Name: Autore in primo piano: Esplorare i composti bioattivi delle alghe per innovazioni sostenibili nelle industrie
Uploaded: 2023-11-21T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Portoghese per la Scienza e la Tecnologia (FCT) attraverso i Progetti Strategici concessi al MARE-Centro di Scienze Marine e Ambientali (UIDP/04292/2020 e UIDB/04292/2020) e al Laboratorio Associato ARNET (LA/P/0069/2020). FCT ha inoltre finanziato le borse di dottorato individuali assegnate a Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) e Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente anche dal progetto HP4A - PASTA SANA PER TUTTI (co-promozione n. 039952), cofinanziato dal FESR - Fondo Europeo di Sviluppo Regionale, nell'ambito del Programma Portogallo 2020, attraverso COMPETE 2020 - Programma Operativo Competitività e Internazionalizzazione.

1. Raccolta e preparazione della biomassa
<ol><li>Raccogli gli esemplari di G. gracilis durante la bassa marea e trasportali rapidamente in laboratorio in scatole buie e refrigerate per evitare l'essiccazione, la luce e l'esposizione all'aria.</li>
	<li>In laboratorio, lavare ogni tallo con acqua di mare corrente e pulire accuratamente per rimuovere detriti, parti necrotiche, epifite e altri organismi dalla superficie.</li>
	<li>Mantenere la biomassa selvatica in acqua di mare costantemente aerata (31-35 psu) ...

Sfruttare la Gracilaria gracilis: potenziale bioattivo per l'innovazione sostenibile

I test di attività antimicrobica in un mezzo liquido sono utilizzati per valutare l'efficacia delle sostanze antimicrobiche contro i microrganismi sospesi in un mezzo liquido e vengono solitamente eseguiti per determinare la capacità di una sostanza di inibire la crescita o uccidere i microrganismi35,36,37,38. Sono utilizzati per valutare la sensibilità dei microrganismi agli agenti antimicr...

Le alghe possono essere considerate un'interessante materia prima naturale da trarre profitto dai settori farmaceutico, alimentare, dei mangimi e ambientale. Biosintetizzano una panoplia di molecole, molte delle quali non presenti negli organismi terrestri, con proprietà biologiche rilevanti 1,2. Tuttavia, è necessario implementare protocolli di coltivazione ottimizzati per le alghe marine per garantire un ampio stock di biomassa.
I metodi di coltivazione devono sempre tenere conto della natura dei talli delle alghe e della morfologia complessiva. Gracilaria gracilis è un taxon clonale, il che significa che l'organo di attacco produce più assi vegetativi. Si ottiene così la propagazione per frammentazione (riproduzione vegetativa), in quanto ciascuno di questi assi è pienamente in grado di adottare una vita indipendente dal tallo principale3. I taxa clonali possono essere integrati con successo con metodologie di coltivazione semplici e veloci in un solo passaggio, poiché grandi quantità di biomassa si ottengono dividendo il tallo in piccoli frammenti che si rigenerano rapidamente e crescono in nuovi individui geneticamente identici. In questo processo possono essere utilizzati sia talli aplontici che diplonti. Sebbene il genere presenti un complesso ciclo vitale trifasico isomorfo aplo-diplontico, la sporulazione è raramente necessaria, tranne quando è necessario il rinnovamento genetico dei ceppi per ottenere raccolti migliori. In questo caso, sia le tetraspore (spore aplontiche formate dalla meiosi) che le carpospore (spore diplontiche formate dalla mitosi) danno origine a talli macroscopici che possono poi essere cresciuti e propagati per riproduzione vegetativa4. I cicli di crescita sono dettati dalle condizioni ambientali e dallo stato fisiologico degli individui, tra gli altri fattori biologici come l'emergere di epifite e l'adesione di altri organismi. Pertanto, l'ottimizzazione delle condizioni di coltivazione è fondamentale per garantire un'elevata produttività e produrre biomassa di buona qualità5.
L'estrazione di composti bioattivi dalle alghe, tra cui G. gracilis, può essere ottenuta attraverso vari metodi 6,7. La scelta del metodo di estrazione dipende dai composti specifici di interesse, dall'applicazione target e dalle caratteristiche dell'alga. In questo studio, ci siamo concentrati sull'estrazione con solvente, che prevede l'utilizzo di solventi verdi, come acqua o etanolo, per sciogliere ed estrarre composti bioattivi dalla biomassa delle alghe. L'estrazione può essere effettuata tramite macerazione in modo versatile ed efficace e può essere utilizzata per una vasta gamma di composti. Si tratta di un metodo semplice e ampiamente utilizzato che prevede l'immersione della biomassa in un solvente per un periodo prolungato, in genere a temperatura ambiente o leggermente elevata. Il solvente viene mescolato per migliorare il processo di estrazione. Dopo il tempo di estrazione desiderato, il solvente viene separato dal materiale solido mediante filtrazione o centrifugazione.
L'acqua è un solvente comunemente usato nelle applicazioni alimentari grazie alla sua sicurezza, disponibilità e compatibilità con un'ampia gamma di prodotti alimentari. L'estrazione dell'acqua è adatta per composti polari come polisaccaridi, peptidi e alcuni fenolici. Tuttavia, potrebbe non estrarre efficacemente composti non polari. L'etanolo è anche un solvente ampiamente utilizzato nelle applicazioni alimentari e può essere efficace per estrarre una varietà di molecole bioattive, inclusi composti fenolici, flavonoidi e alcuni pigmenti. L'etanolo è generalmente riconosciuto come sicuro per l'uso negli alimenti e può essere facilmente evaporato, lasciando dietro di sé i composti estratti. Vale la pena notare che la scelta del metodo di estrazione dovrebbe considerare fattori come l'efficienza, la selettività, l'economicità e l'impatto ambientale. L'ottimizzazione dei parametri di estrazione, come la concentrazione del solvente, il tempo di estrazione, la temperatura e la pressione, è fondamentale per ottenere rese ottimali di composti bioattivi da G. gracilis o da altre alghe.
È stato riscontrato che le alghe mostrano attività antimicrobica contro un'ampia gamma di microrganismi, tra cui batteri, funghi e virus8. Questa attività è attribuita a componenti bioattivi, tra cui fenolici, polisaccaridi, peptidi e acidi grassi. Diversi studi hanno dimostrato la loro efficacia contro agenti patogeni come Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. e Pseudomonas aeruginosa, tra gli altri9. L'attività antimicrobica delle alghe è attribuita alla presenza di composti bioattivi che possono interferire con le pareti cellulari microbiche, le membrane, gli enzimi e le vie di segnalazione10. Questi composti possono interrompere la crescita microbica, inibire la formazione di biofilm e modulare le risposte immunitarie.
Le alghe rosse, note anche come rodofite, sono un gruppo di alghe che possono esibire attività antimicrobica contro una varietà di microrganismi. All'interno di questo gruppo, G. gracilis contiene vari composti bioattivi che possono contribuire alla sua attività antimicrobica segnalata. Mentre le molecole specifiche possono variare, le classi comuni che sono state riportate in G. gracilis e che possono possedere proprietà antimicrobiche sono polisaccaridi, fenolici, terpenoidi e pigmenti11. Tuttavia, è importante notare che la presenza e la quantità di questi componenti possono variare a seconda di fattori come il luogo di raccolta delle alghe, la stagionalità, le condizioni fisiologiche dei talli e le condizioni ambientali. Pertanto, la classe specifica e la concentrazione di composti antimicrobici in G. gracilis possono variare di conseguenza.
È stato anche scoperto che G. gracilis ha proprietà antiossidanti, contenendo vari composti fenolici, che hanno dimostrato di eliminare i radicali liberi e ridurre lo stress ossidativo12.Gli antiossidanti aiutano a proteggere le cellule dai danni causati dalle specie reattive dell'ossigeno e hanno potenziali benefici per la salute. La capacità antiossidante può essere valutata direttamente attraverso diversi metodi, tra cui l'attività di scavenging dei radicali liberi 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH) e, indirettamente, attraverso la quantificazione del contenuto polifenolico totale (TPC)13.
Anche se un ingrediente ha una bioattività prominente, la sua valutazione della citotossicità è indispensabile per valutare le sostanze naturali e sintetiche da utilizzare a contatto con cellule o tessuti viventi. Esistono diversi metodi per misurare la citotossicità, ognuno con vantaggi e limiti. Nel complesso, offrono una serie di opzioni per valutare gli effetti nocivi di molte sostanze sulle cellule e, allo stesso tempo, per studiare i meccanismi del danno e della morte cellulare14.
In questo lavoro, utilizziamo il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), un metodo colorimetrico introdotto da Mosmann (1983)15. Questo metodo misura la riduzione dei sali di tetrazolio a un prodotto di formazano viola da parte di cellule metabolicamente attive. Maggiore è la quantità di cristalli di formazano, maggiore è il numero di cellule vitali, fornendo così una misura indiretta della citotossicità14. Poiché in questo lavoro l'acqua di G. gracilis e gli estratti di etanolo sono destinati ad essere incorporati in formulazioni dermocosmetiche, la valutazione della citotossicità in vitro viene eseguita in una linea cellulare di cheratinociti (HaCaT).
Per quanto riguarda l'applicazione alimentare, le alghe sono generalmente povere di calorie e nutrizionalmente ricche di fibre alimentari, elementi essenziali e aminoacidi, polisaccaridi, acidi grassi polinsaturi, polifenoli e vitamine 2,16. G. gracilis non fa eccezione, avendo un interessante valore nutrizionale. Freitas et al. (2021)4 hanno scoperto che G. gracilis coltivato aveva livelli più elevati di proteine e vitamina C e manteneva il livello di lipidi totali rispetto alle alghe selvatiche. Questo può rappresentare un vantaggio economico e ambientale, in quanto dal punto di vista nutrizionale la produzione è preferibile allo sfruttamento delle risorse selvatiche. Inoltre, i consumatori sono sempre più preoccupati per il tipo di cibo che mangiano, quindi è importante introdurre nuovi ingredienti per l'arricchimento alimentare e utilizzare nuove risorse per ottenere estratti che possano aggiungere valore a un prodotto e rivendicare una "clean label". Inoltre, il mercato attuale è molto competitivo e richiede lo sviluppo di nuovi prodotti e strategie innovative per differenziare i produttori dai loro concorrenti17.
L'arricchimento di prodotti a basso valore nutrizionale, come la pasta, con risorse marine, tra cui le alghe, è una strategia per introdurre questa risorsa come nuovo alimento e una strategia di differenziazione del mercato attraverso un prodotto con un valore nutrizionale distinto. D'altra parte, G. gracilis è una fonte di pigmenti rossi naturali come le ficobiliproteine18, con un alto potenziale per applicazioni nell'industria alimentare. Quest'alga ha mostrato un grande interesse in diverse aree e la sua applicazione può essere effettuata utilizzando l'alga intera, gli estratti e/o la biomassa rimanente. In questo lavoro, dimostriamo alcuni esempi di tali applicazioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Aga, Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale balance</td>
			<td>Sartorius, TE124S</td>
			<td>22105307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis subsp. spizizenii</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM 347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td>5811JH490481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Chamber</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Fluorescent Lamps</td>
			<td>OSRAM Lumilux Skywhite</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer McFarland</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>1898-66-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (DSM 5922)</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM5922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>AGA-Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (Whatman No.1)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA1001320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin-Ciocalteu</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>31360.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic Acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>149-91-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germanium (IV) Oxide, 99.999%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>1310-53-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaCaT cells &#8211; 300493</td>
			<td>CLS-Cell Lines Services, Germany&#160;</td>
			<td>300493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA, C-MAG HS7</td>
			<td>06.090564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>10124-49-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>TelStar, Portugal</td>
			<td>526013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listonella anguillarum</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>&#160;DSM 21597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7773.01.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>738-0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10022403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>&#160;Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA</td>
			<td>1611151E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth (MHB)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>90004-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, FD115</td>
			<td>12-04490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, BD115</td>
			<td>04-62615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1406-05-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter Inolab</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>15212099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippete tips</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>5412307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Bottles Media Storage</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>16157-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph, Laborota 4000</td>
			<td>80409287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor</td>
			<td>IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal</td>
			<td>07.524254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Normax Chem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMagic NX</td>
			<td>Konica Minolta, Japan</td>
			<td></td>
			<td>color data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA</td>
			<td>5A4T092004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-92-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>59-43-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>ICNA091010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>22091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water&#160;</td>
			<td>Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F5HA17360B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Buchi, Switzerland</td>
			<td>FIS05-402-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Merck</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

valorization of the red seaweed gracilaria gracilis through a biorefinery approach

L'interesse per le alghe marine come materia prima abbondante per ottenere ingredienti bioattivi preziosi e multitarget è in continua crescita. In questo lavoro, esploriamo il potenziale della Gracilaria gracilis, un'alga rossa commestibile coltivata in tutto il mondo per il suo interesse commerciale come fonte di agar e altri ingredienti per applicazioni cosmetiche, farmacologiche, alimentari e mangimistiche.
Le condizioni di crescita di G. gracilis sono state ottimizzate attraverso la propagazione vegetativa e la sporulazione, manipolando le condizioni fisico-chimiche per ottenere un ampio stock di biomassa. Le metodologie di estrazione verde con etanolo e acqua sono state eseguite sulla biomassa delle alghe. Il potenziale bioattivo degli estratti è stato valutato attraverso una serie di saggi in vitro riguardanti la loro citotossicità, le proprietà antiossidanti e antimicrobiche. Inoltre, la biomassa di alghe essiccate è stata incorporata nelle formulazioni della pasta per aumentare il valore nutrizionale degli alimenti. I pigmenti estratti da G. gracilis sono stati anche incorporati nello yogurt come colorante naturale ed è stata valutata la loro stabilità. Entrambi i prodotti sono stati sottoposti all'apprezzamento di un panel sensoriale semi-addestrato con l'obiettivo di ottenere la migliore formulazione finale prima di raggiungere il mercato.
I risultati confermano la versatilità di G. gracilis sia che venga applicato come biomassa intera, estratti e/o pigmenti. Attraverso l'implementazione di diversi protocolli ottimizzati, questo lavoro consente lo sviluppo di prodotti con il potenziale di profitto nei mercati alimentare, cosmetico e dell'acquacoltura, promuovendo la sostenibilità ambientale e un'economia circolare blu.
Inoltre, e in linea con un approccio di bioraffineria, la biomassa residua di alghe marine sarà utilizzata come biostimolante per la crescita delle piante o convertita in materiali di carbonio da utilizzare nella purificazione delle acque dei sistemi di acquacoltura interni del MARE-Politecnico di Leiria, in Portogallo.

&#160;Seaweeds can be regarded as an interesting natural raw material to be profited by the pharmaceutical, food, feed, and environmental sectors. They biosynthesize a panoply of molecules, many not found in terrestrial organisms, with relevant biological properties1,2. However, seaweed-optimized cultivation protocols need to be implemented to ensure a large biomass stock.
Cultivation methods must always consider the nature of the seaweed thalli and overall morphology. Gracilaria gracilis is a clonal taxon, meaning the attachment organ produces multiple vegetative axes. Propagation by fragmentation (vegetative reproduction) is thus achieved, as each of these axes is fully able to adopt an independent life from the main thallus3. Clonal taxa can be successfully integrated with simple and fast one-step cultivation methodologies, as large amounts of biomass are obtained by splitting the thallus into small fragments that quickly regenerate and grow into new, genetically identical individuals. Both haplontic and diplontic thalli may be used in this process. Although the genus exhibits a complex haplo-diplontic isomorphic triphasic life cycle, sporulation is rarely necessary except when genetic renewal of the stocks is required to achieve improved crops. In this case, both tetraspores (haplontic spores formed by meiosis) and carpospores (diplontic spores formed by mitosis) give rise to macroscopic thalli that can then be grown and propagated by vegetative reproduction4. Growth cycles are dictated by environmental conditions and the physiological state of the individuals, among other biological factors such as the emergence of epiphytes and the adhesion of other organisms. Therefore, optimizing growing conditions is crucial to ensure high productivity and produce good quality biomass5.
The extraction of bioactive compounds from seaweed, including G. gracilis, can be achieved through various methods6,7. The choice of the extraction method depends on the specific compounds of interest, the target application, and the characteristics of the seaweed. In this study, we focused on solvent extraction, which involves using green solvents, such as water or ethanol, to dissolve and extract bioactive compounds from the seaweed biomass. The extraction can be carried out through maceration in a versatile and effective way and can be used for a wide range of compounds. It is a simple and widely used method involving soaking biomass in a solvent for an extended period, typically at room or slightly elevated temperatures. The solvent is stirred to enhance the extraction process. After the desired extraction time, the solvent is separated from the solid material by filtration or centrifugation.
Water is a commonly used solvent in food applications due to its safety, availability, and compatibility with a wide range of food products. Water extraction is suitable for polar compounds such as polysaccharides, peptides, and certain phenolics. However, it may not effectively extract non-polar compounds. Ethanol is also a widely used solvent in food applications and can be effective for extracting a variety of bioactive molecules, including phenolic compounds, flavonoids, and certain pigments. Ethanol is generally recognized as safe for use in food and can be easily evaporated, leaving behind the extracted compounds. It is worth noting that the choice of extraction method should consider factors such as efficiency, selectivity, cost-effectiveness, and environmental impact. The optimization of extraction parameters, such as solvent concentration, extraction time, temperature, and pressure, is crucial to achieving optimal yields of bioactive compounds from G. gracilis or other seaweeds.
Seaweeds have been found to exhibit antimicrobial activity against a wide range of microorganisms, including bacteria, fungi, and viruses8. This activity is attributed to bioactive components, including phenolics, polysaccharides, peptides, and fatty acids. Several studies have demonstrated their efficacy against pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., and Pseudomonas aeruginosa, among others9. The antimicrobial activity of seaweeds is attributed to the presence of bioactive compounds that can interfere with microbial cell walls, membranes, enzymes, and signaling pathways10. These compounds may disrupt microbial growth, inhibit biofilm formation, and modulate immune responses.
Red seaweeds, also known as rhodophytes, are a group of algae that can exhibit antimicrobial activity against a variety of microorganisms. Within this group, G. gracilis contains various bioactive compounds that may contribute to its reported antimicrobial activity. While the specific molecules can vary, the common classes that have been reported in G. gracilis and may possess antimicrobial properties are polysaccharides, phenolics, terpenoids, and pigments11. However, it is important to note that the presence and amounts of these components can vary depending on factors such as the location of seaweed collection, seasonality, physiological condition of the thalli, and environmental conditions. Therefore, the specific class and concentration of antimicrobial compounds in G. gracilis may vary accordingly.
G. gracilis has also been found to hold antioxidant properties, containing various phenolic compounds, which have been shown to scavenge free radicals and reduce oxidative stress12. Antioxidants help to protect cells from damage caused by reactive oxygen species and have potential health benefits. Antioxidant capacity can be evaluated directly through different methods, including the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity and, indirectly, through the quantification of total polyphenolic content (TPC)13.
Even though an ingredient is reported to have a prominent bioactivity, its cytotoxicity assessment is indispensable in evaluating natural and synthetic substances to be used in contact with living cells or tissues. There are several methods for measuring cytotoxicity, each one with advantages and limitations. Overall, they offer a range of options to evaluate the harmful effects of many substances on cells and, at the same time, to investigate the mechanisms of cell damage and death14.
In this work, we use the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a colorimetric method introduced by Mosmann (1983)15. This method measures the reduction of tetrazolium salts to a purple formazan product by metabolically active cells. The higher the amount of formazan crystals, the higher the number of viable cells, thus providing an indirect measure of cytotoxicity14. Since in this work, G. gracilis water and ethanol extracts are intended to be incorporated into dermo-cosmetic formulations, the in vitro cytotoxicity evaluation is performed in a keratinocyte (HaCaT) cell line.
Concerning the food application, seaweeds are generally low in calories and nutritionally rich in dietary fibers, essential elements and amino acids, polysaccharides, polyunsaturated fatty acids, polyphenols, and vitamins2,16. G. gracilis is no exception, having an interesting nutritional value. Freitas et al. (2021)4 found that cultivated G. gracilis had higher levels of protein and vitamin C and maintained the level of total lipids compared to wild seaweed. This may represent an economic and environmental advantage, as nutritionally speaking, production is preferable to the exploitation of wild resources. In addition, consumers are increasingly concerned about the type of food they eat, so it is important to introduce new ingredients for food enrichment and use new resources to obtain extracts that can add value to a product and claim a &#34;clean label.&#34; Besides, the current market is very competitive, requiring the development of new products and innovative strategies to differentiate manufacturers from their competitors17.
The enrichment of products with poor nutritional value, such as pasta, with marine resources, including seaweed, is a strategy to introduce this resource as a new food and a market differentiation strategy through a product with distinct nutritional value. On the other hand, G. gracilis is a source of natural red pigments such as phycobiliproteins18, having high potential for applications in the food industry. This seaweed has shown high interest in several areas, and its application can be made using the whole seaweed, extracts and/or the remaining biomass. In this work, we demonstrate some examples of such applications.

Autore in primo piano: Esplorare i composti bioattivi delle alghe per innovazioni sostenibili nelle industrie 

Valorizzazione dell'alga rossa Gracilaria gracilis attraverso un approccio di bioraffineria

Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceutical drugs.One of the challenges of using seaweed in the development of new food products is to avoid using high amounts that could lead to unpleasant sensory properties in food. Using seaweed extracts is a way to get around this problem. With this protocol, we were able to develop pasta, wheat, add nutritional value by incorporating whole algae.Usually, the addition of these ingredients provides less common sensory properties. However, with the developed formulation, a consumer acceptance was still achieved.

Attività antimicrobica
Nell'interpretare i risultati ottenuti, occorre tenere presente che maggiore è la percentuale di inibizione, maggiore è l'efficacia dell'estratto nell'inibire la crescita di quello specifico ceppo e, di conseguenza, più l'estratto è interessante come antimicrobico. Attraverso questa metodologia, possiamo individuare rapidamente quali estratti hanno maggiore attività su determinati ce...

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In questo articolo descriviamo diversi protocolli che mirano ad una valorizzazione integrata della Gracilaria gracilis: la raccolta di specie selvatiche, la crescita interna e l'estrazione di ingredienti bioattivi. Vengono valutati gli effetti antiossidanti, antimicrobici e citotossici degli estratti, insieme alla valutazione nutrizionale e della stabilità degli alimenti arricchiti con biomassa e pigmenti di alghe intere.

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we ...

La nostra ricerca è focalizzata sulla prospezione di nuovi composti bioattivi dalle alghe che possono essere utili in diversi settori come l'industria alimentare, cosmetica e farmaceutica. C'è una crescente consapevolezza nella società sul potenziale degli organismi marini di fornire composti bioattivi. Questi composti possono essere utilizzati per produrre cosmetici funzionali sostenibili e più sicuri, per migliorare la qualità dei prodotti alimentari e fungere da fonte di nuove strutture chimiche per lo sviluppo di nuovi farmaci.Una delle sfide dell'utilizzo delle alghe marine nello sviluppo di nuovi prodotti alimentari è quella di evitare di utilizzarne quantità elevate che potrebbero portare a proprietà sensoriali sgradevoli negli alimenti. L'uso di estratti di alghe è un modo per aggirare questo problema. Con questo protocollo, siamo stati in grado di sviluppare pasta, grano, aggiungere valore nutrizionale incorporando alghe intere.Di solito, l'aggiunta di questi ingredienti fornisce proprietà sensoriali meno comuni. Tuttavia, con la formulazione sviluppata, è stata comunque raggiunta un'accettazione da parte dei consumatori.

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Research

JoVE Journal

Biology

Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we explore the potential of Gracilaria gracilis, an edible red seaweed cultivated worldwide for its commercial interest as a source of agar and other ingredients for cosmetic, pharmacological, food, and feed applications.
G. gracilis growth conditions were optimized through vegetative propagation and sporulation while manipulating the physicochemical conditions to achieve a large biomass stock. Green extraction methodologies with ethanol and water were performed over the seaweed biomass. The bioactive potential of extracts was assessed through a set of in vitro assays concerning their cytotoxicity, antioxidant, and antimicrobial properties. Additionally, dried seaweed biomass was incorporated into pasta formulations to increase food&#39;s nutritional value. Pigments extracted from G. gracilis have also been incorporated into yogurt as a natural colorant, and their stability was evaluated. Both products were submitted to the appreciation of a semi-trained sensorial panel aiming to achieve the best final formulation before reaching the market.
Results support the versatility of G. gracilis whether it is applied as a whole biomass, extracts and/or pigments. Through implementing several optimized protocols, this work allows the development of products with the potential to profit the food, cosmetic, and aquaculture markets, promoting environmental sustainability and a blue circular economy.
Moreover, and in line with a biorefinery approach, the residual seaweed biomass will be used as biostimulant for plant growth or converted to carbon materials to be used in water purification of the in-house aquaculture systems of MARE-Polytechnic of Leiria, Portugal.

Here, we describe several protocols aiming at an integrated valorization of Gracilaria gracilis: wild species harvesting, in-house growth, and extraction of bioactive ingredients. The extracts&#39; antioxidant, antimicrobial, and cytotoxic effects are evaluated, along with the nutritional and stability assessment of food enriched with whole seaweed biomass and pigments.

Ricerca

Biologia

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis  

To begin, grow Gracilaria gracilis in 250 milliliters of flat bottom flasks in a climatic room. Once the biomass has been scaled up, dried, and ground, weigh the resulting dried biomass. Dissolve it in 100 milliliters of solvent and mix by stirring in a vessel protected from light for 30 minutes.Perform extractions with ethanol and water separately at room temperature. Filter the liquid extracts through filter paper to separate them from the remaining biomass. Centrifuge the extracts at 8, 000 G for 10 minutes, at room temperature.Freeze dry the aqueous extracts and use a rotary evaporator at 40 degrees Celsius to evaporate the ethanol extracts.

Estrazione dei principi bioattivi dalla Gracilaria gracilis

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts  

To begin, take the aqueous and ethanol extracts obtained from the dried Gracilaria gracilis. In a 96 well microplate, dispense two microliters of each sample and 198 microliters of DPPH dissolved in absolute ethanol. Then, using a microplate spectrophotometer, measure the absorbance at 517 nanometers.Take the human keratinocytes grown in 96 well plates overnight. Add two microliters of the DMSO dissolved extracts to 198 microliters of the medium in microplate wells. Remove the culture medium.Add 100 microliters of MTT to the cells and incubate in the dark for 30 minutes. To solubilize the intracellular formazan crystals, add 100 microliters of DMSO. Using a microplate reader, measure the absorbance at 570 nanometers.The DPPH test demonstrated that the temperature of 40 degrees Celsius showed higher inhibition values of oxidant activity compared to extracts obtained at room temperature or 70 degrees Celsius. No cytotoxic effects were observed on human keratinocytes, suggesting that at the maximum assay concentration, both aqueous and ethanol extracts are safe for cutaneous use.

Valutazione degli effetti antiossidanti e citotossici degli estratti di Gracilaria gracilis

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation  

To begin, combine predefined portions of rice flour, gracilaria gracilis, and chlorella vulgaris in the equipment, and add approximately 30%water to the mixture. After a few minutes of mixing, followed by extruding the pasta, using the equipment, cut it manually. To produce chifferi, dry the pasta at 68 degrees Celsius for 42 minutes, followed by an additional five hours and 30 minutes at 76 degrees Celsius, simulating an industrial process.Finally, vacuum seal the samples and store them in a dark place at room temperature. Take one gram sample in a glass crucible with a filter bottom and position it in the fiber analyzer. Add 150 milliliters of preheated 1.25%sulfuric acid, and two milliliters of anti-foaming agent to the column of each crucible.Remove the solvent and rinse the crucible three times with deionized water to prepare the sample for the basic hydrolysis. After washing the crucibles three times with 150 milliliters of acetone, carefully transfer those to an oven set at 150 degrees Celsius for one hour. Record the final weight.Transfer the crucibles to a muffle furnace, set at 500 degrees Celsius for three hours, and then record the final weight. To determine the fatty acids profile, add two milliliters of 2%sulfuric acid solution in methanol to a 50 milligram sample. Heat the mixture at 80 degrees Celsius for two hours.Then, cool the mixture to room temperature and add one milliliter of ultrapure water and two milliliters of N-heptane to each sample. After vortexing the mixture for one minute, centrifuge it for five minutes. Later, recover the upper N-heptane phase containing the fatty acid methyl esters and transfer it to gas chromatography vials.Analyze the samples in a gas chromatograph equipped with a TR-FAME capillary column, an auto sampler, and a flame ionization detector. Determine the fatty acid profile by comparing the resulting retention times with a standard. Incubate porcelain crucibles for three hours at 105 degrees Celsius.Allow them to cool in a desiccator, and then record their weights. After incubating 10 grams of the sample, as demonstrated previously, calculate its moisture content using the displayed equation. Then, transfer the crucibles with the dried samples to an incinerator heated to 525 degrees Celsius for four hours.After cooling the samples, record their weight. To assess consumer acceptance, use chifferi pasta samples cooked in distilled water for eight minutes. Conduct sensory tests in individual sensory booths located in a sensory analysis laboratory.Evaluate the visual appearance, color, texture, odor, sea taste, overall taste, overall evaluation, and purchase intent of the samples. The pasta received ratings of five and six on a hedonic scale of one to nine for sea taste and visual appearance, respectively. The pasta had a purchase intention score of five and an overall appreciation score of six.

Produzione di pasta con Gracilaria gracilis, valutazione nutrizionale e valutazione sensoriale

Incorporation of Seaweed Extract in Yogurt and Color Stability Evaluation 

To begin, add 50 milliliters of sodium phosphate buffer to one gram of Gracilaria gracilis. After homogenizing the mixture, use a mortar and pestle to macerate the sample for 10 minutes. Transfer the solution to a tube and centrifuge it for 20 minutes at 12298g.After combining the supernatant, slowly add 65%ammonium sulfate, then pellet the precipitate by centrifugation and dissolve it in distilled water. Perform dialysis of the extract using a tubing membrane against water for 24 hours, followed by freeze drying. To incorporate the extract, mix it in yogurt at a concentration of 0.21%Store the samples in individual glass flasks at 4 degrees Celsius until analysis.To check the color stability of the extract in yogurt, calibrate the colorimeter using a white ceramic plate. Fill a cell with approximately 28 grams of the sample and analyze its color. The color stability of the yogurts with pigment was evaluated for 12 days at 4 degrees celsius.The incorporation of the extracts in yogurts showed good color attention with a color difference of 7.01 plus or minus 2.36 after 12 days of storage.