Name: מחבר זרקור: קידום ניתוח מבנה חלבונים לפיתוח תרופות
Uploaded: 2024-03-08T13:30:00
Duration: 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Protein Structure Analysis for Drug Development at JoVE.com

אנו מודים למדעני מקור אור היהלום ולחברי צוות התמיכה הרבים שתרמו לתכנון, לבנייה ולתפעול של קו האלומה של VMXi. אנו אסירי תודה למשתמשי beamline, שתרמו רעיונות בהמשך לפיתוח צינורות ההתגבשות ואיסוף הנתונים. מתקן ההתגבשות בהארוול נתמך על ידי Diamond Light Source Ltd, מכון רוזלינד פרנקלין והמועצה למחקר רפואי.

התגבשות אוטומטית של חלבונים ואיסוף נתונים בזמן אמת

<ol>
	<li>Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20+years+of+crystal+hits:+Progress+and+promise+in+ultrahigh-throughput+crystallization+screening.">20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).</li><li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+room+temperature+crystallography.">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1 (2021).</li><li>Helliwell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+structural+chemistry+of+the+living+organism+at+its+temperature+and+pressure.">What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).</li><li>Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biomolecular+structures+near+room+temperature+using+x-ray+crystallography:+Concepts,+methods+and+future+optimization.">Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).</li><li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+cryocooling+distorts+conformational+heterogeneity+in+a+model+michaelis+complex+of+dhfr.">Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr.</a> Structure. 22 (6), 899-910 (2014).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+ligand+binding+of+endothiapepsin+by+'temperature-resolved'+macromolecular+crystallography.">Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).</li><li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vmxi:+A+fully+automated,+fully+remote,+high-flux+in+situ+macromolecular+crystallography+beamline.">Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).</li><li>Jacquamet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+vapor+diffusion+crystallization+drops+with+an+x-ray+beam.">Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam.</a> Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).</li><li>Mikolajek, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-to-structure+pipeline+for+ambient-temperature+in+situ+crystallography+at+vmxi.">Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi.</a> IUCrJ. 10, 420-429 (2023).</li><li>Douangamath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+efficient+fragment+screening+at+xchem+facility+at+diamond+light+source.">Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source.</a> Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ispyb:+An+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchweb:+A+modern+interface+for+ispyb.">Synchweb: A modern interface for ispyb.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).</li><li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito&#174;:+An+accurate+nanoliter+dispensing+technology.">Mosquito&#174;: An accurate nanoliter dispensing technology.</a> JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).</li><li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xia2.Multiplex:+A+multi-crystal+data-analysis+pipeline.">Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).</li><li>Winter, G., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+for+macromolecular+crystallography.">Automated data collection for macromolecular crystallography.</a> Methods. 55 (1), 81-93 (2011).</li><li>Jumper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+accurate+protein+structure+prediction+with+alphafold.">Highly accurate protein structure prediction with alphafold.</a> Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dials+as+a+toolkit.">Dials as a toolkit.</a> Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תיארנו את ההליך המלא מהגעת דגימת חלבון ב- CF ועד להורדת הנתונים הסופיים על ידי המשתמש ליישומים נוספים. שלבים קריטיים הם ייצור דגימת חלבון איכותית ומסכי גבישים מתאימים, בין אם באמצעות מסכי מטריצה דלילים מסחריים או מסכי אופטימיזציה המבוססים על תנאים שנקבעו. תהליך זה עשוי להתרחש ב- CF, או שהמשתמשים יכולים לבצע את הליכי ההתגבשות במעבדות הביתיות ולהביא לוחות התגבשות מתאימים לקו הקורה. זיהוי פרמטרים מתאימים לאיסוף נתונים עשוי להיות חשוב עבור דגימות מסוימות, במיוחד כאשר קיים חשש לנזקי קרינה. ברוב המקרים, עיבוד נתונים אוטומטי מספיק לחלוטין כדי לענות על השאלה המדעית, אם כי המשתמשים שומרים על היכולת לעבד מחדש באמצעות כלי אלומה, למשל, כאשר קבוצת החלל מעורפלת או רק החלק הראשוני של הנתונים שנאספו משמש כדי למזער את השפעות נזקי הקרינה.
אם גבישים מתאימים אינם מיוצרים מניסויי התגבשות ראשוניים, ניתן לבחון שינויים בריכוז, בטוהר או במסכי התגבשות, כמו גם בשימוש בזריעת גבישים. אם גבישים אינם מתפצלים לרזולוציה שימושית בקו האלומה, ניתן להשתמש בסריקות רשת עם קרן לא מאוישת כדי להעריך את גבול העקיפה האינהרנטי ואת תא היחידה של הגבישים כדי להנחות את מאמצי האופטימיזציה. גבישים קטנים מדי לאיסוף נתונים בתוך לוחות (למשל, <10 מיקרומטר) עשויים במקום זאת להתאים לקריסטלוגרפיה טורית או לניסויי ננו פוקוס (למשל, בקרן יהלום VMXm). פתרון מבנים באמצעות נתוני VMXi הוא בדרך כלל פשוט על ידי החלפה מולקולרית, במיוחד מאז הופעתו של Alphafold16 כדי לתת מודלים יעילים לחיפוש. אם פעולה זו אינה מצליחה, ניתן לקצור גבישים ולהתקרר בהקפאה מלוחות כדי לאפשר עקיפה חריגה קונבנציונלית באורך גל יחיד, עקיפה חריגה רב-אורכית או ניסויי פאזינג באורכי גל ארוכים.
יתרונותיה של שיטה זו כוללים את היכולת לקבל מערכי נתונים ומשוב מהירים ואיכותיים ישירות מלוחות התגבשות ללא צורך להפריע לגבישים מהסביבות בהן גדלו. מה שמכונה "רנסנס טמפרטורת החדר" בביולוגיה מבנית מציב פרמיה על מבנים המתקבלים בתנאים לא קריוגניים כדי לאפשר יותר רלוונטיות פיזיולוגית ודינמיקה של חלבונים להיחקר2. בדרך כלל, מושגת רזולוציה מעט נמוכה יותר מאשר עבור גביש קריו-מקורר אופטימלי, אך רק כאשר נקבעו תנאי קריו-קירור מתאימים ואם הגבישים עמידים לטיפול מכני ולפתיחה של טיפת ההתגבשות3. יישום עתידי שעבורו צינור זה מתאים מאוד הוא סינון בקנה מידה גדול של קומפלקסים של ליגנד חלבונים או קמפיינים של פרגמנטים בטמפרטורת החדר בגילוי תרופות. ליגנדות או שברים יכולים להיות מגובשים או מוספים על ידי פיפטה או פליטת טיפה אקוסטית לפני איסוף נתונים בטמפרטורת החדר. יישום נוסף הוא למדוד במהירות נתונים ממאות או אלפי גבישים בצורה יעילה ביותר ולאחר מכן להשתמש בתוכנת DIALS17 multiplex14 כדי לחלץ צבירים איזומורפיים שעשויים לייצג ישויות ביולוגיות שונות או לקבוע הבדלים מובהקים סטטיסטית בין אוכלוסיות של גבישים שטופלו בדרך שונה או נחשפו לליגנדות או אותות שונים.

קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן נותרה כלי מפתח להבנת המבנה והתפקוד של חלבונים, ומספקת מבנים ברזולוציה גבוהה של חלבונים או קומפלקסים שלהם עם, למשל, מצעים או מועמדים לתרופה. עם זאת, במקרים רבים, השגת גבישים בעלי תכונות רצויות - דיפוזיה גבוהה, צורה גבישית הניתנת להשריה וללא פתולוגיות גבישיות כגון תאומים - נותרת צוואר בקבוק ניכר1. מכיוון שתנאים כימיים מתאימים לייצור גבישי חלבונים אינם ניתנים לחיזוי, באופן כללי, סינון התגבשות החוקר אלפי תערובות כימיות פוטנציאליות הוא סטנדרטי, לעתים קרובות בסיוע אוטומציה/רובוטיקה בהגדרת מסכים ומלונות גבישים לצורך ניטור, לעתים קרובות מרחוק, של תמונות טיפות ההתגבשות המוקלטות.
כאשר מופיעים גבישים, בדרך כלל יש לקצור אותם מסביבת ההתגבשות באמצעות ניילון או לולאת קפטון ולאחר מכן, להעביר אותם לטיפה המכילה חומר הגנה קריו-פרוטקטיבי (שהחיפוש אחריו הוא משתנה נוסף) לפני שהם צוללים-קופאים לחנקן נוזלי. שלבים נוספים אלה בין התגבשות ואיסוף נתוני רנטגן יכולים לכלול התייבשות של טיפת ההתגבשות כאשר הסביבה האטומה שלה נשברת, לחצים מכניים על הגביש בעת הטיפול בו, ונזק מחומרי ההגנה הקריוגרטיים לסריג הגביש (בדרך כלל כתוצאה מכך התפשטות פסיפס מוגברת) בין גורמים אחרים2. בנוסף, קצירת גבישים דורשת זמן ועבודה רבה ועלולה להוביל לחוסר הומוגניות בין הדגימות, במיוחד כאשר העור נוצר על טיפות במהלך תהליך הקציר. אלומת VMXi מעניקה גישה לנתונים שמישים מגבישים הדבוקים לצלחת, שאחרת היו מושלכים לאיסוף נתונים.
הרוב המכריע של מבני גבישי קרני רנטגן נקבעים ב 100K באמצעות הגישה לעיל, המאפשרת הובלה וטיפול גבישי פשוט ומאריך את חיי הגביש בקרן הרנטגן בסדרי גודל. עם זאת, יש עניין גובר בקביעת מבנים בתנאים לא קריוגניים, כלומר, הרבה יותר קרוב לתנאים הפיזיולוגיים הרלוונטיים לתפקוד חלבון 2,3,4. זה מאפשר הערכה הרבה יותר טובה של המבנה הדינמי של חלבונים, מונע קונפורמציות של חומצות אמינו או לולאות להיות מוקפאות במצבים פונקציונליים לא רלוונטיים5, ומאפשר לחקור את קשירת הליגנד בתנאים הרבה יותר קרובים לאלה בסביבה הטבעית של החלבון בתוך התא והאורגניזם6.
גישה חלופית, המיושמת ב-VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ) בסינכרוטרון של מקור אור יהלום, בריטניה, היא למדוד את נתוני העקיפה ישירות מגבישים בסביבה שבה הם גדלו (כלומר, בתוך לוח ההתגבשות), בתנאי סביבה וללא הפרעה 7,8. זה מאפשר משוב מהיר מאוד ממסכי התגבשות ואופטימיזציות כדי להנחות את המשתמש לצורה גבישית אופטימלית לדרישותיו. הוא גם מאפשר לייצר מבנים באיכות גבוהה בטמפרטורת החדר באופן אוטומטי9.
פרוטוקול זה מניח שלמשתמש יש דגימת חלבון טהורה ביותר המוכנה להתגבשות. אנו מתארים את חוויית המשתמש בגישה למתקן ההתגבשות בהארוול כדי לייצר גבישי חלבון, ולאחר מכן משתמשים ב-VMXi של אלומה לאיסוף נתונים (איור 1).
מתקן ההתגבשות בהארוול
מתקן ההתגבשות בהארוול (CF) ממוקם במתחם המחקר בהארוול (RCaH) בסמוך למקור אור היהלום. המתקן מציע למשתמשים מעבדה אוטומטית בתפוקה גבוהה להתגבשות מקרומולקולרית, תוך שימוש ברובוטיקה לסינון קריסטליזציה, אופטימיזציה של גבישים, דימות גבישי ואפיון. באמצעות אינטגרציה הדוקה עם קו האלומה האוטומטי ביותר של VMXi, קצב קביעת מבני טמפרטורת החדר הואץ מאוד ומאפשר אפיון של מבני חלבונים חדשים, קומפלקסים של ליגנד חלבונים וליגנד DNA, כמו גם סינון מקטעים אוטומטי (איור 1), והכל בתנאים לא קריוגניים.
צינור CF הוא חבילת מכשור הכוללת רובוטים להתגבשות ננוליטר9 להתגבשות חלבונים מסיסים וממברנלים, רובוטים לטיפול בנוזלים להכנת מסכי התגבשות מסחריים ומסכי אופטימיזציה מותאמים אישית מורכבים, וארבעה מכשירי הדמיה (אחד ב-4°C ושלושה ב-20°C להדמיית לוחות התגבשות (ראו טבלת החומרים). מכשיר הדמיה אחד מסוגל להדמיה של לוחות זכוכית מסוג שלב מעוקב שומנים (LCP) ומכשיר הדמיה אחד מצויד באופטיקה רב-פלואורסצנטית (שניהם בטמפרטורה של 20°C).
המתקן נמצא כיום בשימוש נרחב על ידי ספקטרום רחב של משתמשים אקדמיים ותעשייתיים, כולל מעבדת חלבון הממברנה (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), מתקן הקרנת שברי XChem 10, אלומות MX, רכזת XFEL, כמו גם מכון רוזלינד פרנקלין (RFI). צנרת מבוססת וממוטבת זו אפשרה לבצע ניסויי התגבשות במגוון רחב של פרויקטים בתחום הביולוגיה המבנית. מאמר זה מתאר את הצינור עבור גבישים המיועדים לאיסוף נתונים ב-VMXi, אם כי ניתן גם לקצור גבישים ולקרר אותם בהקפאה או להפנות אותם לצנרת XChem.
גישת המשתמשים מוקצית באמצעות מערכת ההצעות Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) ומשתמשים תעשייתיים נתמכים באמצעות קבוצת הקישור לתעשיית היהלומים. כל המשתמשים יכולים להגיע לאתר עם הדגימות או הצלחות שלהם, אשר ניתן להעביר ביד. לא מומלץ לשלוח צלחות באמצעות שליח מכיוון שהניסיון שלנו מצביע על כך שטיפות יכולות להתרחק מהמקום בו חולקו, או שהטיפות עלולות להיפגע ממאגר ההתגבשות. לחלופין, על פי הסדר, משתמשים יכולים לשלוח את דגימות החלבון שלהם ל-CF, שם חברי הצוות עורכים ניסויי התגבשות מטעמם. הניסויים יכולים להיות מנוטרים מרחוק על ידי המשתמש על ידי כניסה לאינטרנט Rock Maker במקרה של CF או באמצעות ISPyB במקרה של VMXi. הגישה ל-CF יכולה להתבצע באופן איטרטיבי בהתבסס על תוצאות עקיפה של קרני רנטגן שנאספו בדיאמונד.
Beamline VMXi ב-Diamond Light Source
Beamline VMXi (להלן "קו האלומה") הוא מכשיר ייחודי שפותח לאחרונה המוקדש במלואו לקריסטלוגרפיה אוטומטית ביותר של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר, עם דגש על מדידת נתונים מגבישים בתוך לוחות התגבשות מתאימים. קו האלומה מציע מיקרו פוקוס (10 x 10 מיקרומטר), קרן ורודה (מעבר פס של <5 × 10-2ΔE/E) עם שטף גבוה של ~2 × 1013 פוטונים לשנייה (ב 16 KeV)7. אלומת שטף גבוהה זו, יחד עם גלאי מהיר, מאפשרת תפוקה גבוהה מאוד של דגימות ואיסוף נתונים מדגימות בגודל של למעלה מ-10 מיקרומטר.
לוחות התגבשות נכנסים לקו האלומה על ידי אחסון במערכת אחסון לדוגמה ומצולמים על פי לוח הזמנים שסופק על ידי המשתמש בעת רישום הלוחות באמצעות ממשק ISPyB11 SynchWeb12. בדרך כלל, מומלץ למשתמשים לבחור רצף פיבונאצ'י של נקודות זמן להדמיה (0, 12, 24, 36, 60... 7,320 שעות מכניסת הצלחת למערכת). המשתמש מקבל הודעה בדוא"ל לאחר צילום לוחית. הן אור נראה והן הדמיית אור UV זמינים למשתמשים לפי דרישה. התמונות שצולמו על ידי מערכת אחסון הדגימות מנותחות על ידי אלגוריתם למידת מכונה; פעולה זו מאתרת ומגדירה באופן אוטומטי נקודות עניין של אובייקטים הדומים לגבישים ורושמת את נקודות העניין המוכנות להוספה לתור לאיסוף נתונים. משתמשים יכולים גם ללחוץ ידנית על תמונות האור הנראה כדי לרשום נקודות עניין או יכולים ללחוץ ולגרור אזור לניתוח על ידי סריקת רסטר. נקודות אלה זמינות למשתמשים כדי להוסיף לתור לצד הנקודות הממוקמות באופן אוטומטי.
ברגע שלכל הדגימות יש פרמטרים מתאימים לאיסוף נתונים, הלוח נכנס לתור. כאשר הצלחת מגיעה לראש התור, היא מועברת אוטומטית לקו הקורה. לוחות ההתגבשות נטענים ממלונות הגביש אל קו האלומה באופן אוטומטי על ידי זרוע רובוטית, ולאחר התאמת תמונות נמדדים מערכי נתונים קריסטלוגרפיים של עד 60° סיבוב מכל גביש שנבחר בהתאם להוראות שהוגדרו על-ידי המשתמש. ניתן להשתמש בכל הטיפות בתוך צלחת לניסויים אלה על קו הקורה. הנתונים מתמזגים מגבישים מרובים כדי לייצר ערכות נתונים איזומורפיות הממוזגות בצורה אופטימלית באופן אוטומטי 7,9. לאחר איסוף כל ערכות הנתונים בתור, המשתמש נשלח הודעת דוא"ל עם קישור לעקוב אחריו כדי להציג את ערכות הנתונים ב- ISPyB11, כמו באלומות אחרות של Diamond MX. המשתמשים מופנים גם לדף האינטרנט beamline (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>Liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulatrix imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>Crystallisation plate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CrystalQuick X&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>Z617644</td>
			<td>Crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gryphon&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>620-1000-10&#160;</td>
			<td>Crystalisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiTeGen Insitu-1</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>InSitu-01CL-40</td>
			<td>Crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito LCP&#160;</td>
			<td>(SPT Labtech)</td>
			<td>on request</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager &#38; Maker</td>
			<td>Formualtrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>
			Software for Imager 
 [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scorpion</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>640-1000-10&#160;</td>
			<td>
			Liquid handling robot 
			https://www.artrobbins.com/scorpion
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and in situ room temperature data collection using the crystallization facility at harwell and beamline vmxi, diamond light source

פרוטוקולים להתגבשות חלבונים רובוטיים באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול ואיסוף נתוני טמפרטורת החדר באתרם מלוחות התגבשות ב- Diamond Light Source beamline VMXi מתוארים. גישה זו מאפשרת לקבוע מבנים גבישיים באיכות גבוהה בטמפרטורת החדר מגבישים מרובים בצורה פשוטה ומספקת משוב מהיר מאוד על תוצאות ניסויי התגבשות וכן מאפשרת קריסטלוגרפיה סדרתית. הערך של מבנים בטמפרטורת החדר בהבנת מבנה החלבון, קשירת ליגנדים ודינמיקה הופך מוכר יותר ויותר בקהילת הביולוגיה המבנית. צינור זה נגיש למשתמשים מכל רחבי העולם עם מספר מצבי גישה זמינים. ניסויי התגבשות המוגדרים ניתנים לצילום ולצפייה מרחוק באמצעות גבישים המזוהים באופן אוטומטי באמצעות כלי למידת מכונה. הנתונים נמדדים במערכת מבוססת תור עם ערכות נתונים של עד 60° סיבוב מגבישים שנבחרו על-ידי המשתמש בלוח. נתונים מכל הגבישים בתוך באר מסוימת או קבוצת מדגם מתמזגים באופן אוטומטי באמצעות xia2.multiplex כאשר היציאות נגישות ישירות באמצעות ממשק דפדפן אינטרנט.

X-ray crystallography remains a key tool for understanding protein structure and function, providing high-resolution structures of proteins or their complexes with, for example, substrates or drug candidates. In many cases, however, obtaining crystals with desirable properties - highly diffracting, crystal form amenable to soaking and without crystal pathologies such as twinning - remains a considerable bottleneck1. As suitable chemical conditions to produce protein crystals cannot, in general, be predicted, crystallization screening exploring thousands of potential chemical mixtures is standard, often aided by automation/robotics in setting screens and crystal hotels for monitoring, often remotely, the crystallization drop images that are recorded.
When crystals appear, typically they must be harvested from the crystallization environment using a nylon or Kapton loop and then, transferred to a droplet containing a cryoprotection agent (the search for which is an additional variable) before plunge-freezing into liquid nitrogen. These additional steps between crystallization and X-ray data collection can involve dehydration of the crystallization drop when its sealed environment is broken, mechanical stresses on the crystal when it is handled, and damage from the cryoprotection agents to the crystal lattice (typically resulting in increased mosaic spread) amongst other factors2. In addition, crystal harvesting is time- and labor-intensive and can lead to inhomogeneity between samples, especially when skin forms on drops during the harvesting process. The VMXi beamline gives access to useable data from crystals that are stuck to the plate, which would otherwise be discarded for data collection.
The vast majority of X-ray crystal structures are determined at 100K using the above approach, enabling straightforward crystal transport and handling and increasing crystal lifetime in the X-ray beam by orders of magnitude. There is increasing interest, however, in determining structures under non-cryogenic conditions, that is, much closer to the physiological conditions relevant to protein function2,3,4. This enables a much better appreciation of the dynamic structure of proteins, avoids amino acid conformations or loops being frozen out in functionally non-relevant states5, and enables ligand binding to be explored under conditions much closer to those in the protein&#39;s natural environment within the cell and organism6.
An alternative approach, implemented at the Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline at the Diamond Light Source synchrotron, UK, is to measure the diffraction data directly from crystals within the environment in which they have grown (i.e., within the crystallization plate), under ambient conditions and without disturbance7,8. This enables very rapid feedback from crystallization screens and optimizations to guide a user to an optimal crystal form for their requirements. It also enables high-quality room-temperature structures to be produced in an automated manner9.
This protocol assumes that a user has a highly pure protein sample ready for crystallization. We describe the user experience accessing the Crystallization Facility at Harwell to produce protein crystals and then use beamline VMXi for data collection (Figure 1).
The Crystallization Facility at Harwell
The Crystallization Facility at Harwell (CF) is located in the Research Complex at Harwell (RCaH) adjacent to the Diamond Light Source. The facility offers users a high-throughput automated laboratory for macromolecular crystallization, using robotics for crystallization screening, crystal optimization, crystal imaging, and characterization. Through close integration with the highly automated VMXi beamline, the pace of determining room temperature structures has greatly accelerated and enables the characterization of novel protein structures, protein-ligand and DNA-ligand complexes, as well as automated fragment screening (Figure 1), all under non-cryogenic conditions.
The CF pipeline is a suite of instrumentation encompassing nanoliter crystallization robots9 for the crystallization of soluble and membrane proteins, liquid handling robots to prepare commercial crystallization screens and complex custom optimization screens, and four imaging instruments (one at 4 &#176;C and three at 20 &#176;C for the imaging of crystallization plates (see the Table of Materials). One imager is capable of imaging lipid cubic phase (LCP) glass plates and one imager is equipped with multi-fluorescence optics (both at 20 &#176;C).
The facility is now used widely by a broad spectrum of academic and industrial users, including the Membrane Protein Laboratory (MPL;https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), the XChem fragment screening facility 10, MX beamlines, the XFEL-hub, as well as the Rosalind Franklin Institute (RFI). This well-established and optimized pipeline has enabled crystallization experiments to be performed across a wide spectrum of structural biology projects. This paper describes the pipeline for crystals intended for data collection at VMXi, although crystals may also be harvested and cryo-cooled or directed to the XChem pipeline.
User access is allocated through the Diamond MX proposal system (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) and industrial users are supported through the Diamond Industry Liaison group. All users can come to the site with their sample(s) or plates, which can be transported by hand. It is not recommended to send plates by courier as our experience suggests that drops can move away from the location in which they were dispensed, or drops may be damaged by the crystallization reservoir. Alternatively, by arrangement, users can send their protein samples to the CF, where members of staff set up crystallization experiments on their behalf. The experiments can be monitored remotely by the user by either logging on to Rock Maker Web in the case of CF or via ISPyB in the case of VMXi. Access to the CF can be carried out in an iterative fashion based on the X-ray diffraction results collected at Diamond.
Beamline VMXi at Diamond Light Source
Beamline VMXi (hereafter referred to as &#34;the beamline&#34;) is a unique and recently developed instrument fully dedicated to room-temperature, highly automated X-ray crystallography with a focus on measuring data from crystals within suitable crystallization plates. The beamline offers a micro focus (10 x 10 &#181;m), pink beam (band pass of &#60;5 &#215; 10-2&#916;E/E) with a high flux of ~2 &#215; 1013 photons/s (at 16 KeV)7. This high-flux beam, coupled with a fast detector, enables very high throughput of samples and collection of data from samples upwards of 10 &#181;m in size.
Crystallization plates enter the beamline by being stored in a sample storage system and imaged based on the schedule provided by the user while registering the plates using the ISPyB11 interface SynchWeb12. Typically, users are advised to select a Fibonacci sequence of time points for imaging (0, 12, 24, 36, 60&#8230;7,320 h from the plate being entered into the system). The user is informed by email once a plate has been imaged. Both visible light and UV light imaging are available to users on demand. The images taken by the sample storage system are analyzed by a machine learning algorithm; this automatically locates and defines points of interest of objects that resemble crystals and registers the points of interest ready for the user to add to a queue for data collection. Users may also manually click on the visible light images to register points of interest or can click and drag a region to be analyzed by raster scan. These points are available to users to add to the queue alongside the automatically located points.
Once all samples have appropriate parameters for data collection, the plate enters a queue. When the plate reaches the top of the queue, it is automatically dispensed to the beamline. The crystallization plates are loaded from the crystal hotels into the beamline automatically by a robotic arm, and following image matching, crystallographic data sets of up to 60&#176; rotation are measured from each selected crystal as per user defined instructions. All drops within a plate may be used for these experiments on the beamline. Data are merged from multiple crystals to produce isomorphous, optimally merged data sets in an automated manner7,9. Once all of the queued data sets are collected, the user is sent an email with a link to follow to view the data sets in ISPyB11, as in other Diamond MX beamlines. Users are also directed to the beamline web page (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).&#160;

מחבר זרקור: קידום ניתוח מבנה חלבונים לפיתוח תרופות 

התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source

Understanding the three dimensional structures of proteins underpins drug design, biotechnology, and our understanding of many different diseases. VMXI determines protein structures without cryo cooling, so much closer to their natural temperatures. VMXI also measures diffraction data from protein crystals while still in their crystallization plates, avoiding any damage from mechanical handling.In the future, we really want to exploit the incredible throughput of VMXI to explore large populations of crystals to identify lots of different structural states rather than the single structure people often obtain now. We also want to push towards drug development and carrying out fragment screening and optimization within crystallization plates. A new approach that shows enormous promise.

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Protein Structure Analysis for Drug Development at JoVE.com

אנו מציגים פרוטוקול להתגבשות חלבונים באמצעות מתקן ההתגבשות במתחם המחקר בהארוול ולאחר מכן באתרו איסוף נתונים קריסטלוגרפיים מקרני רנטגן מגבישים בתוך הלוחות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית רב-תכליתית באתרו (VMXi) של דיאמונד. אנו מתארים דרישות לדוגמה, פרוטוקולי התגבשות והנחיות לאיסוף נתונים.

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from ...

הבנת המבנים התלת-ממדיים של חלבונים עומדת בבסיס תכנון תרופות, ביוטכנולוגיה והבנתנו של מחלות רבות ושונות. VMXI קובע את מבני החלבונים ללא קירור קריו, הרבה יותר קרוב לטמפרטורות הטבעיות שלהם. VMXI מודד גם נתוני עקיפה מגבישי חלבונים בעודם בלוחות ההתגבשות שלהם, ונמנע כל נזק מטיפול מכני.בעתיד, אנחנו באמת רוצים לנצל את התפוקה המדהימה של VMXI כדי לחקור אוכלוסיות גדולות של גבישים כדי לזהות הרבה מצבים מבניים שונים במקום המבנה היחיד שאנשים מקבלים לעתים קרובות עכשיו. אנחנו גם רוצים לדחוף לכיוון פיתוח תרופות וביצוע סינון מקטעים ואופטימיזציה בתוך לוחות התגבשות. גישה חדשה שמראה הבטחה עצומה.

crystallization-situ-room-temperature-data-collection-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from crystallization plates at Diamond Light Source beamline VMXi are described. This approach enables high-quality room-temperature crystal structures to be determined from multiple crystals in a straightforward manner and provides very rapid feedback on the results of crystallization trials as well as enabling serial crystallography. The value of room temperature structures in understanding protein structure, ligand binding, and dynamics is becoming increasingly recognized in the structural biology community. This pipeline is accessible to users from all over the world with several available modes of access. Crystallization experiments that are set up can be imaged and viewed remotely with crystals identified automatically using a machine learning tool. Data are measured in a queue-based system with up to 60&#176; rotation datasets from user-selected crystals in a plate. Data from all the crystals within a particular well or sample group are automatically merged using xia2.multiplex with the outputs straightforwardly accessed via a web browser interface.

We present a protocol for the crystallization of proteins using the crystallization facility in the Research Complex at Harwell and subsequent in situ X-ray crystallographic data collection from crystals within the plates at Diamond&#39;s Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We describe sample requirements, crystallization protocols, and data collection guidelines.