Name: Autor im Rampenlicht: Erforschung der bioaktiven Verbindungen von Algen für nachhaltige Innovationen in der Industrie
Uploaded: 2023-11-21T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der portugiesischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FCT) im Rahmen der strategischen Projekte unterstützt, die dem MARE-Zentrum für Meeres- und Umweltwissenschaften (UIDP/04292/2020 und UIDB/04292/2020) und dem assoziierten Labor ARNET (LA/P/0069/2020) gewährt wurden. FCT finanzierte auch die individuellen Promotionsstipendien für Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) und Tatiana Pereira (2021). 07791. BD). Diese Arbeit wurde auch durch das Projekt HP4A - GESUNDE PASTA FÜR ALLE (Co-Promotion Nr. 039952) finanziell unterstützt, das vom EFRE - Europäischer Fonds für regionale Entwicklung im Rahmen des Programms Portugal 2020 im Rahmen des operationellen Programms COMPETE 2020 - Wettbewerbsfähigkeit und Internationalisierung kofinanziert wird.

1. Ernte und Aufbereitung von Biomasse
<ol><li>Ernten Sie die Proben von G. gracilis bei Ebbe und transportieren Sie sie schnell in dunklen, gekühlten Boxen ins Labor, um Trocknung, Licht und Lufteinwirkung zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie jeden Thallus im Labor mit fließendem Meerwasser und reinigen Sie ihn gründlich, um Ablagerungen, nekrotische Teile, Epiphyten und andere Organismen von der Oberfläche zu entfernen.</li>
	<li>Halten Sie die wilde Biomasse in konstant belüftetem Meerwasser (31-35 PSU)...

Nutzung von Gracilaria gracilis: Bioaktives Potenzial für nachhaltige Innovation

Die antimikrobiellen Aktivitätstests in einem flüssigen Medium werden verwendet, um die Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen gegen Mikroorganismen zu bewerten, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, und werden in der Regel durchgeführt, um die Fähigkeit einer Substanz zu bestimmen, das Wachstum zu hemmen oder Mikroorganismen abzutöten35,36,37,38. Sie werden verwendet, um die E...

Algen können als interessanter natürlicher Rohstoff angesehen werden, von dem die Pharma-, Lebensmittel-, Futtermittel- und Umweltbranche profitieren kann. Sie biosynthetisieren eine Vielzahl von Molekülen, von denen viele in terrestrischen Organismen nicht vorkommen und relevante biologische Eigenschaften aufweisen 1,2. Es müssen jedoch Algen-optimierte Anbauprotokolle implementiert werden, um einen großen Biomassebestand zu gewährleisten.
Die Anbaumethoden müssen immer die Art der Algen-Thalli und die allgemeine Morphologie berücksichtigen. Gracilaria gracilis ist ein klonales Taxon, d.h. das Bindungsorgan produziert mehrere vegetative Achsen. Die Fortpflanzung durch Fragmentierung (vegetative Fortpflanzung) wird somit erreicht, da jede dieser Achsen vollständig in der Lage ist, ein unabhängiges Leben vom Hauptthallus3 anzunehmen. Klonale Taxa können mit einfachen und schnellen einstufigen Kultivierungsmethoden erfolgreich integriert werden, da große Mengen an Biomasse durch die Spaltung des Thallus in kleine Fragmente gewonnen werden, die sich schnell regenerieren und zu neuen, genetisch identischen Individuen heranwachsen. Dabei können sowohl haplontische als auch diplontische Thalli verwendet werden. Obwohl die Gattung einen komplexen haplo-diplontischen isomorphen triphasischen Lebenszyklus aufweist, ist eine Sporulation nur selten erforderlich, es sei denn, eine genetische Erneuerung der Bestände ist erforderlich, um verbesserte Ernten zu erzielen. In diesem Fall entstehen sowohl Tetrasporen (haplontische Sporen, die durch Meiose gebildet werden) als auch Carposporen (diplontische Sporen, die durch Mitose gebildet werden) makroskopische Thalli, die dann durch vegetative Vermehrung gezüchtet und vermehrt werden können4. Wachstumszyklen werden von den Umweltbedingungen und dem physiologischen Zustand der Individuen bestimmt, neben anderen biologischen Faktoren wie der Entstehung von Epiphyten und der Adhäsion anderer Organismen. Daher ist die Optimierung der Wachstumsbedingungen von entscheidender Bedeutung, um eine hohe Produktivität zu gewährleisten und Biomasse von guter Qualität zu produzieren5.
Die Extraktion bioaktiver Verbindungen aus Algen, einschließlich G. gracilis, kann durch verschiedene Methoden erreichtwerden 6,7. Die Wahl der Extraktionsmethode hängt von den spezifischen Verbindungen von Interesse, der Zielanwendung und den Eigenschaften der Algen ab. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Lösungsmittelextraktion, bei der grüne Lösungsmittel wie Wasser oder Ethanol verwendet werden, um bioaktive Verbindungen aus der Algenbiomasse aufzulösen und zu extrahieren. Die Extraktion kann durch Mazeration vielseitig und effektiv durchgeführt werden und kann für eine Vielzahl von Verbindungen verwendet werden. Es handelt sich um eine einfache und weit verbreitete Methode, bei der Biomasse über einen längeren Zeitraum in einem Lösungsmittel eingeweicht wird, typischerweise bei Raum- oder leicht erhöhten Temperaturen. Das Lösungsmittel wird gerührt, um den Extraktionsprozess zu verbessern. Nach der gewünschten Extraktionszeit wird das Lösungsmittel durch Filtration oder Zentrifugation vom Feststoff getrennt.
Wasser ist aufgrund seiner Sicherheit, Verfügbarkeit und Kompatibilität mit einer Vielzahl von Lebensmitteln ein häufig verwendetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen. Die Wasserextraktion eignet sich für polare Verbindungen wie Polysaccharide, Peptide und bestimmte Phenole. Es kann jedoch sein, dass es unpolare Verbindungen nicht effektiv extrahiert. Ethanol ist auch ein weit verbreitetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen und kann für die Extraktion einer Vielzahl von bioaktiven Molekülen, einschließlich phenolischer Verbindungen, Flavonoide und bestimmter Pigmente, wirksam sein. Ethanol ist allgemein als sicher für die Verwendung in Lebensmitteln anerkannt und kann leicht verdampft werden, wobei die extrahierten Verbindungen zurückbleiben. Es ist erwähnenswert, dass bei der Wahl der Extraktionsmethode Faktoren wie Effizienz, Selektivität, Kosteneffizienz und Umweltauswirkungen berücksichtigt werden sollten. Die Optimierung von Extraktionsparametern wie Lösungsmittelkonzentration, Extraktionszeit, Temperatur und Druck ist entscheidend, um optimale Ausbeuten an bioaktiven Verbindungen aus G. gracilis oder anderen Algen zu erzielen.
Es wurde festgestellt, dass Algen eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen, darunter Bakterien, Pilze und Viren8. Diese Aktivität wird bioaktiven Komponenten zugeschrieben, darunter Phenole, Polysaccharide, Peptide und Fettsäuren. Mehrere Studien haben ihre Wirksamkeit gegen Krankheitserreger wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. und Pseudomonas aeruginosa unter anderem nachgewiesen9. Die antimikrobielle Aktivität von Algen wird auf das Vorhandensein bioaktiver Verbindungen zurückgeführt, die mikrobielle Zellwände, Membranen, Enzyme und Signalwege stören können10. Diese Verbindungen können das mikrobielle Wachstum stören, die Bildung von Biofilmen hemmen und die Immunantwort modulieren.
Rote Algen, auch Rhodophyten genannt, sind eine Gruppe von Algen, die eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen können. Innerhalb dieser Gruppe enthält G. gracilis verschiedene bioaktive Verbindungen, die zu seiner berichteten antimikrobiellen Aktivität beitragen können. Während die spezifischen Moleküle variieren können, sind die gemeinsamen Klassen, über die in G. gracilis berichtet wurde und antimikrobielle Eigenschaften besitzen können, Polysaccharide, Phenole, Terpenoide und Pigmente11. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein und die Mengen dieser Komponenten je nach Faktoren wie dem Ort der Algensammlung, der Saisonalität, dem physiologischen Zustand des Thallis und den Umweltbedingungen variieren können. Daher können die spezifische Klasse und Konzentration der antimikrobiellen Verbindungen in G. gracilis entsprechend variieren.
Es wurde auch festgestellt, dass G. gracilis antioxidative Eigenschaften besitzt, die verschiedene phenolische Verbindungen enthalten, von denen gezeigt wurde, dass sie freie Radikale abfangen und oxidativen Stress reduzieren12.Antioxidantien tragen dazu bei, die Zellen vor Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies zu schützen und haben potenzielle gesundheitliche Vorteile. Die antioxidative Kapazität kann direkt durch verschiedene Methoden bewertet werden, einschließlich der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Radikalfängeraktivität und indirekt durch die Quantifizierung des Gesamtpolyphenolgehalts (TPC)13.
Auch wenn ein Inhaltsstoff eine ausgeprägte Bioaktivität aufweist, ist seine Zytotoxizitätsbewertung bei der Bewertung natürlicher und synthetischer Substanzen, die in Kontakt mit lebenden Zellen oder Geweben verwendet werden sollen, unerlässlich. Es gibt mehrere Methoden zur Messung der Zytotoxizität, jede mit Vor- und Nachteilen. Insgesamt bieten sie eine Reihe von Möglichkeiten, die schädlichen Auswirkungen vieler Substanzen auf Zellen zu bewerten und gleichzeitig die Mechanismen von Zellschädigung und Zelltod zu untersuchen14.
In dieser Arbeit verwenden wir den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay, eine kolorimetrische Methode, die von Mosmann (1983)15 eingeführt wurde. Diese Methode misst die Reduktion von Tetrazoliumsalzen zu einem violetten Formazanprodukt durch stoffwechselaktive Zellen. Je höher die Menge an Formazankristallen, desto höher ist die Anzahl lebensfähiger Zellen, was ein indirektes Maß für die Zytotoxizität darstellt14. Da in dieser Arbeit G. gracilis-Wasser und Ethanolextrakte in dermokosmetische Formulierungen eingearbeitet werden sollen, wird die in vitro Zytotoxizitätsbewertung in einer Keratinozyten (HaCaT)-Zelllinie durchgeführt.
In Bezug auf die Lebensmittelanwendung sind Algen im Allgemeinen kalorienarm und nährstoffreich an Ballaststoffen, essentiellen Elementen und Aminosäuren, Polysacchariden, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, Polyphenolen und Vitaminen 2,16. G. gracilis ist da keine Ausnahme und hat einen interessanten Nährwert. Freitas et al. (2021)4 fanden heraus, dass kultivierte G. gracilis im Vergleich zu wilden Algen einen höheren Protein- und Vitamin-C-Gehalt aufwies und den Gesamtlipidspiegel beibehielt. Dies kann einen wirtschaftlichen und ökologischen Vorteil darstellen, da die Produktion ernährungsphysiologisch der Ausbeutung wilder Ressourcen vorzuziehen ist. Darüber hinaus sind die Verbraucher zunehmend besorgt über die Art der Lebensmittel, die sie essen, daher ist es wichtig, neue Zutaten für die Anreicherung von Lebensmitteln einzuführen und neue Ressourcen zu verwenden, um Extrakte zu erhalten, die einem Produkt einen Mehrwert verleihen und ein "sauberes Etikett" beanspruchen können. Außerdem ist der derzeitige Markt sehr wettbewerbsintensiv und erfordert die Entwicklung neuer Produkte und innovativer Strategien, um die Hersteller von ihren Mitbewerbern abzuheben17.
Die Anreicherung von Produkten mit geringem Nährwert, wie z. B. Nudeln, mit Meeresressourcen, einschließlich Algen, ist eine Strategie, um diese Ressource als neues Lebensmittel einzuführen, und eine Marktdifferenzierungsstrategie durch ein Produkt mit ausgeprägtem Nährwert. Auf der anderen Seite ist G. gracilis eine Quelle für natürliche rote Pigmente wie Phycobiliproteine18, die ein hohes Potenzial für Anwendungen in der Lebensmittelindustrie haben. Diese Algen haben in mehreren Bereichen großes Interesse gezeigt, und ihre Anwendung kann mit den gesamten Algen, Extrakten und/oder der verbleibenden Biomasse erfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir einige Beispiele für solche Anwendungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Aga, Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale balance</td>
			<td>Sartorius, TE124S</td>
			<td>22105307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis subsp. spizizenii</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM 347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td>5811JH490481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Chamber</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Fluorescent Lamps</td>
			<td>OSRAM Lumilux Skywhite</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer McFarland</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>1898-66-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (DSM 5922)</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM5922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>AGA-Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (Whatman No.1)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA1001320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin-Ciocalteu</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>31360.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic Acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>149-91-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germanium (IV) Oxide, 99.999%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>1310-53-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaCaT cells &#8211; 300493</td>
			<td>CLS-Cell Lines Services, Germany&#160;</td>
			<td>300493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA, C-MAG HS7</td>
			<td>06.090564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>10124-49-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>TelStar, Portugal</td>
			<td>526013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listonella anguillarum</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>&#160;DSM 21597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7773.01.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>738-0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10022403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>&#160;Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA</td>
			<td>1611151E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth (MHB)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>90004-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, FD115</td>
			<td>12-04490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, BD115</td>
			<td>04-62615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1406-05-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter Inolab</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>15212099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippete tips</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>5412307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Bottles Media Storage</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>16157-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph, Laborota 4000</td>
			<td>80409287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor</td>
			<td>IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal</td>
			<td>07.524254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Normax Chem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMagic NX</td>
			<td>Konica Minolta, Japan</td>
			<td></td>
			<td>color data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA</td>
			<td>5A4T092004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-92-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>59-43-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>ICNA091010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>22091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water&#160;</td>
			<td>Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F5HA17360B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Buchi, Switzerland</td>
			<td>FIS05-402-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Merck</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

valorization of the red seaweed gracilaria gracilis through a biorefinery approach

Das Interesse an Algen als reichlich vorhandener Rohstoff zur Gewinnung wertvoller und zielführender bioaktiver Inhaltsstoffe wächst kontinuierlich. In dieser Arbeit untersuchen wir das Potenzial von Gracilaria gracilis, einer essbaren Rotalge, die weltweit wegen ihres kommerziellen Interesses als Quelle für Agar und andere Inhaltsstoffe für kosmetische, pharmakologische, Lebensmittel- und Futtermittelanwendungen angebaut wird.
Die Wachstumsbedingungen von G. gracilis wurden durch vegetative Vermehrung und Sporulation optimiert, während die physikalisch-chemischen Bedingungen manipuliert wurden, um einen großen Biomassebestand zu erreichen. Grüne Extraktionsmethoden mit Ethanol und Wasser wurden über die Algenbiomasse durchgeführt. Das bioaktive Potenzial der Extrakte wurde durch eine Reihe von In-vitro-Assays hinsichtlich ihrer Zytotoxizität, ihrer antioxidativen und antimikrobiellen Eigenschaften bewertet. Darüber hinaus wurde getrocknete Algenbiomasse in Nudelformulierungen eingearbeitet, um den Nährwert der Lebensmittel zu erhöhen. Aus G. gracilis extrahierte Pigmente wurden auch als natürlicher Farbstoff in Joghurt eingearbeitet und ihre Stabilität bewertet. Beide Produkte wurden einer halbgeschulten sensorischen Jury unterzogen, die darauf abzielt, die beste Endformulierung zu erreichen, bevor sie auf den Markt kommen.
Die Ergebnisse belegen die Vielseitigkeit von G. gracilis , unabhängig davon, ob es als Gesamtbiomasse, Extrakte und/oder Pigmente angewendet wird. Durch die Implementierung mehrerer optimierter Protokolle ermöglicht diese Arbeit die Entwicklung von Produkten mit dem Potenzial, von den Lebensmittel-, Kosmetik- und Aquakulturmärkten zu profitieren und die ökologische Nachhaltigkeit und eine blaue Kreislaufwirtschaft zu fördern.
Darüber hinaus wird die verbleibende Algenbiomasse im Einklang mit einem Bioraffinerieansatz als Biostimulans für das Pflanzenwachstum verwendet oder in Kohlenstoffmaterialien umgewandelt, die bei der Wasseraufbereitung der hauseigenen Aquakultursysteme von MARE-Polytechnic in Leiria, Portugal, verwendet werden.

&#160;Seaweeds can be regarded as an interesting natural raw material to be profited by the pharmaceutical, food, feed, and environmental sectors. They biosynthesize a panoply of molecules, many not found in terrestrial organisms, with relevant biological properties1,2. However, seaweed-optimized cultivation protocols need to be implemented to ensure a large biomass stock.
Cultivation methods must always consider the nature of the seaweed thalli and overall morphology. Gracilaria gracilis is a clonal taxon, meaning the attachment organ produces multiple vegetative axes. Propagation by fragmentation (vegetative reproduction) is thus achieved, as each of these axes is fully able to adopt an independent life from the main thallus3. Clonal taxa can be successfully integrated with simple and fast one-step cultivation methodologies, as large amounts of biomass are obtained by splitting the thallus into small fragments that quickly regenerate and grow into new, genetically identical individuals. Both haplontic and diplontic thalli may be used in this process. Although the genus exhibits a complex haplo-diplontic isomorphic triphasic life cycle, sporulation is rarely necessary except when genetic renewal of the stocks is required to achieve improved crops. In this case, both tetraspores (haplontic spores formed by meiosis) and carpospores (diplontic spores formed by mitosis) give rise to macroscopic thalli that can then be grown and propagated by vegetative reproduction4. Growth cycles are dictated by environmental conditions and the physiological state of the individuals, among other biological factors such as the emergence of epiphytes and the adhesion of other organisms. Therefore, optimizing growing conditions is crucial to ensure high productivity and produce good quality biomass5.
The extraction of bioactive compounds from seaweed, including G. gracilis, can be achieved through various methods6,7. The choice of the extraction method depends on the specific compounds of interest, the target application, and the characteristics of the seaweed. In this study, we focused on solvent extraction, which involves using green solvents, such as water or ethanol, to dissolve and extract bioactive compounds from the seaweed biomass. The extraction can be carried out through maceration in a versatile and effective way and can be used for a wide range of compounds. It is a simple and widely used method involving soaking biomass in a solvent for an extended period, typically at room or slightly elevated temperatures. The solvent is stirred to enhance the extraction process. After the desired extraction time, the solvent is separated from the solid material by filtration or centrifugation.
Water is a commonly used solvent in food applications due to its safety, availability, and compatibility with a wide range of food products. Water extraction is suitable for polar compounds such as polysaccharides, peptides, and certain phenolics. However, it may not effectively extract non-polar compounds. Ethanol is also a widely used solvent in food applications and can be effective for extracting a variety of bioactive molecules, including phenolic compounds, flavonoids, and certain pigments. Ethanol is generally recognized as safe for use in food and can be easily evaporated, leaving behind the extracted compounds. It is worth noting that the choice of extraction method should consider factors such as efficiency, selectivity, cost-effectiveness, and environmental impact. The optimization of extraction parameters, such as solvent concentration, extraction time, temperature, and pressure, is crucial to achieving optimal yields of bioactive compounds from G. gracilis or other seaweeds.
Seaweeds have been found to exhibit antimicrobial activity against a wide range of microorganisms, including bacteria, fungi, and viruses8. This activity is attributed to bioactive components, including phenolics, polysaccharides, peptides, and fatty acids. Several studies have demonstrated their efficacy against pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., and Pseudomonas aeruginosa, among others9. The antimicrobial activity of seaweeds is attributed to the presence of bioactive compounds that can interfere with microbial cell walls, membranes, enzymes, and signaling pathways10. These compounds may disrupt microbial growth, inhibit biofilm formation, and modulate immune responses.
Red seaweeds, also known as rhodophytes, are a group of algae that can exhibit antimicrobial activity against a variety of microorganisms. Within this group, G. gracilis contains various bioactive compounds that may contribute to its reported antimicrobial activity. While the specific molecules can vary, the common classes that have been reported in G. gracilis and may possess antimicrobial properties are polysaccharides, phenolics, terpenoids, and pigments11. However, it is important to note that the presence and amounts of these components can vary depending on factors such as the location of seaweed collection, seasonality, physiological condition of the thalli, and environmental conditions. Therefore, the specific class and concentration of antimicrobial compounds in G. gracilis may vary accordingly.
G. gracilis has also been found to hold antioxidant properties, containing various phenolic compounds, which have been shown to scavenge free radicals and reduce oxidative stress12. Antioxidants help to protect cells from damage caused by reactive oxygen species and have potential health benefits. Antioxidant capacity can be evaluated directly through different methods, including the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity and, indirectly, through the quantification of total polyphenolic content (TPC)13.
Even though an ingredient is reported to have a prominent bioactivity, its cytotoxicity assessment is indispensable in evaluating natural and synthetic substances to be used in contact with living cells or tissues. There are several methods for measuring cytotoxicity, each one with advantages and limitations. Overall, they offer a range of options to evaluate the harmful effects of many substances on cells and, at the same time, to investigate the mechanisms of cell damage and death14.
In this work, we use the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a colorimetric method introduced by Mosmann (1983)15. This method measures the reduction of tetrazolium salts to a purple formazan product by metabolically active cells. The higher the amount of formazan crystals, the higher the number of viable cells, thus providing an indirect measure of cytotoxicity14. Since in this work, G. gracilis water and ethanol extracts are intended to be incorporated into dermo-cosmetic formulations, the in vitro cytotoxicity evaluation is performed in a keratinocyte (HaCaT) cell line.
Concerning the food application, seaweeds are generally low in calories and nutritionally rich in dietary fibers, essential elements and amino acids, polysaccharides, polyunsaturated fatty acids, polyphenols, and vitamins2,16. G. gracilis is no exception, having an interesting nutritional value. Freitas et al. (2021)4 found that cultivated G. gracilis had higher levels of protein and vitamin C and maintained the level of total lipids compared to wild seaweed. This may represent an economic and environmental advantage, as nutritionally speaking, production is preferable to the exploitation of wild resources. In addition, consumers are increasingly concerned about the type of food they eat, so it is important to introduce new ingredients for food enrichment and use new resources to obtain extracts that can add value to a product and claim a &#34;clean label.&#34; Besides, the current market is very competitive, requiring the development of new products and innovative strategies to differentiate manufacturers from their competitors17.
The enrichment of products with poor nutritional value, such as pasta, with marine resources, including seaweed, is a strategy to introduce this resource as a new food and a market differentiation strategy through a product with distinct nutritional value. On the other hand, G. gracilis is a source of natural red pigments such as phycobiliproteins18, having high potential for applications in the food industry. This seaweed has shown high interest in several areas, and its application can be made using the whole seaweed, extracts and/or the remaining biomass. In this work, we demonstrate some examples of such applications.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der bioaktiven Verbindungen von Algen für nachhaltige Innovationen in der Industrie 

Aufwertung der Rotalge Gracilaria gracilis durch einen Bioraffinerieansatz

Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceutical drugs.One of the challenges of using seaweed in the development of new food products is to avoid using high amounts that could lead to unpleasant sensory properties in food. Using seaweed extracts is a way to get around this problem. With this protocol, we were able to develop pasta, wheat, add nutritional value by incorporating whole algae.Usually, the addition of these ingredients provides less common sensory properties. However, with the developed formulation, a consumer acceptance was still achieved.

Antimikrobielle Aktivität
Bei der Interpretation der erzielten Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass je höher der Prozentsatz der Hemmung ist, desto größer ist die Wirksamkeit des Extrakts bei der Hemmung des Wachstums dieses spezifischen Stammes und desto interessanter ist der Extrakt folglich als antimikrobielles Mittel. Durch diese Methodik können wir schnell feststellen, welche Extrakte eine größer...

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Hier beschreiben wir verschiedene Protokolle, die auf eine integrierte Aufwertung von Gracilaria gracilis abzielen: Ernte von Wildarten, Eigenzucht und Extraktion von bioaktiven Inhaltsstoffen. Die antioxidative, antimikrobielle und zytotoxische Wirkung der Extrakte wird ebenso bewertet wie die Nährwert- und Stabilitätsbewertung von Lebensmitteln, die mit ganzer Algenbiomasse und Pigmenten angereichert sind.

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Prospektion neuer bioaktiver Verbindungen aus Algen, die in verschiedenen Sektoren wie der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie nützlich sein können. In der Gesellschaft wächst das Bewusstsein für das Potenzial von Meeresorganismen, bioaktive Verbindungen zu liefern. Diese Verbindungen können zur Herstellung nachhaltiger und sichererer funktioneller Kosmetika verwendet werden, um die Qualität von Lebensmitteln zu verbessern und als Quelle für neue chemische Strukturen für die Entwicklung neuer pharmazeutischer Medikamente zu dienen.Eine der Herausforderungen bei der Verwendung von Algen bei der Entwicklung neuer Lebensmittelprodukte besteht darin, die Verwendung hoher Mengen zu vermeiden, die zu unangenehmen sensorischen Eigenschaften in Lebensmitteln führen könnten. Die Verwendung von Algenextrakten ist eine Möglichkeit, dieses Problem zu umgehen. Mit diesem Protokoll waren wir in der Lage, Nudeln und Weizen zu entwickeln und den Nährwert durch die Einarbeitung ganzer Algen zu erhöhen.In der Regel sorgt die Zugabe dieser Inhaltsstoffe für weniger verbreitete sensorische Eigenschaften. Mit der entwickelten Formulierung wurde jedoch dennoch eine Verbraucherakzeptanz erreicht.

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Research

JoVE Journal

Biology

Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we explore the potential of Gracilaria gracilis, an edible red seaweed cultivated worldwide for its commercial interest as a source of agar and other ingredients for cosmetic, pharmacological, food, and feed applications.
G. gracilis growth conditions were optimized through vegetative propagation and sporulation while manipulating the physicochemical conditions to achieve a large biomass stock. Green extraction methodologies with ethanol and water were performed over the seaweed biomass. The bioactive potential of extracts was assessed through a set of in vitro assays concerning their cytotoxicity, antioxidant, and antimicrobial properties. Additionally, dried seaweed biomass was incorporated into pasta formulations to increase food&#39;s nutritional value. Pigments extracted from G. gracilis have also been incorporated into yogurt as a natural colorant, and their stability was evaluated. Both products were submitted to the appreciation of a semi-trained sensorial panel aiming to achieve the best final formulation before reaching the market.
Results support the versatility of G. gracilis whether it is applied as a whole biomass, extracts and/or pigments. Through implementing several optimized protocols, this work allows the development of products with the potential to profit the food, cosmetic, and aquaculture markets, promoting environmental sustainability and a blue circular economy.
Moreover, and in line with a biorefinery approach, the residual seaweed biomass will be used as biostimulant for plant growth or converted to carbon materials to be used in water purification of the in-house aquaculture systems of MARE-Polytechnic of Leiria, Portugal.

Here, we describe several protocols aiming at an integrated valorization of Gracilaria gracilis: wild species harvesting, in-house growth, and extraction of bioactive ingredients. The extracts&#39; antioxidant, antimicrobial, and cytotoxic effects are evaluated, along with the nutritional and stability assessment of food enriched with whole seaweed biomass and pigments.

Forschung

Biologie

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis  

To begin, grow Gracilaria gracilis in 250 milliliters of flat bottom flasks in a climatic room. Once the biomass has been scaled up, dried, and ground, weigh the resulting dried biomass. Dissolve it in 100 milliliters of solvent and mix by stirring in a vessel protected from light for 30 minutes.Perform extractions with ethanol and water separately at room temperature. Filter the liquid extracts through filter paper to separate them from the remaining biomass. Centrifuge the extracts at 8, 000 G for 10 minutes, at room temperature.Freeze dry the aqueous extracts and use a rotary evaporator at 40 degrees Celsius to evaporate the ethanol extracts.

Extraktion der bioaktiven Inhaltsstoffe aus Gracilaria gracilis

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts  

To begin, take the aqueous and ethanol extracts obtained from the dried Gracilaria gracilis. In a 96 well microplate, dispense two microliters of each sample and 198 microliters of DPPH dissolved in absolute ethanol. Then, using a microplate spectrophotometer, measure the absorbance at 517 nanometers.Take the human keratinocytes grown in 96 well plates overnight. Add two microliters of the DMSO dissolved extracts to 198 microliters of the medium in microplate wells. Remove the culture medium.Add 100 microliters of MTT to the cells and incubate in the dark for 30 minutes. To solubilize the intracellular formazan crystals, add 100 microliters of DMSO. Using a microplate reader, measure the absorbance at 570 nanometers.The DPPH test demonstrated that the temperature of 40 degrees Celsius showed higher inhibition values of oxidant activity compared to extracts obtained at room temperature or 70 degrees Celsius. No cytotoxic effects were observed on human keratinocytes, suggesting that at the maximum assay concentration, both aqueous and ethanol extracts are safe for cutaneous use.

Bewertung der antioxidativen und zytotoxischen Wirkungen von Gracilaria gracilis-Extrakten

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation  

To begin, combine predefined portions of rice flour, gracilaria gracilis, and chlorella vulgaris in the equipment, and add approximately 30%water to the mixture. After a few minutes of mixing, followed by extruding the pasta, using the equipment, cut it manually. To produce chifferi, dry the pasta at 68 degrees Celsius for 42 minutes, followed by an additional five hours and 30 minutes at 76 degrees Celsius, simulating an industrial process.Finally, vacuum seal the samples and store them in a dark place at room temperature. Take one gram sample in a glass crucible with a filter bottom and position it in the fiber analyzer. Add 150 milliliters of preheated 1.25%sulfuric acid, and two milliliters of anti-foaming agent to the column of each crucible.Remove the solvent and rinse the crucible three times with deionized water to prepare the sample for the basic hydrolysis. After washing the crucibles three times with 150 milliliters of acetone, carefully transfer those to an oven set at 150 degrees Celsius for one hour. Record the final weight.Transfer the crucibles to a muffle furnace, set at 500 degrees Celsius for three hours, and then record the final weight. To determine the fatty acids profile, add two milliliters of 2%sulfuric acid solution in methanol to a 50 milligram sample. Heat the mixture at 80 degrees Celsius for two hours.Then, cool the mixture to room temperature and add one milliliter of ultrapure water and two milliliters of N-heptane to each sample. After vortexing the mixture for one minute, centrifuge it for five minutes. Later, recover the upper N-heptane phase containing the fatty acid methyl esters and transfer it to gas chromatography vials.Analyze the samples in a gas chromatograph equipped with a TR-FAME capillary column, an auto sampler, and a flame ionization detector. Determine the fatty acid profile by comparing the resulting retention times with a standard. Incubate porcelain crucibles for three hours at 105 degrees Celsius.Allow them to cool in a desiccator, and then record their weights. After incubating 10 grams of the sample, as demonstrated previously, calculate its moisture content using the displayed equation. Then, transfer the crucibles with the dried samples to an incinerator heated to 525 degrees Celsius for four hours.After cooling the samples, record their weight. To assess consumer acceptance, use chifferi pasta samples cooked in distilled water for eight minutes. Conduct sensory tests in individual sensory booths located in a sensory analysis laboratory.Evaluate the visual appearance, color, texture, odor, sea taste, overall taste, overall evaluation, and purchase intent of the samples. The pasta received ratings of five and six on a hedonic scale of one to nine for sea taste and visual appearance, respectively. The pasta had a purchase intention score of five and an overall appreciation score of six.

Teigwarenherstellung mit Gracilaria gracilis, ernährungsphysiologische und sensorische Bewertung

Incorporation of Seaweed Extract in Yogurt and Color Stability Evaluation 

To begin, add 50 milliliters of sodium phosphate buffer to one gram of Gracilaria gracilis. After homogenizing the mixture, use a mortar and pestle to macerate the sample for 10 minutes. Transfer the solution to a tube and centrifuge it for 20 minutes at 12298g.After combining the supernatant, slowly add 65%ammonium sulfate, then pellet the precipitate by centrifugation and dissolve it in distilled water. Perform dialysis of the extract using a tubing membrane against water for 24 hours, followed by freeze drying. To incorporate the extract, mix it in yogurt at a concentration of 0.21%Store the samples in individual glass flasks at 4 degrees Celsius until analysis.To check the color stability of the extract in yogurt, calibrate the colorimeter using a white ceramic plate. Fill a cell with approximately 28 grams of the sample and analyze its color. The color stability of the yogurts with pigment was evaluated for 12 days at 4 degrees celsius.The incorporation of the extracts in yogurts showed good color attention with a color difference of 7.01 plus or minus 2.36 after 12 days of storage.