Name: 저자 스포트라이트: 약물 개발을 위한 단백질 구조 분석의 발전
Uploaded: 2024-03-08T13:30:00
Duration: 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Protein Structure Analysis for Drug Development at JoVE.com

VMXi 빔라인의 설계, 시공 및 운영에 기여한 많은 Diamond Light Source 과학자와 지원 팀원에게 감사드립니다. 나중에 결정화 및 데이터 수집 파이프라인 개발에 아이디어를 제공한 빔라인 사용자에게 감사드립니다. Harwell의 결정화 시설은 Diamond Light Source Ltd, Rosalind Franklin Institute 및 Medical Research Council의 지원을 받습니다.

자동화된 단백질 결정화 및 실시간 데이터 수집

<ol>
	<li>Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20+years+of+crystal+hits:+Progress+and+promise+in+ultrahigh-throughput+crystallization+screening.">20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).</li><li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+room+temperature+crystallography.">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1 (2021).</li><li>Helliwell, J. 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(171), (2021).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ispyb:+An+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchweb:+A+modern+interface+for+ispyb.">Synchweb: A modern interface for ispyb.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).</li><li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito&#174;:+An+accurate+nanoliter+dispensing+technology.">Mosquito&#174;: An accurate nanoliter dispensing technology.</a> JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).</li><li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xia2.Multiplex:+A+multi-crystal+data-analysis+pipeline.">Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).</li><li>Winter, G., Mcauley, K. 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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

CF에 단백질 샘플이 도착하는 것부터 추가 응용을 위해 사용자가 최종 데이터를 다운로드하는 것까지의 전체 절차를 설명했습니다. 중요한 단계는 상용 희소 매트릭스 스크린 또는 확립된 조건에 기반한 최적화 스크린을 사용하여 고품질 단백질 샘플과 적절한 결정 스크린을 생산하는 것입니다. 이 공정은 CF에서 수행되거나 사용자가 가정 실험실에서 결정화 절차를 수행하고 빔라인에 적합한 결정화 플레이트를 가져올 수 있습니다. 적절한 데이터 수집 매개변수의 식별은 특정 샘플, 특히 방사선 손상이 우려되는 경우에 중요할 수 있습니다. 대부분의 경우, 자동화된 데이터 처리만으로도 과학적 질문에 답할 수 있지만, 예를 들어 공간 그룹이 모호하거나 방사선 손상 영향을 최소화하기 위해 수집된 데이터의 초기 부분만 사용되는 경우와 같이 빔라인 도구를 사용하여 재처리할 수 있는 기능을 보유합니다.
초기 결정화 시험에서 적합한 결정이 생성되지 않으면 단백질 농도, 순도 또는 결정화 스크린의 변화를 탐색할 수 있으며 결정 파종의 사용도 가능합니다. 결정이 빔라인에서 유용한 분해능으로 회절되지 않는 경우, 감쇠되지 않은 빔과 함께 그리드 스캔을 사용하여 결정의 고유한 회절 한계 및 단위 셀을 평가하여 최적화 노력을 안내할 수 있습니다. 플레이트 내에서 데이터를 수집하기에는 너무 작은 결정(예: <10μm)은 대신 연속 결정학 또는 나노 초점 실험(예: 다이아몬드 빔라인 VMXm)에 적합할 수 있습니다. VMXi 데이터를 사용하여 구조를 해결하는 것은 일반적으로 분자 교체를 통해 간단하며, 특히 효과적인 검색 모델을 제공하기 위해 Alphafold16 이 등장한 이후 더욱 그렇습니다. 이것이 성공적이지 않은 경우, 플레이트에서 결정을 수확하고 극저온 냉각하여 기존의 단일 파장 이상 회절, 다중 파장 이상 회절 또는 장파장 위상 실험을 가능하게 할 수 있습니다.
이 방법의 장점은 결정이 성장한 환경에서 결정을 방해할 필요 없이 결정화 플레이트에서 직접 신속한 고품질 데이터 세트와 피드백을 얻을 수 있다는 것입니다. 구조 생물학에서 소위 '실온 르네상스'는 생리학적 관련성과 단백질 역학을 더 많이 탐구할 수 있도록 비극저온 조건에서 얻은 구조를 중요시합니다2. 일반적으로 최적화된 극저온 냉각 결정보다 약간 낮은 분해능이 달성되지만 적절한 극저온 조건이 설정되고 결정이 결정화 드롭의 기계적 취급 및 개방에 강건한 경우에만 달성됩니다3. 이 파이프라인이 매우 적합한 향후 응용 분야는 약물 발견에서 실온에서 단백질-리간드 복합체 또는 단편 캠페인의 대규모 스크리닝입니다. 리간드 또는 단편은 실온 데이터 수집 전에 피펫 또는 음향 방울 배출에 의해 공결정화되거나 추가될 수 있습니다. 또 다른 응용은 매우 효율적인 방식으로 수백 또는 수천 개의 결정체로부터 데이터를 신속하게 측정한 다음, DIALS17 멀티플렉스(14 ) 소프트웨어를 사용하여 상이한 생물학적 실체를 나타낼 수 있는 동형 클러스터를 추출하거나, 상이한 방식으로 처리되거나 상이한 리간드 또는 신호에 노출된 결정의 집단 간에 통계적으로 유의한 차이를 확립하는 것이다.

X선 결정학은 단백질 구조와 기능을 이해하기 위한 핵심 도구로, 단백질 또는 복합체의 고분해능 구조와 기질 또는 약물 후보 물질을 제공합니다. 그러나, 많은 경우에, 바람직한 특성(회절이 심하고, 침지가 가능한 결정 형태이며, 쌍둥이와 같은 결정 병리학이 없는)을 갖는 결정을 얻는 것은 상당한 병목 현상으로 남아 있다1. 단백질 결정을 생성하기 위한 적절한 화학적 조건은 일반적으로 예측할 수 없기 때문에 수천 가지의 잠재적 화학 혼합물을 탐색하는 결정화 스크리닝이 표준이며, 종종 자동화/로봇 공학의 도움을 받아 모니터링을 위한 스크린 및 크리스탈 호텔을 모니터링하고, 종종 원격으로 결정화 드롭 이미지를 모니터링합니다.
결정이 나타나면 일반적으로 나일론 또는 Kapton 루프를 사용하여 결정화 환경에서 수확한 다음 액체 질소에 담그기 전에 동결 방지제가 포함된 액적(검색은 추가 변수임)으로 옮겨야 합니다. 결정화와 X선 데이터 수집 사이의 이러한 추가 단계에는 밀봉된 환경이 파괴될 때 결정화 방울의 탈수, 취급 시 결정에 가해지는 기계적 응력, 동결 보호제에서 결정 격자에 대한 손상(일반적으로 모자이크 확산 증가)이 포함될 수 있습니다2. 또한 결정 채취는 시간과 노동 집약적이며, 특히 채취 과정에서 입자에 피부가 형성될 때 시료 간에 불균일성이 발생할 수 있습니다. VMXi 빔라인은 플레이트에 부착된 크리스탈에서 사용 가능한 데이터에 액세스할 수 있도록 하며, 그렇지 않으면 데이터 수집을 위해 폐기됩니다.
대부분의 X선 결정 구조는 위의 접근 방식을 사용하여 100K에서 측정되므로 간단한 결정 수송 및 취급이 가능하고 X선 빔의 결정 수명이 수십 배로 늘어납니다. 그러나 비극저온 조건, 즉 단백질 기능 2,3,4와 관련된 생리학적 조건에 훨씬 더 가까운 구조를 결정하는 데 관심이 증가하고 있습니다. 이를 통해 단백질의 동적 구조를 훨씬 더 잘 이해할 수 있고, 아미노산 형태 또는 루프가 기능적으로 관련이 없는 상태로 얼어붙는 것을 방지할 수 있으며5, 리간드 결합을 세포와 유기체 내 단백질의 자연 환경에 훨씬 더 가까운 조건에서 탐색할 수 있습니다6.
영국 Diamond Light Source 싱크로트론의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 구현된 대안적인 접근법은 결정이 성장한 환경(즉, 결정화 플레이트 내) 내에서 주변 조건 하에서 방해 없이 결정에서 직접 회절 데이터를 측정하는 것입니다 7,8. 이를 통해 결정화 스크린 및 최적화에서 매우 빠른 피드백을 통해 사용자가 요구 사항에 맞는 최적의 결정 형태를 찾을 수 있도록 안내할 수 있습니다. 또한 고품질 실온 구조물을 자동화된 방식으로 생산할 수 있다9.
이 프로토콜은 사용자가 결정화 준비가 된 고순도 단백질 샘플을 가지고 있다고 가정합니다. 단백질 결정을 생산한 다음 데이터 수집을 위해 빔라인 VMXi를 사용하기 위해 Harwell의 결정화 시설에 액세스하는 사용자 경험을 설명합니다(그림 1).
Harwell의 결정화 시설
Harwell(CF)의 결정화 시설은 Diamond Light Source에 인접한 Harwell(RCaH)의 Research Complex에 있습니다. 이 시설은 결정화 스크리닝, 결정 최적화, 결정 이미징 및 특성화를 위해 로봇 공학을 사용하여 고분자 결정화를 위한 고처리량 자동화 실험실을 사용자에게 제공합니다. 고도로 자동화된 VMXi 빔라인과의 긴밀한 통합을 통해 실온 구조 결정 속도가 크게 빨라졌으며 비극저온 조건에서 새로운 단백질 구조, 단백질-리간드 및 DNA-리간드 복합체의 특성 분석과 자동화된 단편 스크리닝(그림 1)이 가능합니다.
CF 파이프라인은 용해성 및 막 단백질의 결정화를 위한 나 노리터 결정화 로봇9, 상업용 결정화 스크린 및 복잡한 맞춤형 최적화 스크린을 준비하기 위한 액체 처리 로봇, 결정화 플레이트의 이미징을 위한 4개의 이미징 장비(4°C에서 1개, 20°C에서 3개)를 포함하는 계측 제품군입니다( 재료 표 참조).). 이미저 1개는 지질 입방상(LCP) 유리판을 이미징할 수 있고 이미저 1개에는 다중 형광 광학 장치(둘 다 20°C)가 장착되어 있습니다.
이 시설은 현재 MPL(Membrane Protein Laboratory; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem 단편 스크리닝 설비( 10), MX 빔라인, XFEL-허브, 및 로잘린드 프랭클린 연구소(RFI)도 포함된다. 이 잘 정립되고 최적화된 파이프라인은 광범위한 구조 생물학 프로젝트에서 결정화 실험을 수행할 수 있게 해주었습니다. 이 백서에서는 VMXi에서 데이터 수집을 위한 크리스털의 파이프라인에 대해 설명하지만, 크리스털을 수확하여 극저온 냉각하거나 XChem 파이프라인으로 보낼 수도 있습니다.
사용자 액세스는 Diamond MX 제안 시스템(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html)을 통해 할당되며 산업 사용자는 Diamond Industry Liaison 그룹을 통해 지원됩니다. 모든 사용자는 손으로 운반할 수 있는 샘플 또는 플레이트를 가지고 현장에 올 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면 방울이 분배된 위치에서 멀어지거나 결정화 저장소에 의해 방울이 손상될 수 있으므로 택배로 플레이트를 보내는 것은 권장하지 않습니다. 또는 협의에 따라 사용자가 단백질 샘플을 CF로 보낼 수 있으며, CF에서 직원이 대신 결정화 실험을 설정할 수 있습니다. 실험은 사용자가 Rock Maker Web(CF의 경우) 또는 ISPyB(VMXi의 경우)에 로그온하여 원격으로 모니터링할 수 있습니다. CF에 대한 접근은 Diamond에서 수집된 X선 회절 결과를 기반으로 반복적인 방식으로 수행될 수 있습니다.
다이아몬드 광원의 빔라인 VMXi
Beamline VMXi(이하 "빔라인"이라고 함)는 적절한 결정화 플레이트 내의 결정에서 데이터를 측정하는 데 중점을 둔 실온의 고도로 자동화된 X선 결정학 전용으로 최근에 개발된 고유한 기기입니다. 빔라인은 ~2 ×10 13 photons/s(16 KeV에서)7의 높은 플럭스와 함께 마이크로 초점(10 x 10 μm), 분홍색 빔(<5 × 10-2ΔE/E의 대역 통과)을 제공합니다. 이 고플럭스 빔은 고속 검출기와 결합되어 매우 높은 시료 처리량과 10μm 이상의 시료에서 데이터 수집을 가능하게 합니다.
결정화 플레이트는 샘플 저장 시스템에 저장되고 ISPyB11 인터페이스 SynchWeb12를 사용하여 플레이트를 등록하는 동안 사용자가 제공한 일정에 따라 이미징되어 빔라인으로 들어갑니다. 일반적으로 사용자는 이미징을 위해 피보나치 시점 시퀀스를 선택하는 것이 좋습니다(0, 12, 24, 36, 60... 시스템에 들어가는 플레이트로부터 7,320시간). 플레이트가 이미지화되면 사용자에게 이메일로 알림이 전송됩니다. 가시광선과 UV 광선 이미징 모두 사용자가 필요에 따라 사용할 수 있습니다. 샘플 저장 시스템에서 촬영한 이미지는 기계 학습 알고리즘에 의해 분석됩니다. 이렇게 하면 크리스탈과 유사한 개체의 관심 영역을 자동으로 찾아 정의하고 사용자가 데이터 수집을 위해 큐에 추가할 수 있도록 관심 영역을 등록합니다. 또한 사용자는 가시광선 이미지를 수동으로 클릭하여 관심 지점을 등록하거나 래스터 스캔으로 분석할 영역을 클릭하고 드래그할 수 있습니다. 이러한 포인트는 사용자가 자동으로 찾은 포인트와 함께 대기열에 추가할 수 있습니다.
모든 샘플에 데이터 수집을 위한 적절한 파라미터가 있으면 플레이트가 대기열에 들어갑니다. 플레이트가 대기열의 맨 위에 도달하면 자동으로 빔라인에 분배됩니다. 결정화 플레이트는 로봇 팔에 의해 크리스탈 호텔에서 빔라인으로 자동으로 로드되며, 이미지 매칭 후 사용자 정의 지침에 따라 선택한 각 크리스탈에서 최대 60° 회전의 결정학적 데이터 세트를 측정합니다. 플레이트 내의 모든 방울은 빔라인에서 이러한 실험에 사용할 수 있습니다. 데이터는 여러 결정에서 병합되어 자동화된 방식으로 동형, 최적으로 병합된 데이터 세트를 생성합니다 7,9. 대기 중인 모든 데이터 세트가 수집되면 다른 Diamond MX 빔라인과 마찬가지로 ISPyB11에서 데이터 세트를 보기 위해 따라야 할 링크가 포함된 이메일이 사용자에게 전송됩니다. 또한 사용자는 빔라인 웹 페이지(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html)로 이동합니다.

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>Liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulatrix imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>Crystallisation plate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CrystalQuick X&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>Z617644</td>
			<td>Crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gryphon&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>620-1000-10&#160;</td>
			<td>Crystalisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiTeGen Insitu-1</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>InSitu-01CL-40</td>
			<td>Crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito LCP&#160;</td>
			<td>(SPT Labtech)</td>
			<td>on request</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager &#38; Maker</td>
			<td>Formualtrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>
			Software for Imager 
 [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scorpion</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>640-1000-10&#160;</td>
			<td>
			Liquid handling robot 
			https://www.artrobbins.com/scorpion
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and in situ room temperature data collection using the crystallization facility at harwell and beamline vmxi, diamond light source

Harwell의 결정화 시설을 사용한 로봇 단백질 결정화 프로토콜과 Diamond Light Source beamline VMXi의 결정화 플레이트에서 현장 실온 데이터 수집에 대해 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 여러 결정에서 고품질 실온 결정 구조를 간단한 방식으로 결정할 수 있으며 결정화 시험 결과에 대한 매우 빠른 피드백을 제공할 뿐만 아니라 연속 결정학을 가능하게 합니다. 단백질 구조, 리간드 결합 및 역학을 이해하는 데 있어 실온 구조의 가치는 구조 생물학 커뮤니티에서 점점 더 인정받고 있습니다. 이 파이프라인은 여러 가지 사용 가능한 액세스 모드를 통해 전 세계 사용자가 액세스할 수 있습니다. 설정된 결정화 실험은 기계 학습 도구를 사용하여 자동으로 식별된 결정으로 원격으로 이미지화하고 볼 수 있습니다. 데이터는 플레이트에서 사용자가 선택한 결정에서 최대 60° 회전 데이터 세트가 있는 대기열 기반 시스템에서 측정됩니다. 특정 웰 또는 샘플 그룹 내의 모든 결정의 데이터는 xia2.multiplex를 사용하여 자동으로 병합되며, 출력은 웹 브라우저 인터페이스를 통해 직접 액세스할 수 있습니다.

X-ray crystallography remains a key tool for understanding protein structure and function, providing high-resolution structures of proteins or their complexes with, for example, substrates or drug candidates. In many cases, however, obtaining crystals with desirable properties - highly diffracting, crystal form amenable to soaking and without crystal pathologies such as twinning - remains a considerable bottleneck1. As suitable chemical conditions to produce protein crystals cannot, in general, be predicted, crystallization screening exploring thousands of potential chemical mixtures is standard, often aided by automation/robotics in setting screens and crystal hotels for monitoring, often remotely, the crystallization drop images that are recorded.
When crystals appear, typically they must be harvested from the crystallization environment using a nylon or Kapton loop and then, transferred to a droplet containing a cryoprotection agent (the search for which is an additional variable) before plunge-freezing into liquid nitrogen. These additional steps between crystallization and X-ray data collection can involve dehydration of the crystallization drop when its sealed environment is broken, mechanical stresses on the crystal when it is handled, and damage from the cryoprotection agents to the crystal lattice (typically resulting in increased mosaic spread) amongst other factors2. In addition, crystal harvesting is time- and labor-intensive and can lead to inhomogeneity between samples, especially when skin forms on drops during the harvesting process. The VMXi beamline gives access to useable data from crystals that are stuck to the plate, which would otherwise be discarded for data collection.
The vast majority of X-ray crystal structures are determined at 100K using the above approach, enabling straightforward crystal transport and handling and increasing crystal lifetime in the X-ray beam by orders of magnitude. There is increasing interest, however, in determining structures under non-cryogenic conditions, that is, much closer to the physiological conditions relevant to protein function2,3,4. This enables a much better appreciation of the dynamic structure of proteins, avoids amino acid conformations or loops being frozen out in functionally non-relevant states5, and enables ligand binding to be explored under conditions much closer to those in the protein&#39;s natural environment within the cell and organism6.
An alternative approach, implemented at the Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline at the Diamond Light Source synchrotron, UK, is to measure the diffraction data directly from crystals within the environment in which they have grown (i.e., within the crystallization plate), under ambient conditions and without disturbance7,8. This enables very rapid feedback from crystallization screens and optimizations to guide a user to an optimal crystal form for their requirements. It also enables high-quality room-temperature structures to be produced in an automated manner9.
This protocol assumes that a user has a highly pure protein sample ready for crystallization. We describe the user experience accessing the Crystallization Facility at Harwell to produce protein crystals and then use beamline VMXi for data collection (Figure 1).
The Crystallization Facility at Harwell
The Crystallization Facility at Harwell (CF) is located in the Research Complex at Harwell (RCaH) adjacent to the Diamond Light Source. The facility offers users a high-throughput automated laboratory for macromolecular crystallization, using robotics for crystallization screening, crystal optimization, crystal imaging, and characterization. Through close integration with the highly automated VMXi beamline, the pace of determining room temperature structures has greatly accelerated and enables the characterization of novel protein structures, protein-ligand and DNA-ligand complexes, as well as automated fragment screening (Figure 1), all under non-cryogenic conditions.
The CF pipeline is a suite of instrumentation encompassing nanoliter crystallization robots9 for the crystallization of soluble and membrane proteins, liquid handling robots to prepare commercial crystallization screens and complex custom optimization screens, and four imaging instruments (one at 4 &#176;C and three at 20 &#176;C for the imaging of crystallization plates (see the Table of Materials). One imager is capable of imaging lipid cubic phase (LCP) glass plates and one imager is equipped with multi-fluorescence optics (both at 20 &#176;C).
The facility is now used widely by a broad spectrum of academic and industrial users, including the Membrane Protein Laboratory (MPL;https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), the XChem fragment screening facility 10, MX beamlines, the XFEL-hub, as well as the Rosalind Franklin Institute (RFI). This well-established and optimized pipeline has enabled crystallization experiments to be performed across a wide spectrum of structural biology projects. This paper describes the pipeline for crystals intended for data collection at VMXi, although crystals may also be harvested and cryo-cooled or directed to the XChem pipeline.
User access is allocated through the Diamond MX proposal system (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) and industrial users are supported through the Diamond Industry Liaison group. All users can come to the site with their sample(s) or plates, which can be transported by hand. It is not recommended to send plates by courier as our experience suggests that drops can move away from the location in which they were dispensed, or drops may be damaged by the crystallization reservoir. Alternatively, by arrangement, users can send their protein samples to the CF, where members of staff set up crystallization experiments on their behalf. The experiments can be monitored remotely by the user by either logging on to Rock Maker Web in the case of CF or via ISPyB in the case of VMXi. Access to the CF can be carried out in an iterative fashion based on the X-ray diffraction results collected at Diamond.
Beamline VMXi at Diamond Light Source
Beamline VMXi (hereafter referred to as &#34;the beamline&#34;) is a unique and recently developed instrument fully dedicated to room-temperature, highly automated X-ray crystallography with a focus on measuring data from crystals within suitable crystallization plates. The beamline offers a micro focus (10 x 10 &#181;m), pink beam (band pass of &#60;5 &#215; 10-2&#916;E/E) with a high flux of ~2 &#215; 1013 photons/s (at 16 KeV)7. This high-flux beam, coupled with a fast detector, enables very high throughput of samples and collection of data from samples upwards of 10 &#181;m in size.
Crystallization plates enter the beamline by being stored in a sample storage system and imaged based on the schedule provided by the user while registering the plates using the ISPyB11 interface SynchWeb12. Typically, users are advised to select a Fibonacci sequence of time points for imaging (0, 12, 24, 36, 60&#8230;7,320 h from the plate being entered into the system). The user is informed by email once a plate has been imaged. Both visible light and UV light imaging are available to users on demand. The images taken by the sample storage system are analyzed by a machine learning algorithm; this automatically locates and defines points of interest of objects that resemble crystals and registers the points of interest ready for the user to add to a queue for data collection. Users may also manually click on the visible light images to register points of interest or can click and drag a region to be analyzed by raster scan. These points are available to users to add to the queue alongside the automatically located points.
Once all samples have appropriate parameters for data collection, the plate enters a queue. When the plate reaches the top of the queue, it is automatically dispensed to the beamline. The crystallization plates are loaded from the crystal hotels into the beamline automatically by a robotic arm, and following image matching, crystallographic data sets of up to 60&#176; rotation are measured from each selected crystal as per user defined instructions. All drops within a plate may be used for these experiments on the beamline. Data are merged from multiple crystals to produce isomorphous, optimally merged data sets in an automated manner7,9. Once all of the queued data sets are collected, the user is sent an email with a link to follow to view the data sets in ISPyB11, as in other Diamond MX beamlines. Users are also directed to the beamline web page (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).&#160;

저자 스포트라이트: 약물 개발을 위한 단백질 구조 분석의 발전 

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

Understanding the three dimensional structures of proteins underpins drug design, biotechnology, and our understanding of many different diseases. VMXI determines protein structures without cryo cooling, so much closer to their natural temperatures. VMXI also measures diffraction data from protein crystals while still in their crystallization plates, avoiding any damage from mechanical handling.In the future, we really want to exploit the incredible throughput of VMXI to explore large populations of crystals to identify lots of different structural states rather than the single structure people often obtain now. We also want to push towards drug development and carrying out fragment screening and optimization within crystallization plates. A new approach that shows enormous promise.

결정화 설비와 VMXi 빔라인은 다양한 프로젝트 유형 및 사용 사례에 사용되어 왔습니다. 다음은 사용자가 추구할 수 있는 것을 설명하기 위한 몇 가지 예입니다.
사례 연구 1: 표준 데이터 수집
빔라인은 결정화 플레이트 내의 소수의 결정에서 실온 결정 구조를 신속하게 측정할 수 있습니다. 결정의 최소 수는 공간 그룹 및 결정 방향에 따라 달라지지만 수십 개의 결정의 데이터를 병합하여 향상된 데이터 품질을 얻을 수 있지만 종종 1-4입니다. 최근의 예로는 빔라인 표준 중 하나인 thaumatin이 있습니다. 그림 8A에 표시된 여러 크리스탈은 프로토콜 섹션 2.3에 설명된 대로 데이터 수집을 위해 수동으로 마크업되었습니다. 이 크리스탈은 프로토콜 섹션 2.4에 설명된 대로 대기열에 추가되었으며 실험 매개변수는 드롭다운 목록에서 선택되었습니다. 실험 매개변수가 적용되면 플레이트는 데이터 수집을 위해 대기열에 배치되었습니다. 데이터 세트는 프로토콜 섹션 3에 설명된 대로 xia2.multiplex 파이프라인을 사용하여 수집, 자동 크기 조정 및 병합되었습니다. SynchWeb의 출력 예는 그림 8A 중간에 나와 있습니다. 5개의 병합된 데이터 세트는 1.66 Å 해상도의 데이터 세트를 생성했습니다. 우물에서 약 5개의 결정에 대한 표준 데이터 수집의 경우 데이터 세트는 2.5분 이내에 수집되었습니다.
사례 연구 2: 리간드 결합 – Mac1 단백질을 사용한 단편 실험
실온에서 단백질-리간드 복합체의 구조를 생성하는 것은 빔라인을 사용하여 간단하게 달성할 수 있습니다. 리간드는 결정화 플레이트의 액적에 첨가할 수 있으며(수동 또는 음향 액적 주입) 적절한 배양 시간 후에 측정된 데이터를 얻을 수 있습니다. 여기에 설명된 예에서, 일련의 단편을 결정화 플레이트에서 단백질 nsp3(Mac-1)의 SARS-CoV-2 첫 번째 거대영역의 결정을 포함하는 웰에 분주했습니다. 동일한 단편을 포함하는 웰 중 2개는 프로토콜 단계 2.5에 설명된 대로 그룹으로 할당되었습니다. 프로토콜 단계 2.3 및 2.4에 설명된 대로 데이터 수집을 위해 다중 결정(42)을 표시했으며 표준 매개변수(60° 회전, 0.1° 단계, 0.00178초 노출, 5% 투과, 결정당 16KeV)를 사용하여 데이터 세트를 수집했습니다(그림 8B). 두 유정의 데이터 세트는 xia2.dials 파이프라인을 사용하여 자동으로 처리되었으며, 이후 xia2.multiplex 파이프라인이 시작되어 이러한 데이터 세트 중 22개를 자동으로 병합했습니다. 그런 다음 이러한 파이프라인의 출력에서 DIMPLE을 실행하고 결합된 조각의 증거를 명확하게 보여주는 맵을 생성했습니다. 단편 모델은 점유되지 않은 밀도에 내장되어 더욱 개선되었습니다(그림 8B 오른쪽). 이 일련의 단계를 사용하여 실온 리간드 결합 구조를 쉽게 측정하여 구조 기반 약물 설계 프로세스에 귀중한 정보와 피드백을 제공할 수 있습니다. 여러 우물에 걸쳐 42개의 결정으로 구성된 이 데이터 수집의 경우 데이터 세트가 10분 이내에 수집되었습니다.
사례 연구 3: 낮은 대칭 공간 그룹과 선호 방향을 가진 구조 솔루션 판과 같은 형태를 가진 여러 결정의 스택은 c형 가스 결합 시토크롬을 사용한 결정화 실험에서 생성되었습니다(그림 8C). X선 빔에 단결정만 있는 스택 가장자리 주변의 여러 위치를 선택함으로써 단사정(C2) 공간 그룹에도 불구하고 4개의 결정에서 쐐기를 병합하여 1.75Å 해상도의 우수한 품질의 데이터 세트를 얻을 수 있었습니다. 이를 통해 결정화 조건을 더욱 최적화할 필요 없이 프로젝트를 빠르게 진행할 수 있었습니다. 이 결과는 이전에설명되었습니다 9. 우물에 있는 4개의 결정에 대한 이 데이터 수집의 경우 데이터 세트는 2분 이내에 수집되었습니다.
사례 연구 4: 연속 결정학을 사용하여 플레이트의 미세결정에서 정보 및 실온 구조 획득
종종 미세결정이 방울에 나타나거나 사용자가 싱크로트론 또는 XFEL 소스에서 연속 결정학 실험의 전구체로서 미세 결정화 프로토콜을 배치로 최적화하려고 할 때 최소한의 재료를 사용하여 다양한 시험의 회절 특성 및 단위 셀 크기에 대한 신속한 피드백을 얻는 것이 매우 유용합니다. 이 사용 사례에서는 배치로 성장하는 라이소자임의 미결정을 결정화 플레이트(방울당 200nL 부피)에 피펫으로 연결하고 10μm 단계 크기의 그리드 스캔을 사용하여 8개의 방울에서 데이터를 수집했습니다(그림 9). 그 결과 25,906개의 정지 이미지가 직렬 결정학 소프트웨어를 사용하여 처리되어 9,891개의 회절 패턴이 인덱싱 및 병합되어 공개된 실온 구조에 대해 잘 정제된 2.0 Å 해상도의 데이터 세트를 생성했습니다(PDB 8A9D를 사용하여 R작업 = 19.6%, Rfree = 23.6%)(표 1). 이를 통해 단위 셀 분포에 대한 자세한 분석과 시간 분해 연구를 포함한 복잡한 연속 결정학 실험에 투입될 수 있는 미결정 실온 구조 측정이 가능했습니다. 필요한 미결정 현탁액의 총 부피는 1.6μL였습니다. 그리드 스캔을 사용하여 8개의 웰에 걸쳐 마이크로크리스탈의 데이터 수집을 위해 데이터 세트는 40분 이내에 수집되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig1.jpg"> 그림 1: 결정화 스크리닝, 결정화 시설에서의 최적화, VMXi에서 시료 수집 없이 실온에서 자동화된 데이터 수집 및 처리, XChem 단편 스크리닝, 기타 MX 빔라인에서의 데이터 수집을 통합하는 단백질-구조 파이프라인의 개략도. 사용자는 샘플을 공급하거나 플레이트를 VMXi 빔라인으로 가져와 파이프라인을 시작할 수 있습니다. 약어: Versatile Macromolecular Crystallography in situ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig2.jpg"> 그림 2: 결정화 플레이트를 설정하기 위한 Mosquito SPT Labtech 인터페이스. (ᅡ) (1) MiTeGen In Situ-1 설정 보기. (2) 96웰 플레이트 유형으로 이동하여 (3) MiTeGen 플레이트 2 드롭 플레이트를 선택하여 MiTeGen 2 드롭 표준 플레이트를 선택합니다. VMXi에 필요한 드롭 1 및 드롭 2에 대한 정의 매개변수를 변경하려면 (4) 편집 아이콘을 클릭합니다. 그러면 새 창(B)이 열리고 (5) X 및 Y 오프셋을 그림과 같이 변경해야 합니다. (B) 서브 웰 2 및 (C) 서브 웰 3을 선택하고 그에 따라 값을 변경합니다. (D) CrystalQuickX 설정 보기. 96웰 플레이트 유형으로 이동하여 MiTeGen 플레이트 2 드롭 플레이트를 선택하여 CrystalQuickX 2 드롭 표준 플레이트를 선택합니다. VMXi에 필요한 드롭 1 및 드롭 2에 대한 정의 매개변수를 변경하려면 위와 동일하게 편집 아이콘을 클릭합니다. 그러면 그림과 같이 X 및 Y 오프셋을 변경해야 하는 (E,F) 새 창이 열립니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig3.jpg"> 그림 3: VMXi 발송물을 생성하고, 플레이트를 등록하고, 연락처 세부 정보를 확인하는 방법을 보여주는 SynchWeb 인터페이스. (A) 드롭다운 메뉴, (B,C) 새 발송물 등록, (D) 새 컨테이너 등록, (E) 플레이트 정보 입력, (F) 연락처 세부 정보 확인, (G) 제안서 내에 등록된 컨테이너 목록에서 SynchWeb 인터페이스에 정보를 업로드하는 다양한 단계의 스크린샷이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig4.jpg"> 그림 4: SynchWeb을 사용하여 데이터 수집을 위한 샘플 선택 및 준비. SynchWeb 인터페이스를 사용하여 데이터 수집을 위해 샘플을 준비하는 다양한 단계를 보여주는 일련의 스크린샷이 표시됩니다. (A) 관심 지점과 영역은 드롭 개요에서 선택됩니다. 이 패널의 하단에는 한 방울의 연대순 사진 시리즈가 있습니다. (B) '크리스탈' 범주에 대한 결과를 강조 표시하는 한 플레이트에 대한 CHiMP 출력의 예. (C) 선택한 포인트 및 영역 목록에서 대기열에 샘플을 추가하고 (D) 빔라인에서 생성된 실험 설정의 드롭다운 목록에서 대기열에 있는 샘플에 데이터 수집을 위한 매개변수를 적용합니다. 실험 파라미터가 없는 샘플(빨간색)과 파라미터를 올바르게 적용한 샘플(상단 및 하단)의 차이를 확인합니다. 이 패널의 하단에는 빔라인에서 수집할 플레이트를 대기열에 넣는 대기열 컨테이너(Queue Container ) 버튼이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig5.jpg"> 그림 5: SynchWeb에서 샘플 그룹 생성. 샘플 그룹을 만드는 다양한 단계를 보여 주는 일련의 스크린샷입니다. (A) 샘플이 들어 있는 플레이트는 관련 배송에서 선택되고 (B) 플레이트 내의 방울이 선택됩니다. 이러한 드롭은 개별 드롭일 수도 있고 행 및/또는 열로 선택할 수도 있습니다. (C) 이미 생성된 샘플 그룹 목록입니다. (D) 마지막 3개의 멀티플렉스 처리 작업의 출력이 나열되며 처리 파이프라인의 통계를 표시하도록 선택할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig6.jpg"> 그림 6: 데이터 처리 및 데이터 축소. (A) ISPyB11에서 처리된 데이터 세트의 스크린샷. 재처리 기능에 액세스할 수 있는 버튼이 강조 표시됩니다. 샘플 ID 및 실험 파라미터는 왼쪽 상단에 표시되고 회절 이미지 뷰어는 중간에 표시됩니다. 이 이미지를 클릭하면 다양한 이미지를 검사할 수 있는 대화형 창이 열립니다. 크리스탈 이미지 뷰어는 오른쪽에 표시되며 이 이미지를 클릭하면 빔라인과 Formulatrix 스토리지 이미지를 비교할 수 있는 대화형 창도 열립니다. 이미지별 분석 플롯은 맨 오른쪽에 표시되며 이 이미지를 클릭하면 이 출력의 확대된 버전이 열립니다. 자동 처리 탭을 클릭하면 자동 처리가 표시되고 다른 파이프라인의 결과를 쉽게 비교할 수 있습니다. 탭을 클릭하여 다른 처리 파이프라인 간에 전환하고 선택한 파이프라인의 자세한 출력을 봅니다. 데이터 다운로드를 위한 Logs & Files 버튼이 강조 표시됩니다. 다운스트림 처리 탭을 클릭하면 확장되어 적절한 경우 사후 데이터 감소 파이프라인을 통해 실행되는 모든 데이터 세트에 대한 결과가 제공됩니다. (B) 샘플 그룹 관리 화면의 스크린샷. 사용자 정의 그룹 이름은 맨 위에 있으며 포함된 우물에 대한 시각적 설명은 아래에서 볼 수 있습니다. 녹색 우물은 해당 방울에서 측정된 모든 결정이 그룹에 포함됨을 나타냅니다. 해당 그룹에서 수행된 다양한 멀티플렉스 작업에 대한 요약을 볼 수 있으며 그 아래에는 멀티플렉스의 자세한 출력이 있습니다. 포함된 실험을 검사할 수 있는 데이터 세트 버튼이 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig7.jpg"> 그림 7: 데이터 재처리 창. (A) 개별 및 (B) 다결정 데이터 세트. 데이터 영역이 선택된 위치에 두 개의 개별 데이터셋이 표시됩니다. 개별적으로 처리(Process individually) 확인란을 선택하면 선택한 회절 이미지가 통합(Integrate ) 버튼을 눌러 개별적으로 처리됩니다. Multi-crystal 버튼을 클릭하면 개별 데이터 세트가 표시됩니다. 여러 데이터셋의 회절 이미지를 재처리하려면 이미지 영역이 표시된 대로 선택되고 강조 표시된 통합 버튼을 클릭하여 재처리가 시작됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig8.jpg"> 그림 8: VMXi 파이프라인의 대표적인 결과. (A) 결정화 방울 내의 단백질 타우마틴에 대한 마크업 결정(왼쪽 패널), 데이터 처리 결과(가운데 패널) 및 전자 밀도(오른쪽 패널). (B) SARS-CoV-2 매크로 도메인에 대한 단편의 결합을 결정하기 위한 다중 결정에 대한 수집. 데이터 세트는 표준 실험 설정을 사용하여 EU-OPENSCREEN 단편 스크린의 단편이 있는 여러 결정에서 수집되었습니다. 이러한 데이터 수집의 예는 SynchWeb에서 발췌한 이 부분에 나와 있습니다. 조각은 해당 밀도로 구성되었으며 오른쪽의 가장 먼 곳에 표시된 것처럼 더욱 정교화되었습니다. (C) 데이터 수집에 사용되는 까다로운 결정화 히트에서 스택의 마크업된 단사정 결정. 녹색 십자 표시와 빨간색 숫자는 10μm 빔과 60° 회전을 사용하여 데이터를 측정한 위치를 나타냅니다. 결과 쐐기 중 4개를 병합하여 1.75 Å 해상도의 데이터 세트를 생성했습니다. 헴기 주변의 전자 밀도가 오른쪽에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig9.jpg"> 그림 9: 결정화 플레이트의 연속 결정학. (A) 관심 영역을 나타내는 흰색 상자가 있는 결정화 방울의 광학 이미지. (B) 그리드 스캔 지점의 정의. (C) 회절을 나타내는 히트 맵. (D) 9,000개 이상의 스틸 회절 패턴에서 연속 결정학 데이터 세트에서 발생하는 전자 밀도 맵. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>분해능(Å)</td>
			<td>완전성(%)</td>
			<td>다양성</td>
			<td>I/σ(나는)</td>
			<td>R스플릿 </td>
			<td>참조1/2 </td>
			<td>고유 관측치</td>
		</tr><tr><td>전반적</td>
			<td>100</td>
			<td>95.5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>0.063</td>
			<td>0.998</td>
			<td>8422</td>
		</tr><tr><td>낮음 (55.55 - 5.43)</td>
			<td>100</td>
			<td>147.1</td>
			<td>81.7</td>
			<td>0.028</td>
			<td>0.999</td>
			<td>488</td>
		</tr><tr><td>높음 (2.03 -2.00)</td>
			<td>100</td>
			<td>75.3</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.092</td>
			<td>0.410</td>
			<td>411</td>
		</tr></tbody></table>표 1: VMXi RT 직렬 데이터 세트에 대한 데이터 통계. 약어: I = 척도화된 관측치의 평균 강도; Rsplit = 측정된 강도의 불일치 측정; CC 1/2 = 데이터 세트의 두 임의 절반 간의 상관 계수.

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당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from ...

단백질의 3차원 구조를 이해하는 것은 약물 설계, 생명공학 및 다양한 질병에 대한 이해를 뒷받침합니다. VMXI는 극저온 냉각 없이 단백질 구조를 측정하므로 자연 온도에 훨씬 더 가깝습니다. VMXI는 또한 결정화 플레이트에 있는 단백질 결정의 회절 데이터를 측정하여 기계적 취급으로 인한 손상을 방지합니다.미래에는 VMXI의 놀라운 처리량을 활용하여 대규모 결정 집단을 탐색하여 현재 사람들이 흔히 얻는 단일 구조가 아닌 다양한 구조 상태를 식별하고자 합니다. 또한 약물 개발과 결정화 플레이트 내에서 단편 스크리닝 및 최적화를 수행하고자 합니다. 엄청난 가능성을 보여주는 새로운 접근 방식입니다.

crystallization-situ-room-temperature-data-collection-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from crystallization plates at Diamond Light Source beamline VMXi are described. This approach enables high-quality room-temperature crystal structures to be determined from multiple crystals in a straightforward manner and provides very rapid feedback on the results of crystallization trials as well as enabling serial crystallography. The value of room temperature structures in understanding protein structure, ligand binding, and dynamics is becoming increasingly recognized in the structural biology community. This pipeline is accessible to users from all over the world with several available modes of access. Crystallization experiments that are set up can be imaged and viewed remotely with crystals identified automatically using a machine learning tool. Data are measured in a queue-based system with up to 60&#176; rotation datasets from user-selected crystals in a plate. Data from all the crystals within a particular well or sample group are automatically merged using xia2.multiplex with the outputs straightforwardly accessed via a web browser interface.

We present a protocol for the crystallization of proteins using the crystallization facility in the Research Complex at Harwell and subsequent in situ X-ray crystallographic data collection from crystals within the plates at Diamond&#39;s Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We describe sample requirements, crystallization protocols, and data collection guidelines.