Name: В центре внимания автора: Изучение биоактивных соединений морских водорослей для устойчивых инноваций в промышленности
Uploaded: 2023-11-21T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Эта работа была поддержана Португальским фондом науки и технологий (FCT) в рамках стратегических проектов, предоставленных Центру морских и экологических наук MARE-(UIDP/04292/2020 и UIDB/04292/2020) и ассоциированной лаборатории ARNET (LA/P/0069/2020). FCT также профинансировал индивидуальные докторские гранты, присужденные Марте В. Фрейтас (UI/BD/150957/2021) и Татьяне Перейре (2021. 07791. БД). Эта работа также была финансово поддержана проектом HP4A - ЗДОРОВЫЕ МАКАРОНЫ ДЛЯ ВСЕХ (совместная реклама No 039952), софинансируемым ЕФРР - Европейским фондом регионального развития в рамках Программы Португалия 2020 в рамках Оперативной программы конкурентоспособности и интернационализации COMPETE 2020.

1. Заготовка и подготовка биомассы
<ol><li>Собирайте образцы G. gracilis во время отлива и быстро транспортируйте их в лабораторию в темных, охлаждаемых боксах, чтобы избежать высыхания, воздействия света и воздуха.</li>
	<li>В лаборатории промойте каждое слоевище проточной морской водой и тщ?...

Использование Gracilaria gracilis: биоактивный потенциал для устойчивых инноваций

Испытания на антимикробную активность в жидкой среде используются для оценки эффективности антимикробных веществ против микроорганизмов, взвешенных в жидкой среде, и обычно проводятся для определения способности вещества подавлять рост или убивать микроорганизмы35,36,37,38</sup...

Морские водоросли можно рассматривать как интересное природное сырье для фармацевтической, пищевой, кормовой и экологической отраслей. Они биосинтезируют множество молекул, многие из которых не встречаются в наземных организмах, обладающих соответствующими биологическими свойствами 1,2. Тем не менее, для обеспечения большого запаса биомассы необходимо внедрить оптимизированные для морских водорослей протоколы выращивания.
Методы выращивания всегда должны учитывать природу слоевищ водорослей и общую морфологию. Gracilaria gracilis является клональным таксоном, что означает, что орган прикрепления производит несколько вегетативных осей. Таким образом, достигается размножение путем фрагментации (вегетативное размножение), так как каждая из этих осей полностью способна к самостоятельной жизни от основного слоевища3. Клональные таксоны могут быть успешно интегрированы с помощью простых и быстрых одноэтапных методологий культивирования, так как большое количество биомассы получается путем расщепления слоевища на мелкие фрагменты, которые быстро регенерируют и вырастают в новых, генетически идентичных особей. В этом процессе могут использоваться как гаплонтические, так и диплонтические слоевища. Несмотря на то, что род демонстрирует сложный гапло-диплонтический изоморфный трехфазный жизненный цикл, спороношение редко требуется, за исключением тех случаев, когда требуется генетическое обновление запасов для получения улучшенных урожаев. В этом случае как тетраспоры (гаплонтические споры, образующиеся мейозом), так и карпоспоры (диплонтические споры, образующиеся в результате митоза) дают начало макроскопическим слоевищам, которые затем могут быть выращены и размножаться путем вегетативного размножения4. Циклы роста диктуются условиями окружающей среды и физиологическим состоянием особей, а также другими биологическими факторами, такими как появление эпифитов и сцепление других организмов. Таким образом, оптимизация условий выращивания имеет решающее значение для обеспечения высокой продуктивности и производства высококачественной биомассы5.
Извлечение биологически активных соединений из морских водорослей, включая G. gracilis, может быть достигнуто различными методами 6,7. Выбор метода экстракции зависит от конкретных интересующих соединений, целевого применения и характеристик морских водорослей. В этом исследовании мы сосредоточились на жидкостной экстракции, которая включает в себя использование зеленых растворителей, таких как вода или этанол, для растворения и извлечения биологически активных соединений из биомассы морских водорослей. Экстракция может осуществляться с помощью мацерации универсальным и эффективным способом и может использоваться для широкого спектра соединений. Это простой и широко используемый метод, включающий замачивание биомассы в растворителе в течение длительного периода времени, как правило, при комнатной или слегка повышенной температуре. Растворитель перемешивают для усиления процесса экстракции. По истечении требуемого времени экстракции растворитель отделяется от твердого материала путем фильтрации или центрифугирования.
Вода является широко используемым растворителем в пищевой промышленности из-за ее безопасности, доступности и совместимости с широким спектром пищевых продуктов. Водная экстракция подходит для полярных соединений, таких как полисахариды, пептиды и некоторые фенольные соединения. Однако он не может эффективно извлекать неполярные соединения. Этанол также широко используется в качестве растворителя в пищевых продуктах и может быть эффективным для извлечения различных биологически активных молекул, включая фенольные соединения, флавоноиды и некоторые пигменты. Этанол в целом признан безопасным для использования в пищевых продуктах и может легко испаряться, оставляя после себя извлеченные соединения. Стоит отметить, что при выборе метода экстракции следует учитывать такие факторы, как эффективность, селективность, экономичность и воздействие на окружающую среду. Оптимизация параметров экстракции, таких как концентрация растворителя, время экстракции, температура и давление, имеет решающее значение для достижения оптимального выхода биологически активных соединений из G. gracilis или других морских водорослей.
Было обнаружено, что морские водоросли проявляют антимикробную активность в отношении широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии, грибки и вирусы8. Эта активность объясняется биологически активными компонентами, включая фенольные соединения, полисахариды, пептиды и жирные кислоты. Несколько исследований продемонстрировали их эффективность против таких патогенов, как Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. и Pseudomonas aeruginosa, среди прочих9. Антимикробная активность морских водорослей объясняется присутствием биологически активных соединений, которые могут вмешиваться в микробные клеточные стенки, мембраны, ферменты и сигнальные пути10. Эти соединения могут нарушать рост микробов, ингибировать образование биопленки и модулировать иммунные реакции.
Красные водоросли, также известные как родофиты, представляют собой группу водорослей, которые могут проявлять антимикробную активность против различных микроорганизмов. В этой группе G. gracilis содержит различные биологически активные соединения, которые могут способствовать его антимикробной активности. В то время как конкретные молекулы могут варьироваться, общими классами, которые были зарегистрированы у G. gracilis и могут обладать антимикробными свойствами, являются полисахариды, фенолы, терпеноиды и пигменты11. Однако важно отметить, что наличие и количество этих компонентов может варьироваться в зависимости от таких факторов, как место сбора водорослей, сезонность, физиологическое состояние слоевища и условия окружающей среды. Таким образом, конкретный класс и концентрация антимикробных соединений в G. gracilis могут варьироваться соответствующим образом.
Также было обнаружено, что G. gracilis обладает антиоксидантными свойствами, содержа различные фенольные соединения, которые, как было показано, поглощают свободные радикалы и снижают окислительныйстресс.Антиоксиданты помогают защитить клетки от повреждений, вызванных активными формами кислорода, и имеют потенциальную пользу для здоровья. Антиоксидантная способность может быть оценена непосредственно с помощью различных методов, включая активность 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) по удалению свободных радикалов и, косвенно, через количественное определение общего содержания полифенольных соединений (TPC)13.
Несмотря на то, что ингредиент, как сообщается, обладает выраженной биологической активностью, оценка его цитотоксичности необходима при оценке натуральных и синтетических веществ, используемых в контакте с живыми клетками или тканями. Существует несколько методов измерения цитотоксичности, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения. В целом, они предлагают ряд возможностей для оценки вредного воздействия многих веществ на клетки и, в то же время, для исследования механизмов поврежденияи гибели клеток.
В этой работе мы используем 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), колориметрический метод, введенный Мосманном (1983)15. Этот метод измеряет восстановление солей тетразолия до пурпурного формазана метаболически активными клетками. Чем выше количество кристаллов формазана, тем выше число жизнеспособных клеток, что обеспечивает косвенную меру цитотоксичности14. Поскольку в данной работе водные и этаноловые экстракты G. gracilis предназначены для включения в дермокосметические составы, оценка цитотоксичности in vitro проводится в клеточной линии кератиноцитов (HaCaT).
Что касается применения в пищу, морские водоросли, как правило, низкокалорийны и богаты питательными веществами пищевыми волокнами, незаменимыми элементами и аминокислотами, полисахаридами, полиненасыщенными жирными кислотами, полифенолами и витаминами 2,16. G. gracilis не является исключением, обладая интересной пищевой ценностью. Freitas et al. (2021)4 обнаружили, что культивируемый G. gracilis имеет более высокий уровень белка и витамина С и поддерживает уровень общих липидов по сравнению с дикими морскими водорослями. Это может представлять собой экономическое и экологическое преимущество, поскольку с точки зрения питания производство предпочтительнее, чем эксплуатация диких ресурсов. Кроме того, потребители все больше обеспокоены типом пищи, которую они едят, поэтому важно вводить новые ингредиенты для обогащения пищевых продуктов и использовать новые ресурсы для получения экстрактов, которые могут повысить ценность продукта и претендовать на «чистую этикетку». Кроме того, современный рынок характеризуется высокой конкуренцией, требующей разработки новых продуктов и инновационных стратегий, позволяющих дифференцировать производителей от их конкурентов17.
Обогащение продуктов с низкой питательной ценностью, таких как макаронные изделия, морскими ресурсами, в том числе морскими водорослями, является стратегией внедрения этого ресурса в качестве нового продукта питания и стратегии дифференциации рынка за счет продукта с определенной питательной ценностью. С другой стороны, G. gracilis является источником природных красных пигментов, таких как фикобилипротеины18, обладающие высоким потенциалом для применения в пищевой промышленности. Эта водоросль проявила большой интерес в нескольких областях, и ее применение может быть произведено с использованием целых водорослей, экстрактов и/или оставшейся биомассы. В данной работе мы демонстрируем некоторые примеры таких приложений.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol</td>
			<td>Aga, Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>12125-02-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale balance</td>
			<td>Sartorius, TE124S</td>
			<td>22105307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis subsp. spizizenii</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM 347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>58-85-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, 5810R</td>
			<td>5811JH490481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Chamber</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool White Fluorescent Lamps</td>
			<td>OSRAM Lumilux Skywhite</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer McFarland</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>1898-66-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (DSM 5922)</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>DSM5922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>AGA-Portugal</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (Whatman No.1)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA1001320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin-Ciocalteu</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>31360.264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallic Acid&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>149-91-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germanium (IV) Oxide, 99.999%</td>
			<td>AlfaAesar</td>
			<td>1310-53-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaCaT cells &#8211; 300493</td>
			<td>CLS-Cell Lines Services, Germany&#160;</td>
			<td>300493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA, C-MAG HS7</td>
			<td>06.090564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>10124-49-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>TelStar, Portugal</td>
			<td>526013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>J106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Listonella anguillarum</td>
			<td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)</td>
			<td>&#160;DSM 21597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Chloride</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7773.01.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>738-0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplates (sterile)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10022403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>&#160;Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA</td>
			<td>1611151E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth (MHB)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>90004-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, FD115</td>
			<td>12-04490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder, BD115</td>
			<td>04-62615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1406-05-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter Inolab</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>15212099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippete tips</td>
			<td>Eppendorf, Portugal</td>
			<td>5412307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Bottles Media Storage</td>
			<td>&#160;VWR International, Alcabideche, Portugal&#160;</td>
			<td>16157-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph, Laborota 4000</td>
			<td>80409287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotavapor</td>
			<td>IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal</td>
			<td>07.524254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Chem-Lab</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td>Normax Chem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Riedel-de Ha&#235;n</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMagic NX</td>
			<td>Konica Minolta, Japan</td>
			<td></td>
			<td>color data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA</td>
			<td>5A4T092004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-92-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>59-43-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>ICNA091010617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>22091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water&#160;</td>
			<td>Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F5HA17360B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Buchi, Switzerland</td>
			<td>FIS05-402-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Merck</td>
			<td>68-19-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

valorization of the red seaweed gracilaria gracilis through a biorefinery approach

Интерес к морским водорослям как к обильному исходному материалу для получения ценных и многоцелевых биологически активных ингредиентов постоянно растет. В этой работе мы исследуем потенциал Gracilaria gracilis, съедобных красных водорослей, культивируемых во всем мире из-за их коммерческого интереса в качестве источника агара и других ингредиентов для косметических, фармакологических, пищевых и кормовых применений.
Условия роста G. gracilis были оптимизированы за счет вегетативного размножения и спороношения при одновременном манипулировании физико-химическими условиями для достижения большого запаса биомассы. Методы «зеленой» экстракции с использованием этанола и воды были выполнены над биомассой морских водорослей. Биоактивный потенциал экстрактов оценивали с помощью комплекса анализов in vitro на предмет их цитотоксичности, антиоксидантных и антимикробных свойств. Кроме того, высушенная биомасса морских водорослей была включена в рецептуры макаронных изделий для повышения питательной ценности пищи. Пигменты, извлеченные из G. gracilis , также были включены в йогурт в качестве натурального красителя, и была оценена их стабильность. Оба продукта были представлены на суд полуобученной сенсорной комиссии, целью которой было достижение наилучшей конечной формулы до выхода на рынок.
Результаты подтверждают универсальность G. gracilis независимо от того, применяется ли он в виде целой биомассы, экстрактов и/или пигментов. Благодаря внедрению нескольких оптимизированных протоколов эта работа позволяет разрабатывать продукты, которые могут принести прибыль рынкам продуктов питания, косметики и аквакультуры, способствуя экологической устойчивости и «голубой» экономике замкнутого цикла.
Кроме того, в соответствии с подходом к биопереработке, остаточная биомасса морских водорослей будет использоваться в качестве биостимулятора для роста растений или преобразована в углеродные материалы, которые будут использоваться для очистки воды в собственных системах аквакультуры MARE-Polytechnic в Лейрии, Португалия.

&#160;Seaweeds can be regarded as an interesting natural raw material to be profited by the pharmaceutical, food, feed, and environmental sectors. They biosynthesize a panoply of molecules, many not found in terrestrial organisms, with relevant biological properties1,2. However, seaweed-optimized cultivation protocols need to be implemented to ensure a large biomass stock.
Cultivation methods must always consider the nature of the seaweed thalli and overall morphology. Gracilaria gracilis is a clonal taxon, meaning the attachment organ produces multiple vegetative axes. Propagation by fragmentation (vegetative reproduction) is thus achieved, as each of these axes is fully able to adopt an independent life from the main thallus3. Clonal taxa can be successfully integrated with simple and fast one-step cultivation methodologies, as large amounts of biomass are obtained by splitting the thallus into small fragments that quickly regenerate and grow into new, genetically identical individuals. Both haplontic and diplontic thalli may be used in this process. Although the genus exhibits a complex haplo-diplontic isomorphic triphasic life cycle, sporulation is rarely necessary except when genetic renewal of the stocks is required to achieve improved crops. In this case, both tetraspores (haplontic spores formed by meiosis) and carpospores (diplontic spores formed by mitosis) give rise to macroscopic thalli that can then be grown and propagated by vegetative reproduction4. Growth cycles are dictated by environmental conditions and the physiological state of the individuals, among other biological factors such as the emergence of epiphytes and the adhesion of other organisms. Therefore, optimizing growing conditions is crucial to ensure high productivity and produce good quality biomass5.
The extraction of bioactive compounds from seaweed, including G. gracilis, can be achieved through various methods6,7. The choice of the extraction method depends on the specific compounds of interest, the target application, and the characteristics of the seaweed. In this study, we focused on solvent extraction, which involves using green solvents, such as water or ethanol, to dissolve and extract bioactive compounds from the seaweed biomass. The extraction can be carried out through maceration in a versatile and effective way and can be used for a wide range of compounds. It is a simple and widely used method involving soaking biomass in a solvent for an extended period, typically at room or slightly elevated temperatures. The solvent is stirred to enhance the extraction process. After the desired extraction time, the solvent is separated from the solid material by filtration or centrifugation.
Water is a commonly used solvent in food applications due to its safety, availability, and compatibility with a wide range of food products. Water extraction is suitable for polar compounds such as polysaccharides, peptides, and certain phenolics. However, it may not effectively extract non-polar compounds. Ethanol is also a widely used solvent in food applications and can be effective for extracting a variety of bioactive molecules, including phenolic compounds, flavonoids, and certain pigments. Ethanol is generally recognized as safe for use in food and can be easily evaporated, leaving behind the extracted compounds. It is worth noting that the choice of extraction method should consider factors such as efficiency, selectivity, cost-effectiveness, and environmental impact. The optimization of extraction parameters, such as solvent concentration, extraction time, temperature, and pressure, is crucial to achieving optimal yields of bioactive compounds from G. gracilis or other seaweeds.
Seaweeds have been found to exhibit antimicrobial activity against a wide range of microorganisms, including bacteria, fungi, and viruses8. This activity is attributed to bioactive components, including phenolics, polysaccharides, peptides, and fatty acids. Several studies have demonstrated their efficacy against pathogens such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., and Pseudomonas aeruginosa, among others9. The antimicrobial activity of seaweeds is attributed to the presence of bioactive compounds that can interfere with microbial cell walls, membranes, enzymes, and signaling pathways10. These compounds may disrupt microbial growth, inhibit biofilm formation, and modulate immune responses.
Red seaweeds, also known as rhodophytes, are a group of algae that can exhibit antimicrobial activity against a variety of microorganisms. Within this group, G. gracilis contains various bioactive compounds that may contribute to its reported antimicrobial activity. While the specific molecules can vary, the common classes that have been reported in G. gracilis and may possess antimicrobial properties are polysaccharides, phenolics, terpenoids, and pigments11. However, it is important to note that the presence and amounts of these components can vary depending on factors such as the location of seaweed collection, seasonality, physiological condition of the thalli, and environmental conditions. Therefore, the specific class and concentration of antimicrobial compounds in G. gracilis may vary accordingly.
G. gracilis has also been found to hold antioxidant properties, containing various phenolic compounds, which have been shown to scavenge free radicals and reduce oxidative stress12. Antioxidants help to protect cells from damage caused by reactive oxygen species and have potential health benefits. Antioxidant capacity can be evaluated directly through different methods, including the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity and, indirectly, through the quantification of total polyphenolic content (TPC)13.
Even though an ingredient is reported to have a prominent bioactivity, its cytotoxicity assessment is indispensable in evaluating natural and synthetic substances to be used in contact with living cells or tissues. There are several methods for measuring cytotoxicity, each one with advantages and limitations. Overall, they offer a range of options to evaluate the harmful effects of many substances on cells and, at the same time, to investigate the mechanisms of cell damage and death14.
In this work, we use the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, a colorimetric method introduced by Mosmann (1983)15. This method measures the reduction of tetrazolium salts to a purple formazan product by metabolically active cells. The higher the amount of formazan crystals, the higher the number of viable cells, thus providing an indirect measure of cytotoxicity14. Since in this work, G. gracilis water and ethanol extracts are intended to be incorporated into dermo-cosmetic formulations, the in vitro cytotoxicity evaluation is performed in a keratinocyte (HaCaT) cell line.
Concerning the food application, seaweeds are generally low in calories and nutritionally rich in dietary fibers, essential elements and amino acids, polysaccharides, polyunsaturated fatty acids, polyphenols, and vitamins2,16. G. gracilis is no exception, having an interesting nutritional value. Freitas et al. (2021)4 found that cultivated G. gracilis had higher levels of protein and vitamin C and maintained the level of total lipids compared to wild seaweed. This may represent an economic and environmental advantage, as nutritionally speaking, production is preferable to the exploitation of wild resources. In addition, consumers are increasingly concerned about the type of food they eat, so it is important to introduce new ingredients for food enrichment and use new resources to obtain extracts that can add value to a product and claim a &#34;clean label.&#34; Besides, the current market is very competitive, requiring the development of new products and innovative strategies to differentiate manufacturers from their competitors17.
The enrichment of products with poor nutritional value, such as pasta, with marine resources, including seaweed, is a strategy to introduce this resource as a new food and a market differentiation strategy through a product with distinct nutritional value. On the other hand, G. gracilis is a source of natural red pigments such as phycobiliproteins18, having high potential for applications in the food industry. This seaweed has shown high interest in several areas, and its application can be made using the whole seaweed, extracts and/or the remaining biomass. In this work, we demonstrate some examples of such applications.

В центре внимания автора: Изучение биоактивных соединений морских водорослей для устойчивых инноваций в промышленности 

Повышение ценности красных морских водорослей Gracilaria gracilis с помощью биоперерабатывающего подхода

Our research is focused on the prospection of new bioactive compounds from seaweed that can be useful in different sectors such as food, cosmetic, and pharmaceutical industries. There is a growing awareness in society about the potential of marine organisms to deliver bioactive compounds. These compounds can be used to produce sustainable and safer functional cosmetics to improve the quality of food products and serve as source of new chemical structures for the development of new pharmaceutical drugs.One of the challenges of using seaweed in the development of new food products is to avoid using high amounts that could lead to unpleasant sensory properties in food. Using seaweed extracts is a way to get around this problem. With this protocol, we were able to develop pasta, wheat, add nutritional value by incorporating whole algae.Usually, the addition of these ingredients provides less common sensory properties. However, with the developed formulation, a consumer acceptance was still achieved.

Антимикробная активность
При интерпретации полученных результатов следует иметь в виду, что чем выше процент ингибирования, тем больше эффективность экстракта в ингибировании роста данного конкретного штамма и, следователь...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Seaweed's Bioactive Compounds for Sustainable Innovations in Industries at JoVE.com

Здесь мы опишем несколько протоколов, направленных на комплексную оценку Gracilaria gracilis: сбор дикорастущих видов, выращивание в домашних условиях и экстракция биологически активных ингредиентов. Оценивается антиоксидантное, антимикробное и цитотоксическое действие экстрактов, а также оценка питательности и стабильности пищи, обогащенной биомассой и пигментами цельных морских водорослей.

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we ...

Наши исследования сосредоточены на поиске новых биологически активных соединений из морских водорослей, которые могут быть полезны в различных секторах, таких как пищевая, косметическая и фармацевтическая промышленность. В обществе растет осведомленность о потенциале морских организмов для доставки биологически активных соединений. Эти соединения могут быть использованы для производства устойчивой и безопасной функциональной косметики для улучшения качества пищевых продуктов и служить источником новых химических структур для разработки новых фармацевтических препаратов.Одна из проблем использования морских водорослей при разработке новых пищевых продуктов заключается в том, чтобы избежать использования больших количеств, которые могут привести к неприятным органолептическим свойствам пищи. Использование экстрактов морских водорослей – способ обойти эту проблему. С помощью этого протокола мы смогли разработать макароны, пшеницу, повысить питательную ценность за счет включения цельных водорослей.Обычно добавление этих ингредиентов обеспечивает менее распространенные органолептические свойства. Тем не менее, с разработанной рецептурой все же было достигнуто признание потребителями.

valorization-red-seaweed-gracilaria-gracilis-through-biorefinery

Research

JoVE Journal

Biology

Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach

The interest in seaweeds as an abundant feedstock to obtain valuable and multitarget bioactive ingredients is continuously growing. In this work, we explore the potential of Gracilaria gracilis, an edible red seaweed cultivated worldwide for its commercial interest as a source of agar and other ingredients for cosmetic, pharmacological, food, and feed applications.
G. gracilis growth conditions were optimized through vegetative propagation and sporulation while manipulating the physicochemical conditions to achieve a large biomass stock. Green extraction methodologies with ethanol and water were performed over the seaweed biomass. The bioactive potential of extracts was assessed through a set of in vitro assays concerning their cytotoxicity, antioxidant, and antimicrobial properties. Additionally, dried seaweed biomass was incorporated into pasta formulations to increase food&#39;s nutritional value. Pigments extracted from G. gracilis have also been incorporated into yogurt as a natural colorant, and their stability was evaluated. Both products were submitted to the appreciation of a semi-trained sensorial panel aiming to achieve the best final formulation before reaching the market.
Results support the versatility of G. gracilis whether it is applied as a whole biomass, extracts and/or pigments. Through implementing several optimized protocols, this work allows the development of products with the potential to profit the food, cosmetic, and aquaculture markets, promoting environmental sustainability and a blue circular economy.
Moreover, and in line with a biorefinery approach, the residual seaweed biomass will be used as biostimulant for plant growth or converted to carbon materials to be used in water purification of the in-house aquaculture systems of MARE-Polytechnic of Leiria, Portugal.

Here, we describe several protocols aiming at an integrated valorization of Gracilaria gracilis: wild species harvesting, in-house growth, and extraction of bioactive ingredients. The extracts&#39; antioxidant, antimicrobial, and cytotoxic effects are evaluated, along with the nutritional and stability assessment of food enriched with whole seaweed biomass and pigments.

Extraction of the Bioactive Ingredients from Gracilaria gracilis

Экстракция биологически активных ингредиентов из Gracilaria gracilis  

To begin, grow Gracilaria gracilis in 250 milliliters of flat bottom flasks in a climatic room. Once the biomass has been scaled up, dried, and ground, weigh the resulting dried biomass. Dissolve it in 100 milliliters of solvent and mix by stirring in a vessel protected from light for 30 minutes.Perform extractions with ethanol and water separately at room temperature. Filter the liquid extracts through filter paper to separate them from the remaining biomass. Centrifuge the extracts at 8, 000 G for 10 minutes, at room temperature.Freeze dry the aqueous extracts and use a rotary evaporator at 40 degrees Celsius to evaporate the ethanol extracts.

Экстракция биологически активных ингредиентов из Gracilaria gracilis

Evaluation of the Antioxidant and Cytotoxic Effects of Gracilaria gracilis Extracts

Оценка антиоксидантного и цитотоксического действия экстрактов Gracilaria gracilis  

To begin, take the aqueous and ethanol extracts obtained from the dried Gracilaria gracilis. In a 96 well microplate, dispense two microliters of each sample and 198 microliters of DPPH dissolved in absolute ethanol. Then, using a microplate spectrophotometer, measure the absorbance at 517 nanometers.Take the human keratinocytes grown in 96 well plates overnight. Add two microliters of the DMSO dissolved extracts to 198 microliters of the medium in microplate wells. Remove the culture medium.Add 100 microliters of MTT to the cells and incubate in the dark for 30 minutes. To solubilize the intracellular formazan crystals, add 100 microliters of DMSO. Using a microplate reader, measure the absorbance at 570 nanometers.The DPPH test demonstrated that the temperature of 40 degrees Celsius showed higher inhibition values of oxidant activity compared to extracts obtained at room temperature or 70 degrees Celsius. No cytotoxic effects were observed on human keratinocytes, suggesting that at the maximum assay concentration, both aqueous and ethanol extracts are safe for cutaneous use.

Оценка антиоксидантного и цитотоксического действия экстрактов Gracilaria gracilis

Pasta Production Using Gracilaria gracilis, Nutritional Evaluation, and Sensory Evaluation

Производство макаронных изделий с использованием Gracilaria gracilis, оценка пищевой ценности и органолептической оценки  

To begin, combine predefined portions of rice flour, gracilaria gracilis, and chlorella vulgaris in the equipment, and add approximately 30%water to the mixture. After a few minutes of mixing, followed by extruding the pasta, using the equipment, cut it manually. To produce chifferi, dry the pasta at 68 degrees Celsius for 42 minutes, followed by an additional five hours and 30 minutes at 76 degrees Celsius, simulating an industrial process.Finally, vacuum seal the samples and store them in a dark place at room temperature. Take one gram sample in a glass crucible with a filter bottom and position it in the fiber analyzer. Add 150 milliliters of preheated 1.25%sulfuric acid, and two milliliters of anti-foaming agent to the column of each crucible.Remove the solvent and rinse the crucible three times with deionized water to prepare the sample for the basic hydrolysis. After washing the crucibles three times with 150 milliliters of acetone, carefully transfer those to an oven set at 150 degrees Celsius for one hour. Record the final weight.Transfer the crucibles to a muffle furnace, set at 500 degrees Celsius for three hours, and then record the final weight. To determine the fatty acids profile, add two milliliters of 2%sulfuric acid solution in methanol to a 50 milligram sample. Heat the mixture at 80 degrees Celsius for two hours.Then, cool the mixture to room temperature and add one milliliter of ultrapure water and two milliliters of N-heptane to each sample. After vortexing the mixture for one minute, centrifuge it for five minutes. Later, recover the upper N-heptane phase containing the fatty acid methyl esters and transfer it to gas chromatography vials.Analyze the samples in a gas chromatograph equipped with a TR-FAME capillary column, an auto sampler, and a flame ionization detector. Determine the fatty acid profile by comparing the resulting retention times with a standard. Incubate porcelain crucibles for three hours at 105 degrees Celsius.Allow them to cool in a desiccator, and then record their weights. After incubating 10 grams of the sample, as demonstrated previously, calculate its moisture content using the displayed equation. Then, transfer the crucibles with the dried samples to an incinerator heated to 525 degrees Celsius for four hours.After cooling the samples, record their weight. To assess consumer acceptance, use chifferi pasta samples cooked in distilled water for eight minutes. Conduct sensory tests in individual sensory booths located in a sensory analysis laboratory.Evaluate the visual appearance, color, texture, odor, sea taste, overall taste, overall evaluation, and purchase intent of the samples. The pasta received ratings of five and six on a hedonic scale of one to nine for sea taste and visual appearance, respectively. The pasta had a purchase intention score of five and an overall appreciation score of six.

Производство макаронных изделий с использованием Gracilaria gracilis, оценка пищевой ценности и органолептической оценки

Incorporation of Seaweed Extract in Yogurt and Color Stability Evaluation 

Включение экстракта морских водорослей в йогурт и оценка стабильности цвета   

To begin, add 50 milliliters of sodium phosphate buffer to one gram of Gracilaria gracilis. After homogenizing the mixture, use a mortar and pestle to macerate the sample for 10 minutes. Transfer the solution to a tube and centrifuge it for 20 minutes at 12298g.After combining the supernatant, slowly add 65%ammonium sulfate, then pellet the precipitate by centrifugation and dissolve it in distilled water. Perform dialysis of the extract using a tubing membrane against water for 24 hours, followed by freeze drying. To incorporate the extract, mix it in yogurt at a concentration of 0.21%Store the samples in individual glass flasks at 4 degrees Celsius until analysis.To check the color stability of the extract in yogurt, calibrate the colorimeter using a white ceramic plate. Fill a cell with approximately 28 grams of the sample and analyze its color. The color stability of the yogurts with pigment was evaluated for 12 days at 4 degrees celsius.The incorporation of the extracts in yogurts showed good color attention with a color difference of 7.01 plus or minus 2.36 after 12 days of storage.