Name: 저자 스포트라이트: 산업의 지속 가능한 혁신을 위한 해조류의 생체 활성 화합물 탐구
Uploaded: 2023-11-21T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

이 작업은 MARE-해양 및 환경 과학 센터(UIDP/04292/2020 및 UIDB/04292/2020) 및 Associate Laboratory ARNET(LA/P/0069/2020)에 부여된 전략 프로젝트를 통해 포르투갈 과학 기술 재단(FCT)의 지원을 받았습니다. FCT는 또한 Marta V. Freitas(UI/BD/150957/2021)와 Tatiana Pereira(2021. 07791. BD)입니다. 이 작업은 또한 COMPETE 2020 - 경쟁력 및 국제화 운영 프로그램을 통해 포르투갈 2020 프로그램에 따라 ERDF(유럽 지역 개발 기금)가 공동 자금을 지원하는 프로젝트 HP4A - HEALTHY PASTA FOR ALL(공동 프로모션 번호 039952)의 재정적 지원을 받았습니다.

1. 바이오매스 수확 및 준비
<ol><li>썰물 때 G. gracilis 의 표본을 수확하고 건조, 빛 및 공기 노출을 피하기 위해 어둡고 차가운 상자에 담아 실험실로 신속하게 운반합니다.</li>
	<li>실험실에서 흐르는 바닷물로 각 thallus를 씻고 철저히 청소하여 표면에서 파편, 괴사 부위, 착생식물 및 기타 유기체를 제거합니다.</li>
	<li>일광 시원한 백색 및 형광등 및 광주기가 제공하는 낮은 조도, 일광 실내...

Gracilaria gracilis의 활용: 지속 가능한 혁신을 위한 생체 활성 잠재력

액체 배지에서의 항균 활성 시험은 액체 배지에 현탁된 미생물에 대한 항균 물질의 효과를 평가하는 데 사용되며 일반적으로 성장을 억제하거나 미생물을 죽이는 물질의 능력을 결정하기 위해 수행됩니다35,36,37,38. 이들은 항균제에 대한 미생물의 민감도를 평가하는데 사용되며, 시험관 또는 미세적?...

해조류는 제약, 식품, 사료 및 환경 부문에서 이익을 얻을 수 있는 흥미로운 천연 원료로 간주될 수 있습니다. 그들은 관련 생물학적 특성을 가진 육상 유기체에서 발견되지 않는 분자의 파노라마를 생합성합니다 1,2. 그러나 대규모 바이오매스 재고를 확보하기 위해서는 해조류에 최적화된 재배 프로토콜을 구현해야 합니다.
재배 방법은 항상 해조류 탈리의 특성과 전반적인 형태를 고려해야 합니다. Gracilaria gracilis 는 클론 분류군으로, 부착 기관이 여러 식물 축을 생산한다는 것을 의미합니다. 따라서 단편화(식물 번식)에 의한 번식이 이루어지는데, 이는 이들 축이 각각 주 시상(primary thallus)3으로부터 독립된 생명을 완전히 채택할 수 있기 때문이다. 클론 분류군은 간단하고 빠른 원스텝 재배 방법론과 성공적으로 통합될 수 있는데, 이는 탈루스를 빠르게 재생하고 유전적으로 동일한 새로운 개체로 성장시키는 작은 조각으로 분할하여 많은 양의 바이오매스를 얻을 수 있기 때문입니다. 이 과정에서 haplontic 및 diplontic thalli가 모두 사용될 수 있습니다. 속은 복잡한 haplo-diplontic isomorphic triphasic 수명주기를 나타내지만, 포자 형성은 개선 된 작물을 달성하기 위해 주식의 유전 적 재생이 필요한 경우를 제외하고는 거의 필요하지 않습니다. 이 경우, tetraspores(감수분열에 의해 형성된 haplontic spores)와 carpospores(유사분열에 의해 형성된 diplontic spores)는 모두 식물 번식에 의해 성장하고 번식될 수 있는 거시적 탈리(thalli)를 발생시킨다4. 성장주기는 환경 조건과 개인의 생리적 상태, 착생 식물의 출현 및 다른 유기체의 접착과 같은 다른 생물학적 요인에 의해 결정됩니다. 따라서 재배 조건을 최적화하는 것은 높은 생산성을 보장하고 양질의 바이오매스를 생산하는 데 매우 중요하다5.
G. gracilis를 포함한 해조류로부터 생리활성 화합물의 추출은 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다 6,7. 추출 방법의 선택은 특정 관심 화합물, 대상 응용 분야 및 해조류의 특성에 따라 다릅니다. 이 연구에서 우리는 물이나 에탄올과 같은 녹색 용매를 사용하여 해조류 바이오매스에서 생리 활성 화합물을 용해하고 추출하는 용매 추출에 중점을 두었습니다. 추출은 다양하고 효과적인 방법으로 침용을 통해 수행 할 수 있으며 광범위한 화합물에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 실온 또는 약간 높은 온도에서 장기간 용매에 바이오매스를 담그는 간단하고 널리 사용되는 방법입니다. 용매는 추출 공정을 향상시키기 위해 교반됩니다. 원하는 추출 시간이 지나면 용매를 여과 또는 원심분리를 통해 고체 물질에서 분리합니다.
물은 안전성, 가용성 및 다양한 식품과의 호환성으로 인해 식품 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 용매입니다. 물 추출은 다당류, 펩타이드 및 특정 페놀과 같은 극성 화합물에 적합합니다. 그러나 비극성 화합물을 효과적으로 추출하지 못할 수 있습니다. 에탄올은 또한 식품 응용 분야에서 널리 사용되는 용매이며 페놀 화합물, 플라보노이드 및 특정 안료를 포함한 다양한 생체 활성 분자를 추출하는 데 효과적일 수 있습니다. 에탄올은 일반적으로 식품에 사용하기에 안전한 것으로 알려져 있으며 추출된 화합물을 남기고 쉽게 증발할 수 있습니다. 추출 방법의 선택은 효율성, 선택성, 비용 효율성 및 환경 영향과 같은 요소를 고려해야 한다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 용매 농도, 추출 시간, 온도 및 압력과 같은 추출 파라미터의 최적화는 G. gracilis 또는 기타 해조류에서 생리 활성 화합물의 최적 수율을 달성하는 데 매우 중요합니다.
해조류는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스를 포함한 광범위한 미생물에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다8. 이 활성은 페놀, 다당류, 펩타이드 및 지방산을 포함한 생체 활성 성분에 기인합니다. 여러 연구에서 대장균, 황색포도상구균, 살 모넬라 균, 녹농균과 같은 병원균에 대한 효능이 입증되었습니다9. 해조류의 항균 활성은 미생물 세포벽, 세포막, 효소 및 신호 전달 경로를 방해할 수 있는 생리 활성 화합물의 존재에 기인한다10. 이러한 화합물은 미생물 성장을 방해하고 생물막 형성을 억제하며 면역 반응을 조절할 수 있습니다.
rhodophytes라고도 알려진 붉은 해조류는 다양한 미생물에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있는 조류 그룹입니다. 이 그룹 내에서 G. gracilis 는 보고된 항균 활성에 기여할 수 있는 다양한 생체 활성 화합물을 함유하고 있습니다. 특정 분자는 다양할 수 있지만, G. gracilis 에서 보고되고 항균 특성을 가질 수 있는 일반적인 부류는 다당류, 페놀, 테르페노이드 및 색소이다11. 그러나 이러한 성분의 존재와 양은 해조류 채취 위치, 계절성, 탈리의 생리적 상태, 환경 조건과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, G. gracilis 에서 항균 화합물의 특정 등급 및 농도는 그에 따라 달라질 수 있습니다.
G. gracilis 는 또한 자유 라디칼을 제거하고 산화 스트레스를 감소시키는 것으로 밝혀진 다양한 페놀 화합물을 함유한 항산화 특성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다12.항산화제는 활성 산소로 인한 손상으로부터 세포를 보호하는 데 도움이 되며 잠재적인 건강상의 이점이 있습니다. 항산화 능력은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 활성산소 제거 활성을 포함한 다양한 방법을 통해 직접 평가할 수 있으며, 간접적으로 총 폴리페놀 함량(TPC)의 정량화를 통해 평가할 수 있습니다13.
성분이 두드러진 생체 활성을 가지고 있는 것으로 보고되었지만, 세포 독성 평가는 살아있는 세포 또는 조직과 접촉하는 데 사용되는 천연 및 합성 물질을 평가하는 데 필수적입니다. 세포 독성을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 각 방법에는 장점과 한계가 있습니다. 전반적으로, 그들은 세포에 대한 많은 물질의 유해한 영향을 평가하고 동시에 세포 손상 및 사멸의 메커니즘을 조사하기 위한 다양한 옵션을 제공합니다14.
이 연구에서는 Mosmann(1983)15에 의해 도입된 비색 방법인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 사용합니다. 이 방법은 대사 활성 세포에 의한 테트라졸륨 염의 자주색 포르마잔 생성물 환원을 측정합니다. 포르마잔 결정의 양이 많을수록 생존 가능한 세포의 수가 많아 세포 독성의 간접적인 측정을 제공합니다14. 이 연구에서 G. gracilis 물과 에탄올 추출물은 dermo-cosmetic 제형에 통합되도록 의도되었기 때문에 in vitro 세포 독성 평가는 각질 세포(HaCaT) 세포주에서 수행됩니다.
식품 적용과 관련하여 해조류는 일반적으로 칼로리가 낮고 식이 섬유, 필수 요소 및 아미노산, 다당류, 고도 불포화 지방산, 폴리페놀 및 비타민 2,16이 영양적으로 풍부합니다. G. gracilis도 예외는 아니며 흥미로운 영양가를 가지고 있습니다. Freitas et al. (2021)4에 따르면 재배된 G. gracilis는 야생 해조류에 비해 단백질과 비타민 C 수치가 더 높고 총 지질 수준을 유지하는 것으로 나타났습니다. 이것은 영양학적으로 말하자면 야생 자원의 착취보다 생산이 바람직하기 때문에 경제적, 환경적 이점을 나타낼 수 있습니다. 또한 소비자들은 자신이 먹는 식품의 종류에 대해 점점 더 많은 관심을 가지고 있으므로 식품 농축을 위한 새로운 성분을 도입하고 새로운 자원을 사용하여 제품에 가치를 더하고 "클린 라벨"을 주장할 수 있는 추출물을 얻는 것이 중요합니다. 게다가, 현재 시장은 경쟁이 매우 치열하여 제조업체를 경쟁업체와 차별화하기 위해 신제품 개발과 혁신적인 전략이 필요합니다17.
파스타와 같이 영양가가 낮은 제품에 해조류 등 수산자원을 농축하는 것은 영양가가 뚜렷한 제품을 통해 이를 새로운 식품으로 소개하는 전략이자 시장 차별화 전략이다. 한편, G. gracilis 는 phycobiliproteins18과 같은 천연 적색 색소의 공급원으로, 식품 산업에 응용할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 해조류는 여러 분야에서 높은 관심을 보였으며 전체 해조류, 추출물 및/또는 나머지 바이오매스를 사용하여 적용할 수 있습니다. 이 작업에서는 이러한 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여 줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Aga, Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale balance</td>
			<td>Sartorius, TE124S</td>
			<td>22105307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis subsp. spizizenii</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM 347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td>5811JH490481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Chamber</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Fluorescent Lamps</td>
			<td>OSRAM Lumilux Skywhite</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer McFarland</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>1898-66-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (DSM 5922)</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM5922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>AGA-Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (Whatman No.1)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA1001320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin-Ciocalteu</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>31360.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic Acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>149-91-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germanium (IV) Oxide, 99.999%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>1310-53-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaCaT cells &#8211; 300493</td>
			<td>CLS-Cell Lines Services, Germany&#160;</td>
			<td>300493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA, C-MAG HS7</td>
			<td>06.090564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>10124-49-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>TelStar, Portugal</td>
			<td>526013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listonella anguillarum</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>&#160;DSM 21597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7773.01.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>738-0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10022403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>&#160;Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA</td>
			<td>1611151E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth (MHB)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>90004-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, FD115</td>
			<td>12-04490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, BD115</td>
			<td>04-62615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1406-05-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter Inolab</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>15212099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippete tips</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>5412307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Bottles Media Storage</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>16157-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph, Laborota 4000</td>
			<td>80409287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor</td>
			<td>IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal</td>
			<td>07.524254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Normax Chem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMagic NX</td>
			<td>Konica Minolta, Japan</td>
			<td></td>
			<td>color data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA</td>
			<td>5A4T092004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-92-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>59-43-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>ICNA091010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>22091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water&#160;</td>
			<td>Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F5HA17360B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Buchi, Switzerland</td>
			<td>FIS05-402-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Merck</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

valorization of the red seaweed gracilaria gracilis through a biorefinery approach

가치 있는 다중 표적 생리활성 성분을 얻기 위한 풍부한 공급 원료로서의 해조류에 대한 관심은 지속적으로 증가하고 있습니다. 이 연구에서 우리는 화장품, 약리학, 식품 및 사료 응용 분야를 위한 한천 및 기타 성분의 공급원으로서 상업적 이익을 위해 전 세계적으로 재배되는 식용 붉은 해초인 Gracilaria gracilis의 잠재력을 탐구합니다.
G. gracilis 성장 조건은 식물 번식 및 포자 형성을 통해 최적화되었으며 물리 화학적 조건을 조작하여 대규모 바이오 매스 스톡을 달성했습니다. 에탄올과 물을 사용한 녹색 추출 방법은 해조류 바이오매스에서 수행되었습니다. 추출물의 생체 활성 잠재력은 세포 독성, 항산화 및 항균 특성에 관한 일련의 시험관 내 분석을 통해 평가되었습니다. 또한 말린 해조류 바이오매스를 파스타 제형에 통합하여 식품의 영양가를 높였습니다. G. gracilis 에서 추출한 색소도 천연 착색제로 요구르트에 배합되어 안정성을 평가했습니다. 두 제품 모두 시장에 출시되기 전에 최상의 최종 제형을 달성하는 것을 목표로 하는 반 훈련된 감각 패널의 평가를 받았습니다.
결과는 G. gracilis가 전체 바이오매스, 추출물 및/또는 안료로 적용되는지 여부에 관계없이 G. gracilis 의 다양성을 뒷받침합니다. 몇 가지 최적화된 프로토콜을 구현함으로써 이 작업을 통해 식품, 화장품 및 양식 시장에 수익을 창출할 수 있는 잠재력을 가진 제품을 개발하고 환경 지속 가능성과 청색 순환 경제를 촉진할 수 있습니다.
또한, 바이오리파이너리 접근법에 따라 잔류 해조류 바이오매스는 식물 성장을 위한 생물 자극제로 사용되거나 포르투갈 레이리아의 MARE-Polytechnic 사내 양식 시스템의 수질 정화에 사용되는 탄소 물질로 전환될 것입니다.

&#160;Seaweeds can be regarded as an interesting natural raw material to be profited by the pharmaceutical, food, feed, and environmental sectors. They biosynthesize a panoply of molecules, many not found in terrestrial organisms, with relevant biological properties1,2. However, seaweed-optimized cultivation protocols need to be implemented to ensure a large biomass stock.
Cultivation methods must always consider the nature of the seaweed thalli and overall morphology. Gracilaria gracilis is a clonal taxon, meaning the attachment organ produces multiple vegetative axes. Propagation by fragmentation (vegetative reproduction) is thus achieved, as each of these axes is fully able to adopt an independent life from the main thallus3. Clonal taxa can be successfully integrated with simple and fast one-step cultivation methodologies, as large amounts of biomass are obtained by splitting the thallus into small fragments that quickly regenerate and grow into new, genetically identical individuals. Both haplontic and diplontic thalli may be used in this process. Although the genus exhibits a complex haplo-diplontic isomorphic triphasic life cycle, sporulation is rarely necessary except when genetic renewal of the stocks is required to achieve improved crops. In this case, both tetraspores (haplontic spores formed by meiosis) and carpospores (diplontic spores formed by mitosis) give rise to macroscopic thalli that can then be grown and propagated by vegetative reproduction4. Growth cycles are dictated by environmental conditions and the physiological state of the individuals, among other biological factors such as the emergence of epiphytes and the adhesion of other organisms. Therefore, optimizing growing conditions is crucial to ensure high productivity and produce good quality biomass5.
The extraction of bioactive compounds from seaweed, including G. gracilis, can be achieved through various methods6,7. The choice of the extraction method depends on the specific compounds of interest, the target application, and the characteristics of the seaweed. In this study, we focused on solvent extraction, which involves using green solvents, such as water or ethanol, to dissolve and extract bioactive compounds from the seaweed biomass. The extraction can be carried out through maceration in a versatile and effective way and can be used for a wide range of compounds. It is a simple and widely used method involving soaking biomass in a solvent for an extended period, typically at room or slightly elevated temperatures. The solvent is stirred to enhance the extraction process. After the desired extraction time, the solvent is separated from the solid material by filtration or centrifugation.
Water is a commonly used solvent in food applications due to its safety, availability, and compatibility with a wide range of food products. Water extraction is suitable for polar compounds such as polysaccharides, peptides, and certain phenolics. However, it may not effectively extract non-polar compounds. Ethanol is also a widely used solvent in food applications and can be effective for extracting a variety of bioactive molecules, including phenolic compounds, flavonoids, and certain pigments. Ethanol is generally recognized as safe for use in food and can be easily evaporated, leaving behind the extracted compounds. It is worth noting that the choice of extraction method should consider factors such as efficiency, selectivity, cost-effectiveness, and environmental impact. The optimization of extraction parameters, such as solvent concentration, extraction time, temperature, and pressure, is crucial to achieving optimal yields of bioactive compounds from G. gracilis or other seaweeds.
Seaweeds have been found to exhibit antimicrobial activity against a wide range of microorganisms, including bacteria, fungi, and viruses8. This activity is attributed to bioactive components, including phenolics, polysaccharides, peptides, and fatty acids. Several studies have demonstrated their efficacy against pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., and Pseudomonas aeruginosa, among others9. The antimicrobial activity of seaweeds is attributed to the presence of bioactive compounds that can interfere with microbial cell walls, membranes, enzymes, and signaling pathways10. These compounds may disrupt microbial growth, inhibit biofilm formation, and modulate immune responses.
Red seaweeds, also known as rhodophytes, are a group of algae that can exhibit antimicrobial activity against a variety of microorganisms. Within this group, G. gracilis contains various bioactive compounds that may contribute to its reported antimicrobial activity. While the specific molecules can vary, the common classes that have been reported in G. gracilis and may possess antimicrobial properties are polysaccharides, phenolics, terpenoids, and pigments11. However, it is important to note that the presence and amounts of these components can vary depending on factors such as the location of seaweed collection, seasonality, physiological condition of the thalli, and environmental conditions. Therefore, the specific class and concentration of antimicrobial compounds in G. gracilis may vary accordingly.
G. gracilis has also been found to hold antioxidant properties, containing various phenolic compounds, which have been shown to scavenge free radicals and reduce oxidative stress12. Antioxidants help to protect cells from damage caused by reactive oxygen species and have potential health benefits. Antioxidant capacity can be evaluated directly through different methods, including the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity and, indirectly, through the quantification of total polyphenolic content (TPC)13.
Even though an ingredient is reported to have a prominent bioactivity, its cytotoxicity assessment is indispensable in evaluating natural and synthetic substances to be used in contact with living cells or tissues. There are several methods for measuring cytotoxicity, each one with advantages and limitations. Overall, they offer a range of options to evaluate the harmful effects of many substances on cells and, at the same time, to investigate the mechanisms of cell damage and death14.
In this work, we use the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a colorimetric method introduced by Mosmann (1983)15. This method measures the reduction of tetrazolium salts to a purple formazan product by metabolically active cells. The higher the amount of formazan crystals, the higher the number of viable cells, thus providing an indirect measure of cytotoxicity14. Since in this work, G. gracilis water and ethanol extracts are intended to be incorporated into dermo-cosmetic formulations, the in vitro cytotoxicity evaluation is performed in a keratinocyte (HaCaT) cell line.
Concerning the food application, seaweeds are generally low in calories and nutritionally rich in dietary fibers, essential elements and amino acids, polysaccharides, polyunsaturated fatty acids, polyphenols, and vitamins2,16. G. gracilis is no exception, having an interesting nutritional value. Freitas et al. (2021)4 found that cultivated G. gracilis had higher levels of protein and vitamin C and maintained the level of total lipids compared to wild seaweed. This may represent an economic and environmental advantage, as nutritionally speaking, production is preferable to the exploitation of wild resources. In addition, consumers are increasingly concerned about the type of food they eat, so it is important to introduce new ingredients for food enrichment and use new resources to obtain extracts that can add value to a product and claim a &#34;clean label.&#34; Besides, the current market is very competitive, requiring the development of new products and innovative strategies to differentiate manufacturers from their competitors17.
The enrichment of products with poor nutritional value, such as pasta, with marine resources, including seaweed, is a strategy to introduce this resource as a new food and a market differentiation strategy through a product with distinct nutritional value. On the other hand, G. gracilis is a source of natural red pigments such as phycobiliproteins18, having high potential for applications in the food industry. This seaweed has shown high interest in several areas, and its application can be made using the whole seaweed, extracts and/or the remaining biomass. In this work, we demonstrate some examples of such applications.

저자 스포트라이트: 산업의 지속 가능한 혁신을 위한 해조류의 생체 활성 화합물 탐구 

Biorefinery 접근 방식을 통한 Red Seaweed Gracilaria gracilis 의 가치 평가

Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceutical drugs.One of the challenges of using seaweed in the development of new food products is to avoid using high amounts that could lead to unpleasant sensory properties in food. Using seaweed extracts is a way to get around this problem. With this protocol, we were able to develop pasta, wheat, add nutritional value by incorporating whole algae.Usually, the addition of these ingredients provides less common sensory properties. However, with the developed formulation, a consumer acceptance was still achieved.

항균 작용
얻은 결과를 해석 할 때, 억제 비율이 높을수록 특정 균주의 성장을 억제하는 추출물의 효능이 커지고 결과적으로 추출물이 항균제로서 더 흥미로워진다는 점을 명심해야합니다. 이 방법론을 통해 특정 박테리아 균주에서 어떤 추출물이 더 큰 활성을 보이는지 신속하게 식별할 수 있으며, 향후 사용 측?...

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여기에서는 Gracilaria gracilis의 통합 가치 평가를 목표로 하는 몇 가지 프로토콜에 대해 설명합니다: 야생 종 수확, 자체 성장 및 생체 활성 성분 추출. 추출물의 항산화, 항균 및 세포 독성 효과와 함께 전체 해조류 바이오매스 및 색소가 풍부한 식품의 영양 및 안정성 평가가 평가됩니다.

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we ...

우리의 연구는 식품, 화장품 및 제약 산업과 같은 다양한 분야에서 유용할 수 있는 해조류의 새로운 생리 활성 화합물 탐사에 중점을 두고 있습니다. 생리 활성 화합물을 전달하는 해양 생물의 잠재력에 대한 사회적 인식이 높아지고 있습니다. 이러한 화합물은 지속 가능하고 안전한 기능성 화장품을 생산하여 식품의 품질을 개선하고 신약 개발을 위한 새로운 화학 구조의 원천 역할을 하는 데 사용할 수 있습니다.새로운 식품 개발에 해조류를 사용할 때의 어려움 중 하나는 식품의 불쾌한 감각적 특성으로 이어질 수 있는 다량의 사용을 피하는 것입니다. 해조류 추출물을 사용하는 것이 이 문제를 해결하는 방법입니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 파스타, 밀을 개발할 수 있었고 전체 조류를 통합하여 영양가를 더할 수 있었습니다.일반적으로 이러한 성분을 첨가하면 덜 일반적인 감각 특성을 제공합니다. 그러나 개발된 제형으로 여전히 소비자의 수용을 받았습니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we explore the potential of Gracilaria gracilis, an edible red seaweed cultivated worldwide for its commercial interest as a source of agar and other ingredients for cosmetic, pharmacological, food, and feed applications.
G. gracilis growth conditions were optimized through vegetative propagation and sporulation while manipulating the physicochemical conditions to achieve a large biomass stock. Green extraction methodologies with ethanol and water were performed over the seaweed biomass. The bioactive potential of extracts was assessed through a set of in vitro assays concerning their cytotoxicity, antioxidant, and antimicrobial properties. Additionally, dried seaweed biomass was incorporated into pasta formulations to increase food&#39;s nutritional value. Pigments extracted from G. gracilis have also been incorporated into yogurt as a natural colorant, and their stability was evaluated. Both products were submitted to the appreciation of a semi-trained sensorial panel aiming to achieve the best final formulation before reaching the market.
Results support the versatility of G. gracilis whether it is applied as a whole biomass, extracts and/or pigments. Through implementing several optimized protocols, this work allows the development of products with the potential to profit the food, cosmetic, and aquaculture markets, promoting environmental sustainability and a blue circular economy.
Moreover, and in line with a biorefinery approach, the residual seaweed biomass will be used as biostimulant for plant growth or converted to carbon materials to be used in water purification of the in-house aquaculture systems of MARE-Polytechnic of Leiria, Portugal.

Here, we describe several protocols aiming at an integrated valorization of Gracilaria gracilis: wild species harvesting, in-house growth, and extraction of bioactive ingredients. The extracts&#39; antioxidant, antimicrobial, and cytotoxic effects are evaluated, along with the nutritional and stability assessment of food enriched with whole seaweed biomass and pigments.

연구

생물학

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis  

To begin, grow Gracilaria gracilis in 250 milliliters of flat bottom flasks in a climatic room. Once the biomass has been scaled up, dried, and ground, weigh the resulting dried biomass. Dissolve it in 100 milliliters of solvent and mix by stirring in a vessel protected from light for 30 minutes.Perform extractions with ethanol and water separately at room temperature. Filter the liquid extracts through filter paper to separate them from the remaining biomass. Centrifuge the extracts at 8, 000 G for 10 minutes, at room temperature.Freeze dry the aqueous extracts and use a rotary evaporator at 40 degrees Celsius to evaporate the ethanol extracts.

Gracilaria gracilis에서 생리 활성 성분 추출

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts  

To begin, take the aqueous and ethanol extracts obtained from the dried Gracilaria gracilis. In a 96 well microplate, dispense two microliters of each sample and 198 microliters of DPPH dissolved in absolute ethanol. Then, using a microplate spectrophotometer, measure the absorbance at 517 nanometers.Take the human keratinocytes grown in 96 well plates overnight. Add two microliters of the DMSO dissolved extracts to 198 microliters of the medium in microplate wells. Remove the culture medium.Add 100 microliters of MTT to the cells and incubate in the dark for 30 minutes. To solubilize the intracellular formazan crystals, add 100 microliters of DMSO. Using a microplate reader, measure the absorbance at 570 nanometers.The DPPH test demonstrated that the temperature of 40 degrees Celsius showed higher inhibition values of oxidant activity compared to extracts obtained at room temperature or 70 degrees Celsius. No cytotoxic effects were observed on human keratinocytes, suggesting that at the maximum assay concentration, both aqueous and ethanol extracts are safe for cutaneous use.

Gracilaria gracilis 추출물의 항산화 및 세포독성 효과 평가

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation  

To begin, combine predefined portions of rice flour, gracilaria gracilis, and chlorella vulgaris in the equipment, and add approximately 30%water to the mixture. After a few minutes of mixing, followed by extruding the pasta, using the equipment, cut it manually. To produce chifferi, dry the pasta at 68 degrees Celsius for 42 minutes, followed by an additional five hours and 30 minutes at 76 degrees Celsius, simulating an industrial process.Finally, vacuum seal the samples and store them in a dark place at room temperature. Take one gram sample in a glass crucible with a filter bottom and position it in the fiber analyzer. Add 150 milliliters of preheated 1.25%sulfuric acid, and two milliliters of anti-foaming agent to the column of each crucible.Remove the solvent and rinse the crucible three times with deionized water to prepare the sample for the basic hydrolysis. After washing the crucibles three times with 150 milliliters of acetone, carefully transfer those to an oven set at 150 degrees Celsius for one hour. Record the final weight.Transfer the crucibles to a muffle furnace, set at 500 degrees Celsius for three hours, and then record the final weight. To determine the fatty acids profile, add two milliliters of 2%sulfuric acid solution in methanol to a 50 milligram sample. Heat the mixture at 80 degrees Celsius for two hours.Then, cool the mixture to room temperature and add one milliliter of ultrapure water and two milliliters of N-heptane to each sample. After vortexing the mixture for one minute, centrifuge it for five minutes. Later, recover the upper N-heptane phase containing the fatty acid methyl esters and transfer it to gas chromatography vials.Analyze the samples in a gas chromatograph equipped with a TR-FAME capillary column, an auto sampler, and a flame ionization detector. Determine the fatty acid profile by comparing the resulting retention times with a standard. Incubate porcelain crucibles for three hours at 105 degrees Celsius.Allow them to cool in a desiccator, and then record their weights. After incubating 10 grams of the sample, as demonstrated previously, calculate its moisture content using the displayed equation. Then, transfer the crucibles with the dried samples to an incinerator heated to 525 degrees Celsius for four hours.After cooling the samples, record their weight. To assess consumer acceptance, use chifferi pasta samples cooked in distilled water for eight minutes. Conduct sensory tests in individual sensory booths located in a sensory analysis laboratory.Evaluate the visual appearance, color, texture, odor, sea taste, overall taste, overall evaluation, and purchase intent of the samples. The pasta received ratings of five and six on a hedonic scale of one to nine for sea taste and visual appearance, respectively. The pasta had a purchase intention score of five and an overall appreciation score of six.

Gracilaria gracilis를 사용한 파스타 생산, 영양 평가 및 관능 평가

Incorporation of Seaweed Extract in Yogurt and Color Stability Evaluation 

To begin, add 50 milliliters of sodium phosphate buffer to one gram of Gracilaria gracilis. After homogenizing the mixture, use a mortar and pestle to macerate the sample for 10 minutes. Transfer the solution to a tube and centrifuge it for 20 minutes at 12298g.After combining the supernatant, slowly add 65%ammonium sulfate, then pellet the precipitate by centrifugation and dissolve it in distilled water. Perform dialysis of the extract using a tubing membrane against water for 24 hours, followed by freeze drying. To incorporate the extract, mix it in yogurt at a concentration of 0.21%Store the samples in individual glass flasks at 4 degrees Celsius until analysis.To check the color stability of the extract in yogurt, calibrate the colorimeter using a white ceramic plate. Fill a cell with approximately 28 grams of the sample and analyze its color. The color stability of the yogurts with pigment was evaluated for 12 days at 4 degrees celsius.The incorporation of the extracts in yogurts showed good color attention with a color difference of 7.01 plus or minus 2.36 after 12 days of storage.