
			<td>07.524254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Normax Chem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMagic NX</td>
			<td>Konica Minolta, Japan</td>
			<td></td>
			<td>color data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA</td>
			<td>5A4T092004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-92-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>59-43-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>ICNA091010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>22091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water&#160;</td>
			<td>Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F5HA17360B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Buchi, Switzerland</td>
			<td>FIS05-402-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Merck</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

valorization of the red seaweed gracilaria gracilis through a biorefinery approach

De belangstelling voor zeewier als overvloedige grondstof om waardevolle en multitarget bioactieve ingrediënten te verkrijgen, groeit voortdurend. In dit werk onderzoeken we het potentieel van Gracilaria gracilis, een eetbaar rood zeewier dat wereldwijd wordt gekweekt vanwege zijn commerciële belang als bron van agar en andere ingrediënten voor cosmetische, farmacologische, voedsel- en diervoedertoepassingen.
De groeiomstandigheden van G. gracilis werden geoptimaliseerd door vegetatieve vermeerdering en sporulatie, terwijl de fysisch-chemische omstandigheden werden gemanipuleerd om een grote biomassavoorraad te verkrijgen. Groene extractiemethoden met ethanol en water werden uitgevoerd over de zeewierbiomassa. Het bioactieve potentieel van extracten werd beoordeeld door middel van een reeks in vitro testen met betrekking tot hun cytotoxiciteit, antioxiderende en antimicrobiële eigenschappen. Bovendien werd gedroogde zeewierbiomassa verwerkt in pastaformuleringen om de voedingswaarde van voedsel te verhogen. Pigmenten geëxtraheerd uit G. gracilis zijn ook in yoghurt verwerkt als een natuurlijke kleurstof en hun stabiliteit werd geëvalueerd. Beide producten werden onderworpen aan de beoordeling van een semi-getraind sensorisch panel met als doel de beste uiteindelijke formulering te bereiken voordat ze op de markt komen.
De resultaten ondersteunen de veelzijdigheid van G. gracilis , of het nu wordt toegepast als een hele biomassa, extracten en/of pigmenten. Door verschillende geoptimaliseerde protocollen te implementeren, maakt dit werk de ontwikkeling mogelijk van producten met het potentieel om de voedsel-, cosmetica- en aquacultuurmarkten te laten profiteren, ecologische duurzaamheid en een blauwe circulaire economie te bevorderen.
Bovendien, en in overeenstemming met een bioraffinagebenadering, zal de resterende biomassa van zeewier worden gebruikt als biostimulant voor plantengroei of worden omgezet in koolstofmaterialen voor gebruik in waterzuivering van de interne aquacultuursystemen van MARE-Polytechnic van Leiria, Portugal.

&#160;Seaweeds can be regarded as an interesting natural raw material to be profited by the pharmaceutical, food, feed, and environmental sectors. They biosynthesize a panoply of molecules, many not found in terrestrial organisms, with relevant biological properties1,2. However, seaweed-optimized cultivation protocols need to be implemented to ensure a large biomass stock.
Cultivation methods must always consider the nature of the seaweed thalli and overall morphology. Gracilaria gracilis is a clonal taxon, meaning the attachment organ produces multiple vegetative axes. Propagation by fragmentation (vegetative reproduction) is thus achieved, as each of these axes is fully able to adopt an independent life from the main thallus3. Clonal taxa can be successfully integrated with simple and fast one-step cultivation methodologies, as large amounts of biomass are obtained by splitting the thallus into small fragments that quickly regenerate and grow into new, genetically identical individuals. Both haplontic and diplontic thalli may be used in this process. Although the genus exhibits a complex haplo-diplontic isomorphic triphasic life cycle, sporulation is rarely necessary except when genetic renewal of the stocks is required to achieve improved crops. In this case, both tetraspores (haplontic spores formed by meiosis) and carpospores (diplontic spores formed by mitosis) give rise to macroscopic thalli that can then be grown and propagated by vegetative reproduction4. Growth cycles are dictated by environmental conditions and the physiological state of the individuals, among other biological factors such as the emergence of epiphytes and the adhesion of other organisms. Therefore, optimizing growing conditions is crucial to ensure high productivity and produce good quality biomass5.
The extraction of bioactive compounds from seaweed, including G. gracilis, can be achieved through various methods6,7. The choice of the extraction method depends on the specific compounds of interest, the target application, and the characteristics of the seaweed. In this study, we focused on solvent extraction, which involves using green solvents, such as water or ethanol, to dissolve and extract bioactive compounds from the seaweed biomass. The extraction can be carried out through maceration in a versatile and effective way and can be used for a wide range of compounds. It is a simple and widely used method involving soaking biomass in a solvent for an extended period, typically at room or slightly elevated temperatures. The solvent is stirred to enhance the extraction process. After the desired extraction time, the solvent is separated from the solid material by filtration or centrifugation.
Water is a commonly used solvent in food applications due to its safety, availability, and compatibility with a wide range of food products. Water extraction is suitable for polar compounds such as polysaccharides, peptides, and certain phenolics. However, it may not effectively extract non-polar compounds. Ethanol is also a widely used solvent in food applications and can be effective for extracting a variety of bioactive molecules, including phenolic compounds, flavonoids, and certain pigments. Ethanol is generally recognized as safe for use in food and can be easily evaporated, leaving behind the extracted compounds. It is worth noting that the choice of extraction method should consider factors such as efficiency, selectivity, cost-effectiveness, and environmental impact. The optimization of extraction parameters, such as solvent concentration, extraction time, temperature, and pressure, is crucial to achieving optimal yields of bioactive compounds from G. gracilis or other seaweeds.
Seaweeds have been found to exhibit antimicrobial activity against a wide range of microorganisms, including bacteria, fungi, and viruses8. This activity is attributed to bioactive components, including phenolics, polysaccharides, peptides, and fatty acids. Several studies have demonstrated their efficacy against pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., and Pseudomonas aeruginosa, among others9. The antimicrobial activity of seaweeds is attributed to the presence of bioactive compounds that can interfere with microbial cell walls, membranes, enzymes, and signaling pathways10. These compounds may disrupt microbial growth, inhibit biofilm formation, and modulate immune responses.
Red seaweeds, also known as rhodophytes, are a group of algae that can exhibit antimicrobial activity against a variety of microorganisms. Within this group, G. gracilis contains various bioactive compounds that may contribute to its reported antimicrobial activity. While the specific molecules can vary, the common classes that have been reported in G. gracilis and may possess antimicrobial properties are polysaccharides, phenolics, terpenoids, and pigments11. However, it is important to note that the presence and amounts of these components can vary depending on factors such as the location of seaweed collection, seasonality, physiological condition of the thalli, and environmental conditions. Therefore, the specific class and concentration of antimicrobial compounds in G. gracilis may vary accordingly.
G. gracilis has also been found to hold antioxidant properties, containing various phenolic compounds, which have been shown to scavenge free radicals and reduce oxidative stress12. Antioxidants help to protect cells from damage caused by reactive oxygen species and have potential health benefits. Antioxidant capacity can be evaluated directly through different methods, including the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity and, indirectly, through the quantification of total polyphenolic content (TPC)13.
Even though an ingredient is reported to have a prominent bioactivity, its cytotoxicity assessment is indispensable in evaluating natural and synthetic substances to be used in contact with living cells or tissues. There are several methods for measuring cytotoxicity, each one with advantages and limitations. Overall, they offer a range of options to evaluate the harmful effects of many substances on cells and, at the same time, to investigate the mechanisms of cell damage and death14.
In this work, we use the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a colorimetric method introduced by Mosmann (1983)15. This method measures the reduction of tetrazolium salts to a purple formazan product by metabolically active cells. The higher the amount of formazan crystals, the higher the number of viable cells, thus providing an indirect measure of cytotoxicity14. Since in this work, G. gracilis water and ethanol extracts are intended to be incorporated into dermo-cosmetic formulations, the in vitro cytotoxicity evaluation is performed in a keratinocyte (HaCaT) cell line.
Concerning the food application, seaweeds are generally low in calories and nutritionally rich in dietary fibers, essential elements and amino acids, polysaccharides, polyunsaturated fatty acids, polyphenols, and vitamins2,16. G. gracilis is no exception, having an interesting nutritional value. Freitas et al. (2021)4 found that cultivated G. gracilis had higher levels of protein and vitamin C and maintained the level of total lipids compared to wild seaweed. This may represent an economic and environmental advantage, as nutritionally speaking, production is preferable to the exploitation of wild resources. In addition, consumers are increasingly concerned about the type of food they eat, so it is important to introduce new ingredients for food enrichment and use new resources to obtain extracts that can add value to a product and claim a &#34;clean label.&#34; Besides, the current market is very competitive, requiring the development of new products and innovative strategies to differentiate manufacturers from their competitors17.
The enrichment of products with poor nutritional value, such as pasta, with marine resources, including seaweed, is a strategy to introduce this resource as a new food and a market differentiation strategy through a product with distinct nutritional value. On the other hand, G. gracilis is a source of natural red pigments such as phycobiliproteins18, having high potential for applications in the food industry. This seaweed has shown high interest in several areas, and its application can be made using the whole seaweed, extracts and/or the remaining biomass. In this work, we demonstrate some examples of such applications.

Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar de bioactieve stoffen van zeewier voor duurzame innovaties in industrieën 

Valorisatie van het rode zeewier Gracilaria gracilis door middel van een bioraffinage-aanpak

Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceutical drugs.One of the challenges of using seaweed in the development of new food products is to avoid using high amounts that could lead to unpleasant sensory properties in food. Using seaweed extracts is a way to get around this problem. With this protocol, we were able to develop pasta, wheat, add nutritional value by incorporating whole algae.Usually, the addition of these ingredients provides less common sensory properties. However, with the developed formulation, a consumer acceptance was still achieved.

Antimicrobiële activiteit
Bij de interpretatie van de verkregen resultaten moet er rekening mee worden gehouden dat hoe hoger het remmingspercentage, hoe groter de werkzaamheid van het extract bij het remmen van de groei van die specifieke stam en dus hoe interessanter het extract is als antimicrobieel middel. Door deze methodologie kunnen we snel identificeren welke extracten een grotere activiteit hebben op b...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Hier beschrijven we verschillende protocollen die gericht zijn op een geïntegreerde valorisatie van Gracilaria gracilis: het oogsten van wilde soorten, in-house groei en extractie van bioactieve ingrediënten. De antioxiderende, antimicrobiële en cytotoxische effecten van de extracten worden geëvalueerd, samen met de voedings- en stabiliteitsbeoordeling van voedsel verrijkt met hele zeewierbiomassa en pigmenten.

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we ...

Ons onderzoek is gericht op de prospectie van nieuwe bioactieve stoffen uit zeewier die nuttig kunnen zijn in verschillende sectoren, zoals de voedings-, cosmetische en farmaceutische industrie. Er is een groeiend bewustzijn in de samenleving over het potentieel van mariene organismen om bioactieve stoffen te leveren. Deze verbindingen kunnen worden gebruikt om duurzame en veiligere functionele cosmetica te produceren om de kwaliteit van voedingsproducten te verbeteren en dienen als bron van nieuwe chemische structuren voor de ontwikkeling van nieuwe farmaceutische geneesmiddelen.Een van de uitdagingen van het gebruik van zeewier bij de ontwikkeling van nieuwe voedingsproducten is het vermijden van het gebruik van grote hoeveelheden die kunnen leiden tot onaangename sensorische eigenschappen in voedsel. Het gebruik van zeewierextracten is een manier om dit probleem te omzeilen. Met dit protocol waren we in staat om pasta en tarwe te ontwikkelen en voedingswaarde toe te voegen door hele algen op te nemen.Meestal zorgt de toevoeging van deze ingrediënten voor minder gebruikelijke sensorische eigenschappen. Met de ontwikkelde formulering werd echter toch een acceptatie door de consument bereikt.

valorization-red-seaweed-gracilaria-gracilis-through-biorefinery

Research

JoVE Journal

Biology

Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we explore the potential of Gracilaria gracilis, an edible red seaweed cultivated worldwide for its commercial interest as a source of agar and other ingredients for cosmetic, pharmacological, food, and feed applications.
G. gracilis growth conditions were optimized through vegetative propagation and sporulation while manipulating the physicochemical conditions to achieve a large biomass stock. Green extraction methodologies with ethanol and water were performed over the seaweed biomass. The bioactive potential of extracts was assessed through a set of in vitro assays concerning their cytotoxicity, antioxidant, and antimicrobial properties. Additionally, dried seaweed biomass was incorporated into pasta formulations to increase food&#39;s nutritional value. Pigments extracted from G. gracilis have also been incorporated into yogurt as a natural colorant, and their stability was evaluated. Both products were submitted to the appreciation of a semi-trained sensorial panel aiming to achieve the best final formulation before reaching the market.
Results support the versatility of G. gracilis whether it is applied as a whole biomass, extracts and/or pigments. Through implementing several optimized protocols, this work allows the development of products with the potential to profit the food, cosmetic, and aquaculture markets, promoting environmental sustainability and a blue circular economy.
Moreover, and in line with a biorefinery approach, the residual seaweed biomass will be used as biostimulant for plant growth or converted to carbon materials to be used in water purification of the in-house aquaculture systems of MARE-Polytechnic of Leiria, Portugal.

Here, we describe several protocols aiming at an integrated valorization of Gracilaria gracilis: wild species harvesting, in-house growth, and extraction of bioactive ingredients. The extracts&#39; antioxidant, antimicrobial, and cytotoxic effects are evaluated, along with the nutritional and stability assessment of food enriched with whole seaweed biomass and pigments.

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis  

To begin, grow Gracilaria gracilis in 250 milliliters of flat bottom flasks in a climatic room. Once the biomass has been scaled up, dried, and ground, weigh the resulting dried biomass. Dissolve it in 100 milliliters of solvent and mix by stirring in a vessel protected from light for 30 minutes.Perform extractions with ethanol and water separately at room temperature. Filter the liquid extracts through filter paper to separate them from the remaining biomass. Centrifuge the extracts at 8, 000 G for 10 minutes, at room temperature.Freeze dry the aqueous extracts and use a rotary evaporator at 40 degrees Celsius to evaporate the ethanol extracts.

Extractie van de bioactieve ingrediënten uit Gracilaria gracilis

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts  

To begin, take the aqueous and ethanol extracts obtained from the dried Gracilaria gracilis. In a 96 well microplate, dispense two microliters of each sample and 198 microliters of DPPH dissolved in absolute ethanol. Then, using a microplate spectrophotometer, measure the absorbance at 517 nanometers.Take the human keratinocytes grown in 96 well plates overnight. Add two microliters of the DMSO dissolved extracts to 198 microliters of the medium in microplate wells. Remove the culture medium.Add 100 microliters of MTT to the cells and incubate in the dark for 30 minutes. To solubilize the intracellular formazan crystals, add 100 microliters of DMSO. Using a microplate reader, measure the absorbance at 570 nanometers.The DPPH test demonstrated that the temperature of 40 degrees Celsius showed higher inhibition values of oxidant activity compared to extracts obtained at room temperature or 70 degrees Celsius. No cytotoxic effects were observed on human keratinocytes, suggesting that at the maximum assay concentration, both aqueous and ethanol extracts are safe for cutaneous use.

Evaluatie van de antioxiderende en cytotoxische effecten van Gracilaria gracilis-extracten

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation  

To begin, combine predefined portions of rice flour, gracilaria gracilis, and chlorella vulgaris in the equipment, and add approximately 30%water to the mixture. After a few minutes of mixing, followed by extruding the pasta, using the equipment, cut it manually. To produce chifferi, dry the pasta at 68 degrees Celsius for 42 minutes, followed by an additional five hours and 30 minutes at 76 degrees Celsius, simulating an industrial process.Finally, vacuum seal the samples and store them in a dark place at room temperature. Take one gram sample in a glass crucible with a filter bottom and position it in the fiber analyzer. Add 150 milliliters of preheated 1.25%sulfuric acid, and two milliliters of anti-foaming agent to the column of each crucible.Remove the solvent and rinse the crucible three times with deionized water to prepare the sample for the basic hydrolysis. After washing the crucibles three times with 150 milliliters of acetone, carefully transfer those to an oven set at 150 degrees Celsius for one hour. Record the final weight.Transfer the crucibles to a muffle furnace, set at 500 degrees Celsius for three hours, and then record the final weight. To determine the fatty acids profile, add two milliliters of 2%sulfuric acid solution in methanol to a 50 milligram sample. Heat the mixture at 80 degrees Celsius for two hours.Then, cool the mixture to room temperature and add one milliliter of ultrapure water and two milliliters of N-heptane to each sample. After vortexing the mixture for one minute, centrifuge it for five minutes. Later, recover the upper N-heptane phase containing the fatty acid methyl esters and transfer it to gas chromatography vials.Analyze the samples in a gas chromatograph equipped with a TR-FAME capillary column, an auto sampler, and a flame ionization detector. Determine the fatty acid profile by comparing the resulting retention times with a standard. Incubate porcelain crucibles for three hours at 105 degrees Celsius.Allow them to cool in a desiccator, and then record their weights. After incubating 10 grams of the sample, as demonstrated previously, calculate its moisture content using the displayed equation. Then, transfer the crucibles with the dried samples to an incinerator heated to 525 degrees Celsius for four hours.After cooling the samples, record their weight. To assess consumer acceptance, use chifferi pasta samples cooked in distilled water for eight minutes. Conduct sensory tests in individual sensory booths located in a sensory analysis laboratory.Evaluate the visual appearance, color, texture, odor, sea taste, overall taste, overall evaluation, and purchase intent of the samples. The pasta received ratings of five and six on a hedonic scale of one to nine for sea taste and visual appearance, respectively. The pasta had a purchase intention score of five and an overall appreciation score of six.

Pastaproductie met behulp van Gracilaria gracilis, voedingsevaluatie en sensorische evaluatie

Incorporation of Seaweed Extract in Yogurt and Color Stability Evaluation 

To begin, add 50 milliliters of sodium phosphate buffer to one gram of Gracilaria gracilis. After homogenizing the mixture, use a mortar and pestle to macerate the sample for 10 minutes. Transfer the solution to a tube and centrifuge it for 20 minutes at 12298g.After combining the supernatant, slowly add 65%ammonium sulfate, then pellet the precipitate by centrifugation and dissolve it in distilled water. Perform dialysis of the extract using a tubing membrane against water for 24 hours, followed by freeze drying. To incorporate the extract, mix it in yogurt at a concentration of 0.21%Store the samples in individual glass flasks at 4 degrees Celsius until analysis.To check the color stability of the extract in yogurt, calibrate the colorimeter using a white ceramic plate. Fill a cell with approximately 28 grams of the sample and analyze its color. The color stability of the yogurts with pigment was evaluated for 12 days at 4 degrees celsius.The incorporation of the extracts in yogurts showed good color attention with a color difference of 7.01 plus or minus 2.36 after 12 days of storage.