Name: מחבר זרקור: PGC Cryopreservation – גישה חלופית לשימור ארוך טווח של זני דרוזופילה
Uploaded: 2023-12-01T12:20:00
Duration: 1 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about PGC Cryopreservation – An Alternative Approach Towards Long-Term Preservation of Drosophila Strains at JoVE.com

אנו מודים למרכז המניות KYOTO Drosophila על זני הזבובים. אנו מודים גם לגב' וונדה מיאטה על עריכת כתב היד בשפה האנגלית ולד"ר ג'רמי אלן מאדנז (https://jp.edanz.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) ל- T.T.-S.-K., מענקים (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) מ- AMED ל- S.K., מענק (JP20km0210172) מ- AMED ל- T.T.-S.-K. ו-S.K., מענק סיוע למחקר מדעי (C) (JP19K06780) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) ל-T.T.-S.-K., ומענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (JP18H05552) מ-JSPS ל-S.K.

1. הכנת ציוד
<ol><li>מערכת מיקרומניפולטור: הרכיבו מערכת מיקרומניפולטור כדי לאסוף ולהשתיל תאים (איור 1A).</li>
	<li>שקופיות זכוכית מאוסף PGC (איור 2A)<ol><li>להכנת דבק הפטן, חותכים סרט דו-צדדי באורך של כ-30 ס"מ ומשרים אותו למשך הלילה בתמיסת הפטן טכנית (רגילה) באורך של 7 מ"ל.</li>
		<li>ציירו שני קווי ייחוס מקבילים ליישור העובר בגב שקופית זכוכית.</li>
		<li>מורחים טיפות של דבק הפטן הנ"ל על מגלשת הזכוכית (בצד ללא הקווים) באמצעות פיפטה פסטר. יבשו באוויר את פני השטח של המגלשה עד שהיא הופכת ללבנה.</li>
		<li>חזרו על הוספה ופיזור של טיפות דבק הפטאן וייבשו שוב את המגלשה. הערה: הדבק מונע מתמיסות נוזליות להתפשט על פני השטח השטוח ומקל על העמסת תמיסות מימיות לתוך מחט.</li>
		<li>כדי ליצור מסגרות של בריכת עוברים, הדביקו שלוש שכבות של סרט ויניל סטנדרטי בעובי 0.2 מ"מ, כגון סרט חשמלי, על קרש חיתוך. חותכים את הסרט למלבנים ברוחב 1.5 ס"מ. לאחר מכן, לחתוך את כל שלוש שכבות של קלטת, משאיר מסגרת 2 עד 3 מ"מ. הערה: מסגרת מאגר עוברים מודבקת לאחר יישור עוברים, כדי ליצור מאגר לעוברים.</li>
	</ol></li>
	<li>מחטי השתלה הערה: כל המחטים שהיו זמינות מסחרית בזמן מחקר זה היו צרות מדי או רחבות מדי לשימור בהקפאה של PGC.<ol><li>צור מחט באמצעות נימי זכוכית ומושך. אנו משתמשים במושך NARISHIGE PN-31 כאשר רמת המחמם היא 85.0-98.4, המפלס הראשי של המגנט הוא 57.8 ותת-רמת המגנט היא 45.0.</li>
		<li>כדי ליצור מחט בעובי דופן משוער של 1 מיקרומטר וקצה באורך של כ-200 מיקרומטר בקוטר פנימי של 10-12 מיקרומטר, לטש את קצה המחט בתהליך שלושת השלבים הבא (איור 3). ראשית, טחנו את קצה המחט בזווית של 30° במהירות של 780 סל"ד עד שהקצה יקבל קוטר פנימי של 10-12 מיקרומטר. שלב השחזה הראשון אורך כשעה. הערה: כדי למנוע שבירת קצה המחט, סובב תחילה את אבן השחזה ולאחר מכן העבר בעדינות את המחט כלפי מטה אל אבן השחזה.</li>
		<li>צייר קו על החלק העליון של המחט כדי לעקוב אחר הזווית הרצויה. סובב את המחט נגד כיוון השעון ב-90° ולטש אותה שוב במהירות של 180 סל"ד. זה לוקח בערך 5 דקות.</li>
		<li>סובב את המחט בכיוון השעון 45° ולטש אותה במהירות של 180 סל"ד למשך שנייה אחת.</li>
		<li>הניחו מגלשת זכוכית עם טיפה של תערובת חומצה כרומית (זהירות: רעילה) על במת המיקרוסקופ. חברו את המחט למחזיק הנימים (איור 1D) בזווית של 10°-13° ביחס למשטח ההחלקה, הזיזו בזהירות את המחט כלפי מטה וטבלו את הקצה בתערובת החומצה הכרומית.</li>
		<li>על-ידי משיכה ודחיפה של הבוכנה (איור 1B), העמסה מכנית ופריקה של התמיסה מהמחט מספר פעמים כדי להסיר פסולת זכוכית במחט. הקפידו לנקות גם את הקיר החיצוני.</li>
		<li>שטפו את החלק הפנימי והחיצוני של המחט פעמיים במים מזוקקים כדי להסיר את החומצה הכרומית לחלוטין.</li>
	</ol></li>
</ol>2. איסוף ושימור בהקפאה של PGCs
<ol><li>איסוף עוברים<ol><li>העבירו מספר מתאים של זבובים מהזן התורם המעניין (כ-450 עבור כל מין עבור איסוף העוברים) לתוך איסוף עוברים עם צלחת איסוף עוברים (איור 1E) ודגרו עליהם בטמפרטורה של 25°C. בדרך כלל אנו משתמשים בזבובי הורים בני 3 עד 5 ימים המגודלים בתנאים פחות צפופים בטמפרטורת החדר (23-25 מעלות צלזיוס).</li>
		<li>בצעו שני אוספים מקדימים של 30 דקות והשליכו את כל הביצים שהוטלו. מאחר שהנקבות יכולות לשמור ביציות מופרות שמתפתחות באובידוקט, השלב הזה נדרש כדי לסנכרן את הטלת הביצים בשלב 2.1.3 (איור 4).</li>
		<li>לאחר שני האוספים המוקדמים, אספו את העוברים במשך 50 דקות ולאחר מכן דגרו על העוברים שנאספו בתא לח ב 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לעוברים להתפתח לשלב הבלסטודרם (שלב מוקדם 517). זמן הדגירה הוא בדרך כלל 100 דקות, אולם ניתן להאריך אותו עד 120 דקות, בהתאם למאמץ (איור 4). הערה: תא לחות מיוצר על ידי הנחת מגבת נייר לחה בתחתית קופסת פלסטיק וריסוס שלה בתרסיס מים לפני השימוש. בעוברים בשלב מוקדם 5, היווצרות PGC הושלמה, אך צלולריזציה סומטית לא. השלב המדויק של עובר נקבע תחת מיקרוסקופ מורכב בשלב 2.4.</li>
	</ol></li>
	<li>עוברים dechorionating<ol><li>הפקדת טיפת מים מזוקקים על מסננת רשת נירוסטה (150 רשת, פתח 109 מיקרומטר, קוטר חוט 60 מיקרומטר; איור 1F). בעזרת מלקחיים, אספו עוברים מצלחת איסוף העוברים והכניסו אותם לטיפת המים.</li>
		<li>לחץ על נייר הטישו כנגד המסננת מלמטה כדי לספוג את המים. הוסף טיפות של תמיסת נתרן היפוכלוריט טרייה 5% (בצורת Cl) לעוברים והקש ברציפות על המסננת במשך 10 שניות.</li>
		<li>שטפו את העוברים על ידי התזת מים מזוקקים ישירות ולחצו נייר טישו על המסננת מלמטה כדי לספוג את המים. חזור על שלב זה 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>יישור עוברים דכוריוניים<ol><li>תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש במלקחיים כדי להחזיר עוברים. יישרו את העוברים המכוריוניים בשתי שורות על שקופית זכוכית לאיסוף PGC לאורך שני קווי הייחוס (איור 2A). העוברים מכוונים עם הקדמי שלהם ימינה (הצד שיש לתפעל אותו) והצד הגחוני כלפי מעלה. הערה: שלב זה צריך להסתיים תוך 20 דקות, שבמהלכן אנו בדרך כלל מיישרים כ -40 עוברים.</li>
		<li>הדביקו מסגרת מאגר עוברים סביב העוברים במגלשת הזכוכית של אוסף PGC. טיפה 1 μL של תמיסת CPA (תמיסת Ephrussi-Beadle Ringer אחת, EBR, המכילה 20% אתילן גליקול ו-1 M סוכרוז; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 ו-10 mM Hepes ב-pH 6.9) בשתי נקודות נפרדות באזור המוקף במסגרת ומלאו את הבריכה בשמן סיליקון כדי למנוע מהעוברים להתייבש (איור 2A). הערה: להכנת תמיסת CPA, יש להמיס לחלוטין 10.26 גרם סוכרוז בכ-20 מ"ל של H2O מזוקק המכיל 3 מ"ל של תמיסת EBR 10 x. הוסף 6 מ"ל אתילן גליקול ולאחר מכן הוסף H2O מזוקק עד 30 מ"ל. לאחר ערבוב יסודי, מסננים את התמיסה דרך קרום חד פעמי בקוטר 0.22 מ"מ.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף PGCs<ol><li>הניחו את שקופית הזכוכית של אוסף PGC של שלב 2.3.2 על במה של מיקרוסקופ מצויד במערכת מיקרומניפולטור. חברו את המחט למחזיק הנימים והביאו את העובר הראשון בשורה השמאלית ואת קצה המחט לאותו מישור מוקד. מעמיסים שמן סיליקון לתוך המחט למשך 2-3 שניות.</li>
		<li>התחל איסוף PGC מעוברים בשורה השמאלית. באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 20, הזיזו בעדינות את קצה המחט אל פני השטח של הקצה הקדמי של העובר וחדרו את העובר לכיוון הקצה האחורי, לא על ידי הזזת המחט אלא על ידי הזזת שלב המיקרוסקופ.</li>
		<li>כאשר קצה המחט מגיע לקצה האחורי, משכו מעט את המחט ופרקו לחלוטין כל חלמון במחט ממש בתוך שכבת התא הסומטי.</li>
		<li>תוך שמירה על לחץ קבוע במחט, הזיזו את קצה המחט אל ה-PGCs ממש בתוך הקוטב האחורי ובעדינות, אך מבלי לקחת זמן רב, העמיסו את ה-PGCs.</li>
		<li>משוך את המחט מהעובר במהירות ושחרר חלמון ומזהמים אחרים מהמחט לתוך בריכת שמן הסיליקון, תוך שמירה על PGCs במחט. לאחר מכן, העמיסו שמן סיליקון נקי מהבריכה.</li>
		<li>חזור על שלבים 2.4.2 עד 2.4.5 עבור העוברים האחרים בשורה השמאלית. לפני איסוף PGCs מעובר חדש, הפקידו כמה שיותר משמן הסיליקון הטעון בשלב 2.4.5 בתוך שכבת התא הסומטי תוך שמירה על PGC טעון במחט. הדבר מבטיח כי PGCs שנטענו לאחרונה צמודים ל-PGCs שנאספו בעבר ללא כל חומר מתערב ביניהם.</li>
		<li>לאחר השלמת איסוף PGC מעוברים בשורה השמאלית, יש להפריד את PGC מהחלמון וממזהמים אחרים ככל האפשר. כדי להשיג זאת, הפקידו את כל PGCs במחט על פני השטח של עובר והסירו חלמון או מזהמים אחרים לעובר שכן אחר.</li>
		<li>לאחר מכן, אספו PGCs מעוברים בשורה הימנית. שלב את ה-PGCs שנאספו מהשורה הימנית והשמאלית.</li>
	</ol></li>
	<li>מריחת חומר הגנה קריוגני (CPA) על PGCs<ol><li>לאחר שטיפת המחט עם CPA בטיפה אחת, יש להעמיס CPA טרי בטיפה נוספת לתוך המחט ולהוסיף CPA ל-PGCs שהופקדו על העובר. נפח ה-CPA צריך להיות שווה לזה של ה-PGCs.</li>
		<li>הסר כמה שיותר CPA מאשכול PGCs 1-2 שניות לאחר הוספת CPA. PGCs מתכווצים מעט והופכים מרובעים בצורתם מיד לאחר הוספת רו"ח.</li>
		<li>רוקנו את המחט ולאחר מכן טענו שמן סיליקון למשך 5 שניות או יותר. טען את כל PGC שנאסף ולאחר מכן טען שמן סיליקון שוב במשך 5 שניות או יותר. PGCs דחוקים כעת בין שתי שכבות של שמן סיליקון (איור 2B). הערה: חשוב להסיר כמה שיותר חלמון, רו"ח ומזהמים אחרים.</li>
	</ol></li>
	<li>Cryopreserving PGCs<ol><li>פתחו את הסטופקוק התלת-כיווני (איור 1C) ואז נתקו את המחט מהמיקרומניפולטור. כתם את השמן מעל פני המחט עם נייר טישו רך. אין לגעת ישירות בקצה המחט עם הרקמה.</li>
		<li>חברו את המחט למחזיק מחט ונעלו אותה במקומה בבסיס באמצעות סרט ויניל (איור 1H). הצמידו תווית לצינור המחזיק.</li>
		<li>הבזק להקפיא את המחזיק עם המחט מצביע כלפי מטה על ידי טבילתו בחנקן נוזלי. אין לשחרר את המחזיק עד שהנוזל מפסיק לזלוג מהמדף.</li>
		<li>יש לאחסן את המחזיק במיכל אחסון חנקן נוזלי באזור הפאזה הנוזלית, ולא באזור שלב האדים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הפשרה והשתלה של PGCs
<ol><li>איסוף, דה-כוריון ויישור עוברים מזבובי פונדקאי אגמטיים<ol><li>אספו ונטרלו עוברים מזבובי פונדקאי אגמטיים לאחר שלב 2.</li>
		<li>יישרו את העוברים המארחים האגמטיים שלב 5 על שקופית זכוכית להשתלה. אולם הפעם, כוונו את החלק האחורי ימינה (הצד שיש לתפעל אותו) ואת הגחון למעלה (איור 5). סדרו כ-30 עוברים בשתי שורות ב-20 דקות.</li>
		<li>בעת יישור העוברים, הפעילו מכשיר אדים למשך 2-10 דקות אם לחות החדר דורשת זאת (טבלה 1). הלחות האידיאלית היא 30% עד 40%, אך זה יכול להשתנות בהתאם לתנאים התרמיים.</li>
	</ol></li>
	<li>הפשרה והשתלה של PGCs בעוברים מארחים<ol><li>כדי להפשיר במהירות PGCs שמורים בהקפאה, יש להחליק את המחזיק המכיל את המחט לתמיסת EBR 1x בטמפרטורת החדר כאשר המחט מצביעה כלפי מטה ולהשאיר אותה שקועה למשך 10 שניות.</li>
		<li>הניחו את שקופית זכוכית ההשתלה על במת מיקרוסקופ. חברו את המחט המופשרת בהקפאה למחזיק הנימים והביאו את העובר הראשון בשורה השמאלית ואת קצה המחט לאותו מישור מוקד.</li>
		<li>בעזרת עדשה אובייקטיבית פי 20, הזיזו בעדינות את קצה המחט אל פני השטח של הקצה האחורי של העובר.</li>
		<li>דחפו בעדינות את החלק החיצוני של כל עובר וודאו שהוא חוזר לאט לאט לצורתו המקורית. הדרבון יאשר כי הלחץ הפנימי של העובר אינו גבוה מדי או נמוך מדי.</li>
		<li>הזיזו בעדינות את המחט וחדרו לעובר מהקוטב האחורי.</li>
		<li>מפקידים בעדינות כ-10-20 PGCs ממש בתוך הקוטב האחורי, בדיוק בין קרום ויטלין לבין שכבת התא הסומטית של העובר. הימנע הפקדתם בשכבת התא הסומטי. אם נוזל הפריביטלין דולף מהעובר, יש למצוץ את הנוזל שדלף לתוך המחט ולהסיר אותו.</li>
		<li>משכו את המחט מהעובר. חזור על שלבים 3.2.5 ו- 3.2.6 עבור עוברים עוקבים.</li>
	</ol></li>
</ol>4. דגירה על עוברים ושיקום זני תורם
<ol><li>הוציאו עוברים שלא קיבלו PGC מושתל ודגרו על העוברים הנותרים בתא לח (איור 1G) בטמפרטורה של 25°C.</li>
	<li>לאחר 24 שעות או יותר לאחר ההשתלה ובהקדם האפשרי לאחר הבקיעה, השתמשו במלקחיים כדי להרים ולהעביר זחלים שבקעו לבקבוקוני מזון דרוזופילה סטנדרטיים ולדגור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי להחיות את הזן, הצליבו נקבות וזכרים שזה עתה הופיעו (איור 6). הערה: מארחים אגמטיים מאפשרים לשחזר את כל הגנום בבת אחת מבלי לעבור לזני כרומוזום מאזנים. הדו-קיום של זכרים אגמטיים בבקבוקון לא ישנה מכיוון שהנקבות, גם אם הן מזדווגות איתם, אינן מראות תגובות ארוכות טווח לאחר ההזדווגות, כולל ירידה בפתיחות לחזרה18,19.</li>
</ol>

שימור בהקפאה של PGCs לשימור ארוך טווח של זני דרוזופילה

<ol>
	<li>Br&#252;schweiler, W., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+freezing+living+ovaries+of+Drosophila+melanogaster+larvae+and+its+application+to+the+storage+of+mutant+stocks.">A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks.</a> Experientia. 29, 134-135 (1973).</li><li>Steponkus, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+Drosophila+melanogaster+embryos.">Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos.</a> Nature. 345, 170-172 (1990).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+preservation+of+Drosophila+embryos.">Cryobiological preservation of Drosophila embryos.</a> Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).</li><li>Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+method+for+Drosophila+melanogaster+embryos.">Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos.</a> Nat Comm. 12, 2412 (2021).</li><li>Van Deusen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+in+germ+line+chimeras+of+Drosophila+melanogaster.">Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster.</a> Development. 37 (1), 173-185 (1977).</li><li>Breen, T. R., Duncan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+expression+of+genes+that+regulate+the+bithorax+complex+of+Drosophila+melanogaster.">Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 118, 442-456 (1986).</li><li>Schupbach, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+autonomy+of+maternal-effect+mutations+altering+the+embryonic+body+pattern+of+Drosophila.">Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila.</a> Dev Biol. 113, 443-448 (1986).</li><li>Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+posterior-group+gene+nanos+functions+by+repressing+hunchback+activity.">The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity.</a> Nature. 338, 646-648 (1989).</li><li>H&#252;lskamp, M., Schr&#246;der, C., Pfeifle, C., J&#228;ckle, H., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+segmentation+of+the+Drosophila+embryo+in+the+absence+of+a+maternal+posterior+organizer+gene.">Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene.</a> Nature. 338, 629-632 (1989).</li><li>Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., N&#246;thiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+and+inductive+signals+can+determine+the+sex+of+the+germ+line+of+Drosophila+by+regulating+the+gene+Sxl.">Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl.</a> Cell. 57 (1), 157-166 (1989).</li><li>Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polarity+of+the+dorsoventral+axis+in+the+drosophila+embryo+is+defined+by+an+extracellular+signal.">The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal.</a> Cell. 65 (5), 725-735 (1991).</li><li>Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+posterior+morphogen+nanos+for+germline+development+in+Drosophila.">Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila.</a> Nature. 380, 708-711 (1996).</li><li>Asaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offspring+production+from+cryopreserved+primordial+germ+cells+in+Drosophila.">Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila.</a> Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Koslov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+CRISPR/Cas9+editing+of+the+NHE1+gene+renders+chickens+resistant+to+the+J+subgroup+of+avian+leukosis+virus.">Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+zebrafish+maternal-zygotic+mutants+through+transplantation+of+ectopically+induced+and+Cas9/gRNA+targeted+primordial+germ+cells.">Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells.</a> J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Drosophila+Embryogenesis.">Stages of Drosophila Embryogenesis.</a> The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).</li><li>Manning, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sperm+factor+affecting+the+receptivity+of+Drosophila+melanogaster+females.">A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females.</a> Nature. 194, 252-253 (1962).</li><li>Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-peptides:+seminal+peptides+of+the+Drosophila+male.">Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male.</a> Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).</li><li>Lehmann, R., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+segmentation,+pole+cell+formation,+and+embryonic+polarity+require+the+localized+activity+of+oskar,+a+maternal+gene+in+drosophila.">Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila.</a> Cell. 47 (1), 141-152 (1986).</li><li>Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+the+essential+Drosophila+Nucleoporin+nup154:+allelic+differences+due+to+an+outward-directed+promoter+in+the+P-element+3&#8242;+end.">Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3&#8242; end.</a> Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).</li><li>Rienzi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+in+gamete+and+embryo+cryopreservation.">Perspectives in gamete and embryo cryopreservation.</a> Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

גורם קריטי להצלחה בשימור הקפאה והחייאת PGC הוא שימוש בעוברים טובים. יש להשתמש בנקבות צעירות (למשל, בנות 3 עד 5 ימים) לאיסוף עוברים. הן העובר התורם והן העובר המארח מוערכים על ידי בדיקה מיקרוסקופית, ורק אלה בשלב הבלסטודרם (שלב 5) משמשים12. עבור איסוף PGC, אנו בדרך כלל מיישרים כ -40 עוברים תורמים בתקופה של 20 דקות ואוספים PGC מכ -30 עוברים בשלב מוקדם 5; לא נעשה שימוש בעוברים ישנים ופגומים. לאחר שימור בהקפאה והפשרה, PGCs צריכים לשמור על צורתם; PGCs נקרעים בשימור לא מוצלח. עוברים מארחים צריכים להיות גם בשלב 5 ויש להם לחץ פנימי מתון; העוברים צריכים לחזור לאט לאט לצורתם המקורית לאחר דרבון עדין. עוברים מיובשים מדי ולא יבשים מספיק לא יתפתחו באופן נורמלי לאחר ההשתלה. מכיוון שהשתלה הטרוסקסואלית של PGCs אינה מצליחה לייצר גמטות בדרוזופילה 5,10, השתלת PGCs מעוברים מרובים מתורמים לעוברים מארחים היא בעלת סיכוי גבוה יותר להניב מבוגרים פוריים. לשם כך, אנו בדרך כלל אוספים PGCs מכ -30 עוברים לכל מחט.
כהגנה קריואקטיבית, ניסינו אתילן גליקול, דימתיל סולפוקסיד וגליצרול יחד עם סוכרוז בריכוזים שונים. קבענו EBR המכיל 20% אתילן גליקול ו 1 M סוכרוז להיותהטוב ביותר 13; עם זאת, השימוש במגני קריופרוטקציה שונים עשוי לשפר את שימור PGC22.
שיטת שימור הקפאה זו דורשת מיומנויות מיוחדות בטיפול ב-PGC, ויש צורך בכ-6 שבועות של הכשרה כדי לאסוף ולהשתיל PGC בנוחות. כדי להעריך ולשפר מיומנות, ניתן לחלק זאת לשישה שלבי אימון: 1) יישור עוברים על מגלשת זכוכית, 2) שליטה במניפולטור, 3) השתלת PGCs מעובר לעובר אחר ללא הקפאה, 4) השתלת PGCs מ-10 עוברים או יותר ל-5 עד 10 עוברים, 5) השתלת PGCs לאחר החלת CPA, ו-6) השתלת PGCs לאחר הפשרת הקפאה. כל שלב עשוי להימשך שבוע. המטרות קצרות הטווח בשלב 3 הן שיעור בקיעה של 40%, כדאיות עובר לבוגר של 10%-20%, ותדירות של זבובים פוריים של 20%.
שימור קריוגני PGC דורש מכשור יקר וכוח אדם מיומן. לכן, שיטה זו לא יכולה להיות מאומצת על ידי מעבדות רבות. עם זאת, לשיטת PGC הנוכחית יש מספר היבטים חשובים. ראשית, PGCs קטנים בהרבה מעוברים והם חדירים מאוד להקפאה. לעומת זאת, חדירות ההגנה הקפאית מוגבלת מאוד על ידי שכבות השעווה של עוברי דרוזופילה, שהיא הבעיה החמורה ביותר בשימור עוברים בהקפאה. ואכן, מחקרים קודמים עשו מאמצים רבים למצוא חלון זמן שבו לעוברים יש שיעור הישרדות גבוה ושכבת שעווה דקה יותר. השני עוסק בשונות התפתחותית ומורפולוגית בין זנים. PGCs נאספים מעוברים בשלב מוקדם -5 (2 שעות 30 דקות-3 שעות 20 דקות לאחר הטלת ביצית), בעוד ששימור בהקפאה של עוברים מתבצע בשלב 16 עוברים (14-22 שעות לאחר הטלת ביציות). העוברים הם, אם כן, מבוגרים בהרבה ומראים שונות זן גדולה בהרבה בחלון הזמן האופטימלי לשימור בהקפאה בהשוואה לשימור בהקפאה PGC. ואכן, התדירות של פונדקאים המייצרים צאצאים שמקורם בתורם לא השתנתה בין חמישה זנים שנחקרו על ידי Asaoka et al.13, אם כי המארחים לא היו אגמטיים. יתר על כן, ל-PGCs יש פוטנציאל לשמש ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום 14,15,16.

תחזוקת זני דרוזופילה על ידי העברת זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון חדשים גורמת בהכרח להצטברות מוטציות ושינויים אפיגנטיים לאורך זמן. פיתוח שיטה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה ללא שינויים כאלה הוא הכרחי, במיוחד עבור זני ייחוס שבהם יש לשמור על כל הגנום. מספר ניסיונות מוצלחים לשמר בהקפאה עוברים או שחלות דרוזופילה תוארו 1,2,3. למרבה הצער, הם עדיין לא בשימוש מעשי בגלל יכולת שחזור נמוכה. ואכן, לעוברים בשלב מוקדם יש שיעור הישרדות נמוך לאחר שימור בהקפאה בגלל תכולת החלמון הגבוהה שלהם, המעכבת חדירה ודיפוזיה של חומר מגן קריוגני (CPA) 2,3. חדירות CPA מוגבלת מאוד גם על ידי שכבות השעווה של עוברים בשלב מאוחר. קשה וגוזל זמן למצוא פרק זמן ספציפי שבו לעוברים יש שיעור הישרדות גבוה ושכבת שעווה דקה יותר. לאחרונה, Zhan et al.4 שיפרו שיטות לחדירת עוברים, העמסת CPA וויטריפיקציה והצליחו להקפיא עוברים מזנים מרובים. עם זאת, השיטות אינן קלות ליישום מכיוון שהכדאיות של עוברים לאחר חדירה נוטה להיות גרועה. לכן, שיפור נוסף ופיתוח של גישות חלופיות עדיין נדרשים. שיטות הכוללות שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) הן גישה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה.
השתלת PGC (המכונה גם תאי קוטב) שימשה ליצירת כימרות נבט, במיוחד נקבות, כדי לחקור תהליכים כגון השפעות אימהיות של מוטציות קטלניות זיגוטיות וקביעת מין של תאי נבט 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGCs הם הרבה יותר קטנים מאשר עוברים והם צפויים להיות חדירים מאוד עבור רוב cryoprotectants. יתר על כן, השונות ההתפתחותית והמורפולוגית בין הזנים בעייתית פחות, ופונדקאי אגמטי מאפשר שחזור מהיר של גנומים שלמים. לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה לשימור קריוגניPGC 13, המונעת את השינויים הגנטיים והאפיגנטיים הבלתי נמנעים בזני דרוזופילה. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול המפורט.
שיטת שימור קריוגנית זו דורשת מומחיות ספציפית בטיפול ובמכשור PGC. בעוד שגישה שלב אחר שלב עשויה להיות פתרון יעיל עבור אלה שאינם מכירים אותה, היא עשויה להיות לא מתאימה למעבדות קטנות בשל דרישות המכשור. פרוטוקול PGC זה לשימור קריוגני יכול להיות מותאם בקלות רבה יותר לשימוש עם מיני דרוזופילה שונים ומיני חרקים שונים מאשר פרוטוקולי שימור הקפאה של עוברים בגלל הבדלים התפתחותיים ומורפולוגיים קטנים יותר. PGCs יכולים לשמש גם ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום 14,15,16. לסיכום, ניתן להשתמש בשיטה זו במרכזי מלאי ובמעבדות אחרות כדי לשמור על זני זבובים וזני חרקים אחרים לפרקי זמן ממושכים ללא שינויים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>017-00256</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>010-08725</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>038-24985</td>
			<td>For EBR solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B100-75-10-PT</td>
			<td>BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary holder</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196 081.005</td>
			<td>Capillary holder 4; for micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromic acid mixture</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>037-05415</td>
			<td>For needle washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>Scotch w-12</td>
			<td>For glue extracting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ephrussi&#8211;Beadle Ringer solution (EBR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>057-00451</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>054-00983</td>
			<td>For CPA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351006</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Vigor</td>
			<td>Type5 Titan</td>
			<td>For embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grape juice</td>
			<td>Asahi Soft Drinks Co., LTD.</td>
			<td>Welch&#39;s Grape 100</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grape juice agar plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>084-08105</td>
			<td>For glue extracting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifier</td>
			<td>APIX INTERNATIONAL CO., LTD.</td>
			<td>FSWD2201-WH</td>
			<td>For embryo preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>Leica&#160;DM IL LED</td>
			<td>For micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock glass syringe</td>
			<td>Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.</td>
			<td>0550 14 71 08</td>
			<td>Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical micromanipulator</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td></td>
			<td>For micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro slide glass</td>
			<td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td>S-2441</td>
			<td>For embryo aligning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microgrinder</td>
			<td>NARISHIGE Group</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>Leica MC170 HD</td>
			<td>For micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>Eppendorf TransferTip (ES)</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td>28514-75</td>
			<td>For EBR solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>NARISHIGE Group</td>
			<td>PN-31</td>
			<td>For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC adhesive tape for electric insulation</td>
			<td>Nitto Denko Corporation</td>
			<td>&#160;J2515</td>
			<td>For embryo-pool frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon oil</td>
			<td>Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd.</td>
			<td>FL-100-450CS</td>
			<td>For embryo handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td>31320-05</td>
			<td>For EBR solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>197-02206</td>
			<td>Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Nacalai Tesque, Inc.</td>
			<td>30404-45</td>
			<td>For CPA solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell cryopreservation and revival of drosophila strains

זני דרוזופילה חייבים להישמר על ידי העברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקונים חדשים. זה טומן בחובו סכנה של הידרדרות מוטציות ושינויים פנוטיפיים. לכן פיתוח שיטה חלופית לשימור ארוך טווח ללא שינויים כאלה הוא הכרחי. למרות ניסיונות מוצלחים קודמים, שימור בהקפאה של עוברי דרוזופילה עדיין אינו שימושי מבחינה מעשית בגלל יכולת שחזור נמוכה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לשימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) ולהחייאת זנים באמצעות השתלת PGCs משומרים בהקפאה בעוברים מארחים אגמטיים מסוג Drosophila melanogaster (D. melanogaster). PGCs חדירים מאוד לחומרים מגנים על הקפאה (CPAs), ושונות התפתחותית ומורפולוגית בין זנים היא פחות בעייתית מאשר בשימור בהקפאה של עוברים. בשיטה זו, PGCs נאספים מכ -30 עוברים תורמים, מועמסים לתוך מחט לאחר טיפול CPA, ולאחר מכן נשמרים בהקפאה בחנקן נוזלי. כדי לייצר גמטות שמקורן בתורם, ה-PGCs השמורים בהקפאה במחט מופשרים ולאחר מכן מופקדים בכ-15 עוברים מארחים אגמטיים. בפרוטוקול זה הושגה תדירות של לפחות 15% זבובים פוריים, ומספר הצאצאים לכל זוג פורה היה תמיד די והותר כדי להחיות את הזן המקורי (מספר הצאצאים הממוצע היה 77.2 ± 7.1), מה שמצביע על יכולתם של PGCs שמורים בהקפאה להפוך לתאי גזע של תאי גזע. המספר הממוצע של זבובים פוריים למחט היה 1.1 ±-0.2, ו-9 מתוך 26 מחטים הניבו שני צאצאים פוריים או יותר. נמצא כי 11 מחטים מספיקות כדי לייצר 6 צאצאים או יותר, שבהם נכללים ככל הנראה לפחות נקבה אחת וזכר אחד. הפונדקאי האגמטי מאפשר להחיות את הזן במהירות פשוט על ידי חציית זבובים נקביים וזכרים שזה עתה הופיעו. בנוסף, ל-PGCs יש פוטנציאל לשמש ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום.

The maintenance of Drosophila strains by the transfer of adult flies to new food vials inevitably results in the accumulation of mutations and epigenetic changes over time. Development of an alternative method for long-term maintenance of Drosophila strains without such changes is imperative, especially for reference strains in which the whole genome has to be maintained. Several successful attempts to cryopreserve Drosophila embryos or ovaries have been described1,2,3. Unfortunately, they are still not of practical use because of low reproducibility. Indeed, early-stage embryos have a low survival rate after cryopreservation because of their high yolk content, which impedes cryoprotective agent (CPA) permeation and diffusion2,3. CPA permeability is also severely limited by the waxy layers of late-stage embryos. It is difficult and time-consuming to find a strain-specific time period in which embryos have a high survival rate and a thinner wax layer. Recently, Zhan et al.4 improved methods for embryo permeabilization, CPA loading, and vitrification and successfully cryopreserved embryos of multiple strains. However, the methods are not easy to apply because the viability of embryos after permeabilization tends to be poor. Therefore, further improvement and development of alternative approaches are still needed. Methods involving the cryopreservation of primordial germ cells (PGCs) are an alternative approach for the long-term maintenance of Drosophila strains.
PGC (also called pole cell) transplantation has been used to generate germline chimeras, especially females, to study processes such as maternal effects of zygotic lethal mutations and sex determination of germ cells5,6,7,8,9,10,11,12. PGCs are much smaller than embryos and are likely to be highly permeable to most cryoprotectants. Furthermore, developmental and morphological variation among strains is less problematic, and an agametic host enables quick restoration of whole genomes. We recently developed a new method of PGC cryopreservation13, which prevents the otherwise inevitable genetic and epigenetic changes in Drosophila strains. Here, we present the detailed protocol.
This cryopreservation method requires specific expertise in PGC handling and instrumentation. While a step-by-step approach may be an efficient solution for those who are unfamiliar with it, it may be unsuitable for small laboratories due to instrumentation requirements. This PGC cryopreservation protocol can be more easily adapted for use with different Drosophila species and different insect species than embryo cryopreservation protocols because of smaller developmental and morphological differences. PGCs can also potentially be used in genetic engineering applications, such as genome editing14,15,16. In summary, this method can be used in stock centers and other laboratories to maintain fly and other insect strains for prolonged periods of time without changes.

מחבר זרקור: PGC Cryopreservation – גישה חלופית לשימור ארוך טווח של זני דרוזופילה 

שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים והחייאת זני דרוזופילה

Drosophila strain must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This creates a danger of mutational deterioration and genetic changes. We aim to develop an alternative method for the long-term preservation of Drosophila strains without such changes.Compare with in vivo editing, genome editing of primordial germ cells, or PGCs, could increase knock-in inefficiency and make more complicated genomic changes. Thus, a wide application of PGC manipulation facilitates genetic engineering in many fields. We now focus on xenotransplantation.By using Drosophila melanogaster as a surrogate host, we have succeeded in reviving stock of cell species in the melanogaster species subgroup. By addressing xenotransplantation barriers and finding possible solutions, we would like to explore the potential application of PGC transplantation and cryopreservation.

היעילות של השתלת PGC בהקפאה דווחה על ידי Asaoka et al.13 והיא ניתנת בטבלה 2 להשתלת PGCs בהקפאה למשך יום אחד או יותר בחנקן נוזלי. שיעור הבקיעה היה 168/208 עוברים מושתלים (80.8%), ושיעור הבקיעה מהעובר לבוגר היה 87/208 (41.8%). שכיחות הזבובים הפוריים הייתה 28/87 (32.2%). תדירות זו לא הייתה שונה בין PGCs שמורים בהקפאה במשך 8 עד 30 יום לבין אלה שנשמרים בהקפאה במשך 31-150 ימים (20/57 לעומת 8/30, G' = 0.63, p >0.1, d.f. = 1). המספר הממוצע של צאצאים לזוג היה 77.2 ± 7.1 (n = 18, 28-122), מה שמצביע על היכולת של PGCs שמורים בהקפאה להפוך לתאי גזע של תאי גזע נבט. מתוך 26 המחטים, 10 לא הפיקו צאצאים פוריים, 7 מחטים ייצרו צאצא פורה אחד, 7 מחטים ייצרו 2 צאצאים פוריים ו-2 מחטים ייצרו 3 או 4 צאצאים פוריים. המספר הממוצע של זבובים פוריים למחט היה 1.1 ± 0.2. בהתבסס על נתונים אלה, בביטחון של 95%, 11 מחטים מספיקות כדי לייצר 6 צאצאים או יותר, שבהם לפחות נקבה אחת וזכר אחד נכללים ככל הנראה.
בניסויים לעיל השתמשנו בעוברים המבטאים mRNA של ovo-A ב-PGCs (nanos>ovo-A, OvoA_OE עוברים) כפונדקאי אגמטי. מתוך 669 נקבות F1 ו-720 זכרי F1 שהופקו מזוגות ננו>אובו-A מושתלים, לא היה מנוס שמקורו ב-PGCs המארחים. מספר מוטנטים של אוסקר (osk) הם גם אגמטייםרגישים לטמפרטורה 20,21. מכיוון שמוטנט אוסק עם כדאיות הומוזיגוטית גבוהה והפנוטיפ האגמטי אינו זמין עוד, יצרנו מחדש את מוטנט ה-osk[8] missense20 על ידי עריכת גנום בסיוע CRISPR/Cas9. זבובים אלה היו אגמטיים לחלוטין (0 בורחים מתוך 230 נקבות ו -192 זכרים) ב -25 מעלות צלזיוס, אך כמה בורחים הגיחו ב -23 מעלות צלזיוס (1 מתוך 248 נקבות ו -1 מתוך 290 זכרים). ננו>אובו-A מומלצים אפוא כעוברים מארחים אגמטיים. מניות UASp-ovo-A ו- nanos-Gal4 13 יהיו זמינות בקרוב ממרכז המניות KYOTO Drosophila.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig01v2.jpg"> איור 1: ציוד נדרש. (A) מערכת מיקרומניפולטור לאיסוף תאים והשתלתם. i) מיקרוסקופ הפוך, ii) מיקרומניפולטור מכני, iii) מזרק, iv) מחזיק נימי, v) סטופקוק תלת-כיווני, vi) מכשיר אדים, vii) מיקרוסקופ סטריאו. (ב) מזרק. (C) סטופקוק תלת-כיווני וצינורות סיליקון מחברים מזרק ומחזיק נימי. (D) מחט ומחזיק נימים מחוברים למיקרומניפולטור. (E) גביע לאיסוף עוברים עם צלחת לאיסוף עוברים (קוטר 6 ס"מ, גובה 7.7 ס"מ). (F) מסננת רשת מנירוסטה. (ז) מכל המשמש כתא לח עם מגלשת זכוכית. כדי לשמור על לחות, הניחו נייר רטוב על התחתית וסגרו את המכסה. (ח) מחזיק מחט עם מחט להקפאה. (I) מתלה אחסון להקפאה וקופסה עם מחטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig02v2.jpg"> איור 2: מגלשת זכוכית מאוסף PGC ומחט לשימור קריוגני. (A) שקופית זכוכית מאוסף תאי נבט קדמוניים (PGC) המצופה בדבק. עוברים דכוריוניים מיושרים בשתי שורות ומכוונים כאשר הקדמי שלהם ימינה (הצד שיש לטפל בו) והצד הגחוני למעלה. מסגרת בריכת עוברים מוצמדת, שתי טיפות של תמיסת חומרים מגנים על הקפאה (CPA) מופקדות, והבריכה מלאה בשמן סיליקון. (B) מחט צריכה להכיל כמות קטנה ככל האפשר של חלמון ומזהמים אחרים. PGCs נדחקים בין שתי שכבות של שמן סיליקון כאשר הם נשמרים בהקפאה בחנקן נוזלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig02largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig03.jpg"> איור 3: יצירת המחט. שיטת ליטוש חוד תלת שלבית ליצירת מחט בגודל חור מתאים וקצה חד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig04v2.jpg"> איור 4: סכימת איסוף עוברים. לאחר שני אוספים מקדימים, אנו בדרך כלל אוספים שלוש או ארבע פעמים ביום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig04largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig05.jpg"> איור 5: יישור עובר מארח. יישור העוברים המארחים על שקופית זכוכית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig06.jpg"> איור 6: סקירה כללית של שיטת PGC cryopreservation. סקירה כללית של כל השלבים שבוצעו לביצוע שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="3">לחות בחדר</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>< 30%</td>
			<td>~ 30%</td>
			<td>> 30%</td>
		</tr><tr><td>יישור עוברים מארחים (~ 20 דקות)</td>
			<td>יש להשתמש במכשיר אדים למשך 2 - 10 דקות</td>
			<td>יש להשתמש במכשיר אדים לסירוגין למשך דקה אחת</td>
			<td>אין להשתמש במכשיר אדים</td>
		</tr><tr><td>הפשרת PGCs מתורם</td>
			<td>לא ישים</td>
			<td>לא ישים</td>
			<td>לא ישים</td>
		</tr><tr><td>PGCs יבשים באוויר</td>
			<td>השמט שלב זה</td>
			<td>השמט שלב זה</td>
			<td>5 דקות</td>
		</tr><tr><td>מרחו שמן סיליקון</td>
			<td>לא ישים</td>
			<td>לא ישים</td>
			<td>לא ישים</td>
		</tr><tr><td>PGCs להשתלה</td>
			<td>לא ישים</td>
			<td>לא ישים</td>
			<td>לא ישים</td>
		</tr><tr><td colspan="4">כל השלבים האלה צריכים להיות finshed בתוך 50 דקות.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: ייבוש עוברים במהלך יישור העוברים והפשרת PGC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>זן התורם</td>
			<td>תקופת שימור בהקפאה</td>
			<td>מספר עוברים מושתלים (A)</td>
			<td>מספר הזחלים שבקעו (B) (בקיעה, ב/א)</td>
			<td>מספר המבוגרים הסגורים (C) (כדאיות ביצה לבוגר, C/A)</td>
			<td>מספר הבוגרים הפוריים (D) (תדירות הזבובים הפוריים, D/C)</td>
		</tr><tr><td>M17</td>
			<td>8 - 30 ימים</td>
			<td>134</td>
			<td>108 (80.6%)</td>
			<td>57 (42.5%)</td>
			<td>20 (35.1%)</td>
		</tr><tr><td>M17</td>
			<td>31 - 150 ימים</td>
			<td>74</td>
			<td>60 (81.1%)</td>
			<td>30 (40.5%)</td>
			<td>8 (26.7%)</td>
		</tr><tr><td colspan="6">M17: yw; TM6B, P{Dfd-GMR-nvYFP}4, Sb[1] Tb[1] ca[1]/ Pri[1]</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: יעילות השתלת PGC בהקפאה. טבלה זו השתנתה מ- 13. כל הנתונים הם ממארחים אגמטיים.

Watch this Scientific Journal Video about PGC Cryopreservation – An Alternative Approach Towards Long-Term Preservation of Drosophila Strains at JoVE.com

שיטת שימור ארוכת טווח לזני דרוזופילה כחלופה להעברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון טריים רצויה מאוד. פרוטוקול זה מתאר שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים של דרוזופילה והחייאת זנים באמצעות השתלתם בעוברים מארחים אגמטיים.

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and ...

זן דרוזופילה חייב להישמר על ידי העברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקונים חדשים. זה יוצר סכנה של הידרדרות מוטציות ושינויים גנטיים. אנו שואפים לפתח שיטה חלופית לשימור ארוך טווח של זני דרוזופילה ללא שינויים כאלה.בהשוואה לעריכת in vivo, עריכת גנום של תאי נבט קדמוניים, או PGCs, עלולה להגביר את חוסר היעילות ולבצע שינויים גנומיים מורכבים יותר. לפיכך, יישום רחב של מניפולציה PGC מאפשר הנדסה גנטית בתחומים רבים. כעת אנו מתמקדים בהשתלת קסנו.על ידי שימוש ב- Drosophila melanogaster כפונדקאי חלופי, הצלחנו להחיות מלאי של מיני תאים בתת-הקבוצה של מיני המלנוגסטר. על ידי טיפול במחסומי השתלת קסנו ומציאת פתרונות אפשריים, ברצוננו לחקור את היישום הפוטנציאלי של השתלת PGC ושימור בהקפאה.

primordial-germ-cell-cryopreservation-revival-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains

Drosophila strains must be maintained by the frequent transfer of adult flies to new vials. This carries a danger of mutational deterioration and phenotypic changes. Development of an alternative method for long-term preservation without such changes is therefore imperative. Despite previous successful attempts, cryopreservation of Drosophila embryos is still not of practical use because of low reproducibility. Here, we describe a protocol for primordial germ cell (PGC) cryopreservation and strain revival via transplantation of cryopreserved PGCs into agametic Drosophila melanogaster (D. melanogaster) host embryos. PGCs are highly permeable to cryoprotective agents (CPAs), and developmental and morphological variation among strains is less problematic than in embryo cryopreservation. In this method, PGCs are collected from approximately 30 donor embryos, loaded into a needle after CPA treatment, and then cryopreserved in liquid nitrogen. To produce donor-derived gametes, the cryopreserved PGCs in a needle are thawed and then deposited into approximately 15&#160;agametic host embryos. A frequency of at least 15% fertile flies was achieved with this protocol, and the number of progeny per fertile couple was always more than enough to revive the original strain (the average progeny number being 77.2 &#177; 7.1), indicating the ability of cryopreserved PGCs to become germline stem cells. The average number of fertile flies per needle was 1.1 &#177; 0.2, and 9 out of 26 needles produced two or more fertile progeny. It was found that 11 needles are enough to produce 6 or more progeny, in which at least one female and one male are likely included. The agametic host makes it possible to revive the strain quickly by simply crossing newly emerged female and male flies. In addition, PGCs have the potential to be used in genetic engineering applications, such as genome editing.

A long-term preservation method for Drosophila strains as an alternative to the frequent transfer of adult flies to fresh food vials is highly desirable. This protocol describes the cryopreservation of Drosophila primordial germ cells and strain revival via their transplantation to agametic host embryos.

Collection of Primordial Germ Cells from Drosophila Donor Embryos

Collection of Primordial Germ Cells from Drosophila Donor Embryos  

Proceed to collect the primordial germ cells or PGCs from the dross filia embryos. After assembling the micro manipulator system. While working under a stereo microscope, use forceps to transfer the embryos.Align the coated embryos in two rows on a PGC collection glass slide along two reference lines. Orient the embryos with their anterior to the right and ventral side up. Gently move the transplantation needle tip to the anterior end of an embryo.Penetrate the embryo by moving the microscope stage and retract the needle slightly. When the tip reaches the posterior end. Discharge any yoke in the needle inside the somatic cell layer.Move the needle tip to the posterior pole and gently load the PGCs into the needle without taking much time. Pull the needle out of the embryo quickly. Discharge yolk and other contaminants from the needle while keeping the PGCs.Load clean silicone oil from the pool into the needle. Before collecting PGCs from a new embryo, deposit as much silicone oil as possible inside the somatic cell layer while keeping the loaded PGCs in the needle. After collecting PGCs from all embryos in a row, deposit the PGCs onto the surface of an embryo and unload any yoke or other contaminants onto another neighboring embryo.In a similar manner, collect and combine PGCs from the embryos in the second row.

אוסף תאי נבט קדמוניים מעוברים מתורם דרוזופילה

Cryopreservation of Primordial Germ Cells Collected from Drosophila Donor Embryos

Cryopreservation of Primordial Germ Cells Collected from Drosophila Donor Embryos  

Proceed for the cryo-preservation of the primordial germ cells or PGCs. After collecting and depositing the PGCs from the donor embryos on the surface of an embryo. Wash the transplantation needle with a cryo protective agent or CPA and load fresh CPA into the needle.Add the loaded CPA to the PGCs deposited on the embryo while ensuring the volume of CPA is equivalent to that of the PGCs. Remove excess CPA from the cluster of PGCs one to two seconds after CPA addition. Next, empty the needle and load it with silicone oil for five seconds or longer.Load all the collected PGCs into the needle, followed by loading silicone oil again for five seconds or longer. Ensure the PGCs are sandwiched between two layers of silicone oil. Detach the needle from the micro manipulator using soft tissue paper, blot the oil off the needle surface without touching the needle tip with the tissue.Attach the needle to a needle holder and using vinyl tape, lock it in position at the base. Flash freeze the holder with the needle pointing downwards by submerging it in liquid nitrogen. Do not release the holder until the liquid stops fizzing out of the rack.Store the holder in a liquid nitrogen storage tank in the liquid phase area.

שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים שנאספו מעוברים מתורם דרוזופילה

Thawing and Transplantation of Cryopreserved Primordial Germ Cells for Drosophila Strain Revival

Thawing and Transplantation of Cryopreserved Primordial Germ Cells for Drosophila Strain Revival  

To begin, align the stage five egg mimetic Drosophila host embryos on a transplantation glass slide. While orienting their posterior to the right and ventral to the top, line up approximately 30 embryos in two rows in 20 minutes. Thaw the cryopreserved PGCs in the needle by submerging the holder with the needle pointing downward into EBR solution at room temperature.Keep it submerged for 10 seconds. Place the transplantation glass slide on the microscope stage. Attach the freeze thawed needle to the capillary holder and bring the first embryo into the left row and the needle tip into the same focal plane.Using a 20x objective lens, position the needle tip gently at the surface of the posterior end of the embryo. Prod the outside of each embryo gently, and confirm that they slowly return to their original shape. Penetrate an embryo from the posterior pole using the needle.Gently deposit approximately 10 to 20 PGCs inside the posterior pole, specifically between the vitelline membrane and the somatic cell layer, and retract the needle from the embryo before repeating the same for subsequent embryos. Finally, to revive the strain, cross newly emerged females and males.