Name: Autor em destaque: Explorando os compostos bioativos das algas marinhas para inovações sustentáveis nas indústrias
Uploaded: 2023-11-21T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) através dos Projetos Estratégicos atribuídos ao MARE-Centro de Ciências do Mar e do Ambiente (UIDP/04292/2020 e UIDB/04292/2020), e ao Laboratório Associado ARNET (LA/P/0069/2020). A FCT também financiou as bolsas individuais de doutoramento atribuídas a Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) e Tatiana Pereira (2021). 07791. BD). Este trabalho foi também financiado pelo projeto HP4A - MASSA SAUDÁVEL PARA TODOS (copromoção n.º 039952), cofinanciado pelo FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional, no âmbito do Programa Portugal 2020, através do Programa COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade e Internacionalização.

1. Colheita e preparação da biomassa
<ol><li>Colher os espécimes de G. gracilis durante a maré baixa e transportá-los rapidamente para o laboratório em caixas escuras e resfriadas para evitar secagem, luz e exposição ao ar.</li>
	<li>No laboratório, lave cada talo com água do mar corrente e limpe bem para remover detritos, partes necróticas, epífitas e outros organismos da superfície.</li>
	<li>Manter a biomassa silvestre em água do mar constantemente aerada (31-35 psu) em sala climática (20 ± ...

Aproveitando Gracilaria gracilis: Potencial Bioativo para Inovação Sustentável

Os testes de atividade antimicrobiana em meio líquido são utilizados para avaliar a eficácia de substâncias antimicrobianas contra microrganismos suspensos em meio líquido e geralmente são realizados para determinar a capacidade de uma substância inibir o crescimento ou matar microrganismos35,36,37,38. São utilizados para avaliar a sensibilidade de microrganismos a agentes antimicrobian...

As algas marinhas podem ser consideradas uma matéria-prima natural interessante a ser aproveitada pelos setores farmacêutico, alimentício, de rações e ambiental. Biossintetizam uma panóplia de moléculas, muitas não encontradas em organismos terrestres, com propriedades biológicas relevantes 1,2. No entanto, protocolos de cultivo otimizados para algas marinhas precisam ser implementados para garantir um grande estoque de biomassa.
Os métodos de cultivo devem sempre considerar a natureza do talo de algas marinhas e a morfologia geral. Gracilaria gracilis é um táxon clonal, o que significa que o órgão de ligação produz múltiplos eixos vegetativos. A propagação por fragmentação (reprodução vegetativa) é assim alcançada, pois cada um desses eixos é plenamente capaz de adotar uma vida independente do talo principal3. Os táxons clonais podem ser integrados com sucesso com metodologias simples e rápidas de cultivo em uma etapa, pois grandes quantidades de biomassa são obtidas dividindo o talo em pequenos fragmentos que rapidamente se regeneram e crescem em novos indivíduos geneticamente idênticos. Tanto o talo haplontico quanto o diplontico podem ser utilizados nesse processo. Embora o gênero exiba um complexo ciclo de vida trifásico isomórfico haplo-diplontic, a esporulação raramente é necessária, exceto quando a renovação genética dos estoques é necessária para alcançar culturas melhoradas. Nesse caso, tanto os tetrasporos (esporos haplônicos formados pela meiose) quanto os carposporos (esporos diplonticos formados pela mitose) dão origem aos talos macroscópicos que podem ser cultivados e propagados pela reprodução vegetativa4. Os ciclos de crescimento são ditados pelas condições ambientais e pelo estado fisiológico dos indivíduos, entre outros fatores biológicos, como o surgimento de epífitas e a adesão de outros organismos. Portanto, otimizar as condições de cultivo é crucial para garantir alta produtividade e produzir biomassa de boa qualidade5.
A extração de compostos bioativos de algas marinhas, incluindo G. gracilis, pode ser obtida através de vários métodos 6,7. A escolha do método de extração depende dos compostos específicos de interesse, da aplicação alvo e das características da alga. Neste estudo, focamos na extração por solvente, que envolve o uso de solventes verdes, como água ou etanol, para dissolver e extrair compostos bioativos da biomassa de algas marinhas. A extração pode ser realizada através de maceração de forma versátil e eficaz e pode ser utilizada para uma ampla gama de compostos. É um método simples e amplamente utilizado que envolve a imersão de biomassa em um solvente por um período prolongado, tipicamente em temperaturas ambientes ou ligeiramente elevadas. O solvente é agitado para melhorar o processo de extração. Após o tempo de extração desejado, o solvente é separado do material sólido por filtração ou centrifugação.
A água é um solvente comumente usado em aplicações alimentares devido à sua segurança, disponibilidade e compatibilidade com uma ampla gama de produtos alimentícios. A extração de água é adequada para compostos polares como polissacarídeos, peptídeos e certos fenólicos. No entanto, pode não extrair eficazmente compostos apolares. O etanol também é um solvente amplamente utilizado em aplicações alimentares e pode ser eficaz para extrair uma variedade de moléculas bioativas, incluindo compostos fenólicos, flavonoides e certos pigmentos. O etanol é geralmente reconhecido como seguro para uso em alimentos e pode ser facilmente evaporado, deixando para trás os compostos extraídos. Vale ressaltar que a escolha do método de extração deve considerar fatores como eficiência, seletividade, custo-efetividade e impacto ambiental. A otimização dos parâmetros de extração, tais como concentração de solvente, tempo de extração, temperatura e pressão, é crucial para alcançar rendimentos ideais de compostos bioativos de G. gracilis ou outras algas marinhas.
Descobriu-se que as algas marinhas exibem atividade antimicrobiana contra uma ampla gama de microrganismos, incluindo bactérias, fungos e vírus8. Essa atividade é atribuída a componentes bioativos, incluindo fenólicos, polissacarídeos, peptídeos e ácidos graxos. Vários estudos têm demonstrado sua eficácia contra patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, entreoutros9. A atividade antimicrobiana das algas marinhas é atribuída à presença de compostos bioativos que podem interferir na parede celular microbiana, membranas, enzimas e vias de sinalização10. Esses compostos podem interromper o crescimento microbiano, inibir a formação de biofilme e modular as respostas imunes.
As algas vermelhas, também conhecidas como rodófitas, são um grupo de algas que podem apresentar atividade antimicrobiana contra uma variedade de microrganismos. Dentro deste grupo, G. gracilis contém vários compostos bioativos que podem contribuir para sua atividade antimicrobiana relatada. Embora as moléculas específicas possam variar, as classes comuns que têm sido relatadas em G. gracilis e podem possuir propriedades antimicrobianas são polissacarídeos, fenólicos, terpenóides e pigmentos11. No entanto, é importante notar que a presença e a quantidade desses componentes podem variar dependendo de fatores como o local de coleta das algas, sazonalidade, condição fisiológica dos talos e condições ambientais. Portanto, a classe específica e a concentração de compostos antimicrobianos em G. gracilis podem variar de acordo.
G. gracilis também possui propriedades antioxidantes, contendo vários compostos fenólicos, que demonstraram eliminar radicais livres e reduzir o estresse oxidativo12.Os antioxidantes ajudam a proteger as células dos danos causados por espécies reativas de oxigênio e têm potenciais benefícios para a saúde. A capacidade antioxidante pode ser avaliada diretamente através de diferentes métodos, incluindo a atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e, indiretamente, através da quantificação do conteúdo polifenólico total (TPC)13.
Embora um ingrediente tenha uma bioatividade proeminente, sua avaliação da citotoxicidade é indispensável na avaliação de substâncias naturais e sintéticas a serem usadas em contato com células ou tecidos vivos. Existem vários métodos para medir a citotoxicidade, cada um com vantagens e limitações. De modo geral, oferecem uma gama de opções para avaliar os efeitos nocivos de muitas substâncias sobre as células e, ao mesmo tempo, investigar os mecanismos de dano e morte celular14.
Neste trabalho, utilizamos o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), método colorimétrico introduzido por Mosmann (1983)15. Este método mede a redução de sais de tetrazólio a um produto de formazana roxa por células metabolicamente ativas. Quanto maior a quantidade de cristais de formazana, maior o número de células viáveis, proporcionando uma medida indireta de citotoxicidade14. Como neste trabalho os extratos aquoso e etanólico de G. gracilis pretendem ser incorporados em formulações dermocosméticas, a avaliação in vitro da citotoxicidade é realizada em uma linhagem celular de queratinócitos (HaCaT).
Quanto à aplicação alimentar, as algas marinhas são geralmente pobres em calorias e nutricionalmente ricas em fibras alimentares, elementos essenciais e aminoácidos, polissacarídeos, ácidos graxos poli-insaturados, polifenóis e vitaminas 2,16. G. gracilis não é exceção, tendo um valor nutricional interessante. (2021)4 verificaram que G. gracilis cultivada apresentou maiores níveis de proteína e vitamina C e manteve o nível de lipídios totais em relação às algas silvestres. Isso pode representar uma vantagem econômica e ambiental, pois nutricionalmente falando, a produção é preferível à exploração de recursos silvestres. Além disso, os consumidores estão cada vez mais preocupados com o tipo de alimento que comem, por isso é importante introduzir novos ingredientes para o enriquecimento alimentar e usar novos recursos para obter extratos que possam agregar valor a um produto e reivindicar um "rótulo limpo". Além disso, o mercado atual é bastante competitivo, exigindo o desenvolvimento de novos produtos e estratégias inovadoras para diferenciar os fabricantes de seus concorrentes17.
O enriquecimento de produtos de baixo valor nutricional, como as massas, com recursos marinhos, incluindo algas marinhas, é uma estratégia para introduzir este recurso como um novo alimento e uma estratégia de diferenciação de mercado através de um produto com valor nutricional distinto. Por outro lado, G. gracilis é fonte de pigmentos vermelhos naturais, como as ficobiliproteínas18, apresentando alto potencial para aplicações na indústria de alimentos. Esta alga tem demonstrado grande interesse em diversas áreas, e sua aplicação pode ser feita utilizando a totalidade das algas, extratos e/ou a biomassa remanescente. Neste trabalho, demonstramos alguns exemplos de tais aplicações.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Aga, Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale balance</td>
			<td>Sartorius, TE124S</td>
			<td>22105307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis subsp. spizizenii</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM 347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td>5811JH490481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Chamber</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Fluorescent Lamps</td>
			<td>OSRAM Lumilux Skywhite</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer McFarland</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>1898-66-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (DSM 5922)</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM5922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>AGA-Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (Whatman No.1)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA1001320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin-Ciocalteu</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>31360.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic Acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>149-91-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germanium (IV) Oxide, 99.999%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>1310-53-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaCaT cells &#8211; 300493</td>
			<td>CLS-Cell Lines Services, Germany&#160;</td>
			<td>300493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA, C-MAG HS7</td>
			<td>06.090564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>10124-49-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>TelStar, Portugal</td>
			<td>526013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listonella anguillarum</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>&#160;DSM 21597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7773.01.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>738-0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10022403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>&#160;Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA</td>
			<td>1611151E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth (MHB)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>90004-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, FD115</td>
			<td>12-04490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, BD115</td>
			<td>04-62615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1406-05-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter Inolab</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>15212099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippete tips</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>5412307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Bottles Media Storage</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>16157-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph, Laborota 4000</td>
			<td>80409287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor</td>
			<td>IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal</td>
			<td>07.524254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Normax Chem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMagic NX</td>
			<td>Konica Minolta, Japan</td>
			<td></td>
			<td>color data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA</td>
			<td>5A4T092004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-92-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>59-43-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>ICNA091010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>22091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water&#160;</td>
			<td>Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F5HA17360B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Buchi, Switzerland</td>
			<td>FIS05-402-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Merck</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

valorization of the red seaweed gracilaria gracilis through a biorefinery approach

O interesse em algas marinhas como matéria-prima abundante para a obtenção de ingredientes bioativos valiosos e multialvos está crescendo continuamente. Neste trabalho, exploramos o potencial de Gracilaria gracilis, uma alga vermelha comestível cultivada mundialmente por seu interesse comercial como fonte de ágar e outros ingredientes para aplicações cosméticas, farmacológicas, alimentícias e de ração.
As condições de crescimento de G. gracilis foram otimizadas através da propagação vegetativa e esporulação, manipulando-se as condições físico-químicas para atingir um grande estoque de biomassa. Metodologias de extração verde com etanol e água foram realizadas sobre a biomassa de algas marinhas. O potencial bioativo dos extratos foi avaliado através de um conjunto de ensaios in vitro quanto à citotoxicidade, propriedades antioxidantes e antimicrobianas. Adicionalmente, biomassa seca de algas marinhas foi incorporada às formulações de massas alimentícias para aumentar o valor nutricional dos alimentos. Pigmentos extraídos de G. gracilis também foram incorporados ao iogurte como corante natural, e sua estabilidade foi avaliada. Ambos os produtos foram submetidos à apreciação de um painel sensorial semi-treinado visando alcançar a melhor formulação final antes de chegarem ao mercado.
Os resultados suportam a versatilidade de G. gracilis seja aplicado como biomassa inteira, extratos e/ou pigmentos. Através da implementação de vários protocolos otimizados, este trabalho permite o desenvolvimento de produtos com potencial para rentabilizar os mercados alimentar, cosmético e aquícola, promovendo a sustentabilidade ambiental e uma economia circular azul.
Além disso, e de acordo com uma abordagem de biorrefinaria, a biomassa residual de algas marinhas será utilizada como bioestimulante para o crescimento vegetal ou convertida em materiais de carbono para ser utilizada na purificação da água dos sistemas aquícolas internos do MARE-Politécnico de Leiria, Portugal.

&#160;Seaweeds can be regarded as an interesting natural raw material to be profited by the pharmaceutical, food, feed, and environmental sectors. They biosynthesize a panoply of molecules, many not found in terrestrial organisms, with relevant biological properties1,2. However, seaweed-optimized cultivation protocols need to be implemented to ensure a large biomass stock.
Cultivation methods must always consider the nature of the seaweed thalli and overall morphology. Gracilaria gracilis is a clonal taxon, meaning the attachment organ produces multiple vegetative axes. Propagation by fragmentation (vegetative reproduction) is thus achieved, as each of these axes is fully able to adopt an independent life from the main thallus3. Clonal taxa can be successfully integrated with simple and fast one-step cultivation methodologies, as large amounts of biomass are obtained by splitting the thallus into small fragments that quickly regenerate and grow into new, genetically identical individuals. Both haplontic and diplontic thalli may be used in this process. Although the genus exhibits a complex haplo-diplontic isomorphic triphasic life cycle, sporulation is rarely necessary except when genetic renewal of the stocks is required to achieve improved crops. In this case, both tetraspores (haplontic spores formed by meiosis) and carpospores (diplontic spores formed by mitosis) give rise to macroscopic thalli that can then be grown and propagated by vegetative reproduction4. Growth cycles are dictated by environmental conditions and the physiological state of the individuals, among other biological factors such as the emergence of epiphytes and the adhesion of other organisms. Therefore, optimizing growing conditions is crucial to ensure high productivity and produce good quality biomass5.
The extraction of bioactive compounds from seaweed, including G. gracilis, can be achieved through various methods6,7. The choice of the extraction method depends on the specific compounds of interest, the target application, and the characteristics of the seaweed. In this study, we focused on solvent extraction, which involves using green solvents, such as water or ethanol, to dissolve and extract bioactive compounds from the seaweed biomass. The extraction can be carried out through maceration in a versatile and effective way and can be used for a wide range of compounds. It is a simple and widely used method involving soaking biomass in a solvent for an extended period, typically at room or slightly elevated temperatures. The solvent is stirred to enhance the extraction process. After the desired extraction time, the solvent is separated from the solid material by filtration or centrifugation.
Water is a commonly used solvent in food applications due to its safety, availability, and compatibility with a wide range of food products. Water extraction is suitable for polar compounds such as polysaccharides, peptides, and certain phenolics. However, it may not effectively extract non-polar compounds. Ethanol is also a widely used solvent in food applications and can be effective for extracting a variety of bioactive molecules, including phenolic compounds, flavonoids, and certain pigments. Ethanol is generally recognized as safe for use in food and can be easily evaporated, leaving behind the extracted compounds. It is worth noting that the choice of extraction method should consider factors such as efficiency, selectivity, cost-effectiveness, and environmental impact. The optimization of extraction parameters, such as solvent concentration, extraction time, temperature, and pressure, is crucial to achieving optimal yields of bioactive compounds from G. gracilis or other seaweeds.
Seaweeds have been found to exhibit antimicrobial activity against a wide range of microorganisms, including bacteria, fungi, and viruses8. This activity is attributed to bioactive components, including phenolics, polysaccharides, peptides, and fatty acids. Several studies have demonstrated their efficacy against pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., and Pseudomonas aeruginosa, among others9. The antimicrobial activity of seaweeds is attributed to the presence of bioactive compounds that can interfere with microbial cell walls, membranes, enzymes, and signaling pathways10. These compounds may disrupt microbial growth, inhibit biofilm formation, and modulate immune responses.
Red seaweeds, also known as rhodophytes, are a group of algae that can exhibit antimicrobial activity against a variety of microorganisms. Within this group, G. gracilis contains various bioactive compounds that may contribute to its reported antimicrobial activity. While the specific molecules can vary, the common classes that have been reported in G. gracilis and may possess antimicrobial properties are polysaccharides, phenolics, terpenoids, and pigments11. However, it is important to note that the presence and amounts of these components can vary depending on factors such as the location of seaweed collection, seasonality, physiological condition of the thalli, and environmental conditions. Therefore, the specific class and concentration of antimicrobial compounds in G. gracilis may vary accordingly.
G. gracilis has also been found to hold antioxidant properties, containing various phenolic compounds, which have been shown to scavenge free radicals and reduce oxidative stress12. Antioxidants help to protect cells from damage caused by reactive oxygen species and have potential health benefits. Antioxidant capacity can be evaluated directly through different methods, including the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity and, indirectly, through the quantification of total polyphenolic content (TPC)13.
Even though an ingredient is reported to have a prominent bioactivity, its cytotoxicity assessment is indispensable in evaluating natural and synthetic substances to be used in contact with living cells or tissues. There are several methods for measuring cytotoxicity, each one with advantages and limitations. Overall, they offer a range of options to evaluate the harmful effects of many substances on cells and, at the same time, to investigate the mechanisms of cell damage and death14.
In this work, we use the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a colorimetric method introduced by Mosmann (1983)15. This method measures the reduction of tetrazolium salts to a purple formazan product by metabolically active cells. The higher the amount of formazan crystals, the higher the number of viable cells, thus providing an indirect measure of cytotoxicity14. Since in this work, G. gracilis water and ethanol extracts are intended to be incorporated into dermo-cosmetic formulations, the in vitro cytotoxicity evaluation is performed in a keratinocyte (HaCaT) cell line.
Concerning the food application, seaweeds are generally low in calories and nutritionally rich in dietary fibers, essential elements and amino acids, polysaccharides, polyunsaturated fatty acids, polyphenols, and vitamins2,16. G. gracilis is no exception, having an interesting nutritional value. Freitas et al. (2021)4 found that cultivated G. gracilis had higher levels of protein and vitamin C and maintained the level of total lipids compared to wild seaweed. This may represent an economic and environmental advantage, as nutritionally speaking, production is preferable to the exploitation of wild resources. In addition, consumers are increasingly concerned about the type of food they eat, so it is important to introduce new ingredients for food enrichment and use new resources to obtain extracts that can add value to a product and claim a &#34;clean label.&#34; Besides, the current market is very competitive, requiring the development of new products and innovative strategies to differentiate manufacturers from their competitors17.
The enrichment of products with poor nutritional value, such as pasta, with marine resources, including seaweed, is a strategy to introduce this resource as a new food and a market differentiation strategy through a product with distinct nutritional value. On the other hand, G. gracilis is a source of natural red pigments such as phycobiliproteins18, having high potential for applications in the food industry. This seaweed has shown high interest in several areas, and its application can be made using the whole seaweed, extracts and/or the remaining biomass. In this work, we demonstrate some examples of such applications.

Autor em destaque: Explorando os compostos bioativos das algas marinhas para inovações sustentáveis nas indústrias 

Valorização da Alga Vermelha Gracilaria gracilis Através de uma Abordagem de Biorrefinaria

Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceutical drugs.One of the challenges of using seaweed in the development of new food products is to avoid using high amounts that could lead to unpleasant sensory properties in food. Using seaweed extracts is a way to get around this problem. With this protocol, we were able to develop pasta, wheat, add nutritional value by incorporating whole algae.Usually, the addition of these ingredients provides less common sensory properties. However, with the developed formulation, a consumer acceptance was still achieved.

Atividade antimicrobiana
Ao interpretar os resultados obtidos, deve-se ter em mente que quanto maior o percentual de inibição, maior a eficácia do extrato em inibir o crescimento daquela cepa específica e, consequentemente, mais interessante é o extrato como antimicrobiano. Através desta metodologia, podemos identificar rapidamente quais extratos têm maior atividade sobre determinadas cepas bacterianas, i...

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Aqui, descrevemos vários protocolos visando uma valorização integrada de Gracilaria gracilis: colheita de espécies silvestres, crescimento interno e extração de ingredientes bioativos. Os efeitos antioxidantes, antimicrobianos e citotóxicos dos extratos são avaliados, assim como a avaliação nutricional e de estabilidade de alimentos enriquecidos com biomassa e pigmentos integrais de algas marinhas.

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we ...

Nossa pesquisa está focada na prospecção de novos compostos bioativos a partir de algas marinhas que podem ser úteis em diferentes setores, como indústrias alimentícias, cosméticas e farmacêuticas. Há uma crescente conscientização na sociedade sobre o potencial dos organismos marinhos para fornecer compostos bioativos. Esses compostos podem ser usados para produzir cosméticos funcionais sustentáveis e mais seguros, melhorar a qualidade dos produtos alimentícios e servir como fonte de novas estruturas químicas para o desenvolvimento de novos fármacos.Um dos desafios do uso de algas marinhas no desenvolvimento de novos produtos alimentícios é evitar o uso de altas quantidades que poderiam levar a propriedades sensoriais desagradáveis nos alimentos. Usar extratos de algas marinhas é uma maneira de contornar esse problema. Com esse protocolo, conseguimos desenvolver massas, trigo, agregar valor nutricional incorporando algas integrais.Normalmente, a adição desses ingredientes fornece propriedades sensoriais menos comuns. No entanto, com a formulação desenvolvida, a aceitação do consumidor ainda foi alcançada.

valorization-red-seaweed-gracilaria-gracilis-through-biorefinery

Research

JoVE Journal

Biology

Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we explore the potential of Gracilaria gracilis, an edible red seaweed cultivated worldwide for its commercial interest as a source of agar and other ingredients for cosmetic, pharmacological, food, and feed applications.
G. gracilis growth conditions were optimized through vegetative propagation and sporulation while manipulating the physicochemical conditions to achieve a large biomass stock. Green extraction methodologies with ethanol and water were performed over the seaweed biomass. The bioactive potential of extracts was assessed through a set of in vitro assays concerning their cytotoxicity, antioxidant, and antimicrobial properties. Additionally, dried seaweed biomass was incorporated into pasta formulations to increase food&#39;s nutritional value. Pigments extracted from G. gracilis have also been incorporated into yogurt as a natural colorant, and their stability was evaluated. Both products were submitted to the appreciation of a semi-trained sensorial panel aiming to achieve the best final formulation before reaching the market.
Results support the versatility of G. gracilis whether it is applied as a whole biomass, extracts and/or pigments. Through implementing several optimized protocols, this work allows the development of products with the potential to profit the food, cosmetic, and aquaculture markets, promoting environmental sustainability and a blue circular economy.
Moreover, and in line with a biorefinery approach, the residual seaweed biomass will be used as biostimulant for plant growth or converted to carbon materials to be used in water purification of the in-house aquaculture systems of MARE-Polytechnic of Leiria, Portugal.

Here, we describe several protocols aiming at an integrated valorization of Gracilaria gracilis: wild species harvesting, in-house growth, and extraction of bioactive ingredients. The extracts&#39; antioxidant, antimicrobial, and cytotoxic effects are evaluated, along with the nutritional and stability assessment of food enriched with whole seaweed biomass and pigments.

Biologia

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis  

To begin, grow Gracilaria gracilis in 250 milliliters of flat bottom flasks in a climatic room. Once the biomass has been scaled up, dried, and ground, weigh the resulting dried biomass. Dissolve it in 100 milliliters of solvent and mix by stirring in a vessel protected from light for 30 minutes.Perform extractions with ethanol and water separately at room temperature. Filter the liquid extracts through filter paper to separate them from the remaining biomass. Centrifuge the extracts at 8, 000 G for 10 minutes, at room temperature.Freeze dry the aqueous extracts and use a rotary evaporator at 40 degrees Celsius to evaporate the ethanol extracts.

Extração dos Ingredientes Bioativos de Gracilaria gracilis

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts  

To begin, take the aqueous and ethanol extracts obtained from the dried Gracilaria gracilis. In a 96 well microplate, dispense two microliters of each sample and 198 microliters of DPPH dissolved in absolute ethanol. Then, using a microplate spectrophotometer, measure the absorbance at 517 nanometers.Take the human keratinocytes grown in 96 well plates overnight. Add two microliters of the DMSO dissolved extracts to 198 microliters of the medium in microplate wells. Remove the culture medium.Add 100 microliters of MTT to the cells and incubate in the dark for 30 minutes. To solubilize the intracellular formazan crystals, add 100 microliters of DMSO. Using a microplate reader, measure the absorbance at 570 nanometers.The DPPH test demonstrated that the temperature of 40 degrees Celsius showed higher inhibition values of oxidant activity compared to extracts obtained at room temperature or 70 degrees Celsius. No cytotoxic effects were observed on human keratinocytes, suggesting that at the maximum assay concentration, both aqueous and ethanol extracts are safe for cutaneous use.

Avaliação dos Efeitos Antioxidantes e Citotóxicos dos Extratos de Gracilaria gracilis

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation  

To begin, combine predefined portions of rice flour, gracilaria gracilis, and chlorella vulgaris in the equipment, and add approximately 30%water to the mixture. After a few minutes of mixing, followed by extruding the pasta, using the equipment, cut it manually. To produce chifferi, dry the pasta at 68 degrees Celsius for 42 minutes, followed by an additional five hours and 30 minutes at 76 degrees Celsius, simulating an industrial process.Finally, vacuum seal the samples and store them in a dark place at room temperature. Take one gram sample in a glass crucible with a filter bottom and position it in the fiber analyzer. Add 150 milliliters of preheated 1.25%sulfuric acid, and two milliliters of anti-foaming agent to the column of each crucible.Remove the solvent and rinse the crucible three times with deionized water to prepare the sample for the basic hydrolysis. After washing the crucibles three times with 150 milliliters of acetone, carefully transfer those to an oven set at 150 degrees Celsius for one hour. Record the final weight.Transfer the crucibles to a muffle furnace, set at 500 degrees Celsius for three hours, and then record the final weight. To determine the fatty acids profile, add two milliliters of 2%sulfuric acid solution in methanol to a 50 milligram sample. Heat the mixture at 80 degrees Celsius for two hours.Then, cool the mixture to room temperature and add one milliliter of ultrapure water and two milliliters of N-heptane to each sample. After vortexing the mixture for one minute, centrifuge it for five minutes. Later, recover the upper N-heptane phase containing the fatty acid methyl esters and transfer it to gas chromatography vials.Analyze the samples in a gas chromatograph equipped with a TR-FAME capillary column, an auto sampler, and a flame ionization detector. Determine the fatty acid profile by comparing the resulting retention times with a standard. Incubate porcelain crucibles for three hours at 105 degrees Celsius.Allow them to cool in a desiccator, and then record their weights. After incubating 10 grams of the sample, as demonstrated previously, calculate its moisture content using the displayed equation. Then, transfer the crucibles with the dried samples to an incinerator heated to 525 degrees Celsius for four hours.After cooling the samples, record their weight. To assess consumer acceptance, use chifferi pasta samples cooked in distilled water for eight minutes. Conduct sensory tests in individual sensory booths located in a sensory analysis laboratory.Evaluate the visual appearance, color, texture, odor, sea taste, overall taste, overall evaluation, and purchase intent of the samples. The pasta received ratings of five and six on a hedonic scale of one to nine for sea taste and visual appearance, respectively. The pasta had a purchase intention score of five and an overall appreciation score of six.

Produção de Macarrão com Gracilaria gracilis, Avaliação Nutricional e Avaliação Sensorial

Incorporation of Seaweed Extract in Yogurt and Color Stability Evaluation 

To begin, add 50 milliliters of sodium phosphate buffer to one gram of Gracilaria gracilis. After homogenizing the mixture, use a mortar and pestle to macerate the sample for 10 minutes. Transfer the solution to a tube and centrifuge it for 20 minutes at 12298g.After combining the supernatant, slowly add 65%ammonium sulfate, then pellet the precipitate by centrifugation and dissolve it in distilled water. Perform dialysis of the extract using a tubing membrane against water for 24 hours, followed by freeze drying. To incorporate the extract, mix it in yogurt at a concentration of 0.21%Store the samples in individual glass flasks at 4 degrees Celsius until analysis.To check the color stability of the extract in yogurt, calibrate the colorimeter using a white ceramic plate. Fill a cell with approximately 28 grams of the sample and analyze its color. The color stability of the yogurts with pigment was evaluated for 12 days at 4 degrees celsius.The incorporation of the extracts in yogurts showed good color attention with a color difference of 7.01 plus or minus 2.36 after 12 days of storage.