Name: Author Spotlight: Developing a Simple and Robust Hepatic Model for Pharmacological and Toxicological Applications
Uploaded: 2023-10-20T13:40:00
Duration: 1 min 11 s
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원고 및 그림 검토에 도움을 주신 Mellissa Keller와 Wendy Hetman에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 Lifenet Health의 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 원고에는 인간 참가자를 대상으로 한 연구나 저자가 수행한 동물 연구가 포함되어 있지 않습니다. 모든 세포는 Lifenet Health의 연구 목적으로 완전히 동의한 기증자 조직에서 분리되었습니다.
1. 배지 준비
<ol><li>각 피더 셀 해동 배지, 보충제 A, 보충제 B 및 보충제 C( 재료 표 참조)를 37°C 수조 또는 4°C에서 16-24시간 동안 해동합니다.</li>
	<li>피더 셀 해동 배지의 전체 병(10mL)을 15mL 또는 50mL 원뿔형 튜브에 분취합니다. 참고: 세포 펠릿의 크기는 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 더 쉽게 볼 수 있습니다.</li>
	<li>4.5mL의 보충제 B와 11mL의 보충제 A를 도금 매체(75mL) 한 병에 첨가하여( 재료 표 참조) 완전한 도금 매체를 만듭니다. 알림: 완전한 도금 매체의 농도는 FBS <5% v/v입니다.</li>
	<li>별도의 병에 배양 배지 100mL( 재료 표 참조), 보충 보충제 C 1mL 및 보충제 A 14mL를 추가하여 완전한 배양 배지를 만듭니다. 참고: 완전 배양 배지의 농도는 FBS <1% v/v입니다.</li>
	<li>남은 보충제 C와 보충제 A를 -20°C에서 2주차 배지 준비까지 보관합니다. 알림: 동결-해동 주기를 반복하면 보충제의 유통 기한이 단축됩니다. 한 번만 동결-해동하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>사용하기 전에 10mL의 공급세포 해동 배지, 간세포 해동 배지, 완전 도금 배지 및 완전 배양 배지를 37°C 수조에서 20-30분 동안 데우십시오.</li>
</ol>2. 인간 공급 세포의 해동, 계수 및 도금(그림 1A)
<ol><li>PHH를 파종하기 약 1시간 전에 공급기 세포를 배양합니다. 37°C 수조에서 1-2분 동안 공급기 세포( 재료 표 참조)를 해동합니다. 알림: 해동을 모니터링하고 뒤집었을 때 액체가 냉동 비중에서 느슨해질 때 바이알을 제거하여 장기간 노출(예: >2분)을 피하십시오.</li>
	<li>해동 직후 피더 셀을 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>무균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛(BSC)에서 갓 해동된 세포를 10mL의 공급 세포 해동 배지에 추가합니다.</li>
	<li>1000μL 피펫을 사용하여 1mL의 셀/해동 배지 현탁액으로 바이알을 한 번 세척하고 수집합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 400 x g 에서 4분 동안 회전합니다.</li>
	<li>피펫팅 또는 진공 흡인으로 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 조심스럽게 폐기하십시오. 세포 펠릿을 1mL의 완전한 도금 매체에 재현탁시키고 공급 세포를 계수합니다. 알림: 피더 세포는 자동 세포 카운터에서 acridine orange 및 propidium iodide(AOPI)를 사용하거나 혈구계를 사용하여 trypan blue를 사용하여 계수할 수 있습니다. 세포 수는 기술 및 사용자에 따라 다를 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 중복 샘플을 계수하고 선택한 방법론에서 일관성을 유지하십시오.</li>
	<li>전체 도금 배지를 사용하여 셀 현탁액을 100,000 cells/mL로 희석합니다.</li>
	<li>희석된 세포 현탁액의 웰당 500μL(50,000세포)를 콜라겐 코팅된 24웰 플레이트에 플레이트합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>N-S 방향으로 앞뒤로 2회 움직인 후 동일한 동작 E-W를 사용하여 북쪽(N)-남쪽(S)-동쪽(E)-서쪽(W) 동작으로 플레이트를 흔듭니다. 이 흔들기 프로토콜을 2번 더 반복하여 총 3라운드를 진행합니다. 알림: 세포 분포를 돕는 동안 플레이트 뚜껑에 튀지 않도록 적당한 힘을 사용하여 흔들기를 수행합니다(비디오 참조).</li>
	<li>37 °C/5%CO2 에서 60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>간세포 해동을 진행하기 전에 feeder cell attachment를 확인합니다. 알림: 허용되는 피더 셀 부착은 시각적으로 약 50% 합류합니다.</li>
</ol>3. 1차 인간 간세포의 해동, 계수 및 도금(그림 1B)
<ol><li>30분 동안 공급된 세포 배양 후 0.2μm 폴리에테르설폰(PES) 필터 장치를 통해 예열된 간세포 해동 배지를 여과합니다.</li>
	<li>PHH를 37°C 수조에서 1-2분 동안 해동합니다. 알림: 해동을 모니터링하고 뒤집었을 때 액체가 냉동 비중에서 느슨해질 때 바이알을 제거하여 장기간 노출(예: >2분)을 피하십시오.</li>
	<li>해동 직후 PHH를 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>BSC에서 PHH 현탁액을 간세포 해동 배지에 붓습니다. 참고: 가능하면 PHH 셀 현탁액을 피펫팅하지 마십시오. 해동된 PHH를 극저온 매질에서 해동 매체로 이송하는 동안 피펫팅을 수행하지 않는 것이 가장 중요합니다.</li>
	<li>1000μL 피펫을 사용하여 1mL의 간세포/해동 배지 현탁액을 바이알에 다시 부드럽게 피펫팅하고 세척액을 다시 해동 배지에 부어 세척액을 수집하여 바이알을 3-4회 세척합니다.</li>
	<li>캡을 씌우고 해동된 PHH 서스펜션을 5회 부드럽게 뒤집습니다.</li>
	<li>RT에서 100 x g 에서 8분 동안 회전합니다.</li>
	<li>피펫팅 또는 진공 흡인으로 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 조심스럽게 폐기하십시오. 원뿔형 튜브의 벽에 3mL의 완전한 도금 매체를 추가합니다.</li>
	<li>원뿔형 튜브를 좌우로 흔들어 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.</li>
	<li>재현탁된 간세포에 5mL의 완전한 도금 배지를 추가합니다.</li>
	<li>PHH를 계산합니다. 참고: PHH는 자동 세포 카운터에서 AOPI를 사용하거나 혈구계를 사용하여 트리판 블루를 사용하여 계수할 수 있습니다. 세포 수는 기술 및 사용자에 따라 다를 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 중복 샘플을 계수하고 선택한 방법론에서 일관성을 유지하십시오.</li>
	<li>완전한 도금 배지를 사용하여 셀 현탁액을 원하는 파종 밀도(300,000-600,000PHHs/mL)로 희석합니다. 참고: 최적의 간세포 파종 밀도는 로트마다 다를 수 있습니다. 주어진 로트에 대한 권장 파종 밀도는 분석 증명서(COA)에 제공됩니다. 아래 방정식을 사용하여 24웰 플레이트의 간세포/mL를 측정합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>도금된 피더 셀에서 피펫팅 또는 진공 흡입을 통해 배지를 제거합니다. 알림: 공급 셀의 생존 가능성을 보장하려면 한 번에 3개 이하의 웰을 교체하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>즉시 희석된 간세포 현탁액의 웰당 500μL(150,000-300,000 세포)를 공급세포가 들어 있는 사전 코팅된 콜라겐 24웰 플레이트에 플레이트합니다.</li>
	<li>N-S 방향으로 앞뒤로 2회 움직인 후 동일한 동작 E-W를 사용하여 N-S-E-W 동작으로 플레이트를 흔듭니다. 이 흔들기 프로토콜을 2번 더 반복하여 총 3라운드를 진행합니다. 알림: 세포 분포를 도우면서 플레이트 뚜껑에 튀지 않도록 적당한 힘을 사용하여 흔들어 주십시오.</li>
	<li>37 °C/5% CO2 에서 2-4 시간 동안 배양합니다. 배양의 처음 60분 동안 위의 15단계와 같이 NSEW 동작으로 3.15분마다 접시를 흔듭니다.</li>
	<li>배양 후 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 BSC에 넣습니다.</li>
	<li>플레이트를 흔들고 피펫팅 또는 진공 흡입으로 전체 도금 매체를 제거합니다. 참고: 배양액의 생존 가능성을 보장하려면 한 번에 3개 이하의 웰을 교체하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>즉시 500μL의 예열된 완전 배양 배지를 각 웰에 추가합니다.</li>
</ol>4. 유지 보수
<ol><li>분취액 및 37°C 수조에서 20-30분 동안 사전 예열된 완전 배양 배지. 24웰 플레이트 1개에 약 13.5mL의 배지가 필요합니다.</li>
	<li>매일 500 μL의 신선하고 예열된 완전 배양 배지를 웰당 배양액에 공급합니다. 참고: 배양액의 생존 가능성을 보장하려면 한 번에 3개 이하의 웰을 교체하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>7일마다 신선한 완전 배양 배지를 준비합니다.</li>
</ol>5. 알부민 및 요소 측정을 위한 배양 상청액 샘플 수집
<ol><li>7일, 10일, 14일째에 그림 1C와 같이 원하는 샘플 웰에서 마이크로 원심분리기 튜브로 500μL의 배지를 수집합니다.</li>
	<li>샘플을 320 x g 에서 4°C에서 10분 동안 회전시켜 파편을 펠릿으로 만듭니다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 시료 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 펠릿이 파손되지 않도록 합니다.</li>
	<li>알부민 및/또는 요소 분석에서 샘플을 실행합니다(각각 섹션 10 및 11 참조). 참고: 샘플은 -20 °C에서 -80 °C까지 2주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 염색일 I
주의: 고정 버퍼에는 파라포름알데히드가 포함되어 있습니다. 파라포름알데히드는 눈 손상, 피부 자극 및 장기 독성을 유발할 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
<ol><li>14일째에 배지 샘플을 채취한 후 그림 1C와 같이 염색할 각 웰에 300μL의 고정 완충액(재료 표 참조)을 추가합니다. 최소 2개의 웰을 염색합니다.</li>
	<li>4 °C에서 20-60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS 45mL에 5mL의 10x 원액을 첨가하여 1x 투과화 완충액( 재료 표 참조)을 준비합니다( 재료 표 참조). 참고: 1x 투과화 버퍼는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음 위에서 300μL의 1x 투과화 완충액으로 2회 세척합니다.</li>
	<li>얼음 위의 1x 투과화 완충액에 1:1000 희석을 사용하여 300μL의 1차 항체 사이토케라틴 18( 재료 표 참조)을 추가합니다. NOTE: 최소한으로, 2차 항체 전용 대조군을 위해서만 1x 투과화 완충액으로 웰 하나를 배양합니다.</li>
	<li>4 °C에서 16-24 시간 배양합니다.</li>
</ol>7. 염색일 II
<ol><li>다음 날, 피펫팅 또는 진공 흡인으로 1차 항체를 제거합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 1x 투과화 완충액의 웰당 300μL로 2회 세척합니다.</li>
	<li>1x 투과화 완충액에 1:500 희석을 사용하여 300μL의 형광 2차 항체( 재료 표 참조)를 추가합니다(2차 전용 대조군 포함). 알림: 형광 항체를 사용할 때는 빛을 피하십시오.</li>
	<li>어두운 곳에서 4 °C에서 30-45분 동안 배양합니다.</li>
	<li>피펫팅 또는 진공 흡인으로 2차 항체를 제거합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 1x 투과화 완충액의 웰당 300μL로 2회 세척합니다.</li>
	<li>1x PBS의 웰당 300μL로 1회 세척합니다.</li>
	<li>150μL의 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 장착 배지( 재료 표 참조)를 각 웰에 추가하고 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 배양합니다. 알림: 플레이트는 파라필름으로 싸서 어두운 곳에서 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 본 모습. 10x 대물 렌즈를 사용하여 각 웰에 대한 각 특정 형광 채널의 이미지 5개를 캡처합니다(하나의 이미지에 스케일 바가 있는지 확인). 참고: DAPI의 여기/방출은 358nm/461nm입니다. DAPI와 2차 항체 형광단 모두에 적합한 검출 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하십시오.</li>
</ol>8. ImageJ 분석(그림 2)
참고: ImageJ 버전 1.52a 이상을 사용하는 것이 좋습니다.
<ol><li>ImageJ에서 축척 막대가 포함된 이미지를 엽니다. 직선 아이콘을 클릭하고 축척 막대의 정확한 길이까지 선을 그립니다[그림 2 (1)] 참고: 필요한 경우 확대 유리 아이콘을 클릭하여 확대 또는 축소합니다.</li>
	<li>분석 탭을 클릭합니다. 강조 표시하고 배율 설정을 클릭합니다.</li>
	<li>알려진 거리를 축척 막대의 거리로 변경합니다. 길이 단위를 축척 막대의 단위로 변경합니다. Global(전역)을 선택하여 설정을 전역으로 적용합니다. 확인을 클릭하여 축척을 설정합니다. 알림: 이 설정이 적용되면 열린 모든 이미지에 필드의 계산된 영역이 표시됩니다.view 사용자가 입력한 단위로.</li>
	<li>ImageJ에서 DAPI 전용 이미지를 엽니다. 프로세스(Process ) 탭을 클릭하고 배경 빼기(Subtract Background)를 강조 표시합니다. 얼룩지지 않은 영역이 검은색이 될 때까지 배경을 한 번에 50픽셀씩 제거합니다. 참고: 이미지에 배경이 포함되어 있지 않으면 이 단계가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>이미지(Image) 탭을 클릭하고 유형(Type)을 강조 표시합니다. 8비트를 클릭하여 이미지를 회색조로 만듭니다[그림 2(2)].</li>
	<li>모든 DAPI 입자를 포함하도록 이미지를 수동 또는 자동으로 임계값으로 설정합니다(임계값을 수동으로 초과하지 않도록 주의). 이미지(Image) 탭을 클릭하고 조정(Adjust)을 선택합니다. 임계값을 클릭합니다. 완료되면 Apply(적용)를 클릭합니다.</li>
	<li>프로세스( Process ) 탭을 클릭하고 바이너리(Binary)를 강조 표시합니다. 유역을 클릭합니다.</li>
	<li>Analyze( 분석 ) 탭을 클릭하고 Analyze Particles(입자 분석 )를 강조 표시/클릭합니다[그림 2 (4)]. 크기( Size ) 를 5-무한대(5-infinity ) 로, 원형도(Circularity ) 를 0.00-1.00 으로 설정합니다. 표시( Show ) 드롭다운 탭에서 윤곽선(Outlines)을 선택합니다. 결과 표시(Display Results), 요약(Summarize) 및 구멍 포함(Include Holes) 이 선택되어 있는지 확인합니다. 확인을 클릭합니다. 참고: 임계값 설정이 배경 픽셀을 생성하는 경우 원하는 입자 범위를 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>카운트 결과를 TOTAL DAPI로 기록합니다.</li>
	<li>ImageJ에서 병합된 Cytokeratin 18/DAPI 이미지를 엽니다.</li>
	<li>Multi-Point [그림 2 (5)] 아이콘을 사용하여 Cytokeratin 18에 대해 염색되지 않은 모든 DAPI 입자를 수동으로 계수합니다.</li>
	<li>결과를 FEEDER CELLS로 기록합니다. 아래 방정식을 사용하여 간세포 DAPI를 결정합니다. 간세포 DAPI = 총 DAPI - 피더 셀 DAPI</li>
</ol>9. 총 부착 간세포의 정량 및 부착률(Plateability)
<ol><li>아래 방정식을 사용하여 24웰 배양 영역에 대한 축척 계수를 생성합니다. 시야 측정은 열린 각 이미지의 상단에서 찾을 수 있습니다[그림 2 (2), 녹색 상자]. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq03.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>아래 방정식을 사용하여 부착된 총 간세포를 계산합니다. 부착된 간세포 = 배율 계수 × 간세포 DAPI</li>
	<li>아래 방정식을 사용하여 간세포의 부착률을 계산합니다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq05.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>10. 알부민 분석
<ol><li>1:200으로 희석된 샘플에서 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)( 재료 표 참조)을 사용하여 알부민 생산을 측정합니다. 알림: 정확도를 위해 사용자는 샘플이 표준 곡선 선형 범위 내에 있는지 확인합니다. 지정된 키트는 분석을 수행하기 위한 모든 재료와 지침을 제공합니다.</li>
	<li>아래 방정식을 사용하여 부착된 간세포에 대한 샘플 농도를 정규화합니다. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq06.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>11. 우레아 분석
주의: 혈액 요소 질소(BUN) 산 시약에는 황산이 포함되어 있습니다. BUN 산 시약의 황산 농도는 부식성으로 간주됩니다. 섭취하지 마십시오. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고 적절한 PPE를 착용하십시오.
<ol><li>요소 합성은 변형된 디아세틸 모노심 방법을 사용하여 측정됩니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>75mg/dL 요소 53.3μL를 346.7μL의 완전 배양 배지에 희석하여 표준 #1(100μg/mL)을 만듭니다.</li>
	<li>튜브 2-8에 라벨을 붙이고 1:2 연속 희석을 사용하여 요소 분석 표준물질을 만듭니다(표 1).</li>
	<li>10μL의 시료 또는 표준물질을 검은색 벽의 투명한 바닥 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>샘플이 들어 있는 각 웰에 150μL의 BUN 시약을 추가합니다. BUN 컬러 시약 1/3과 BUN 산 시약 2/3을 혼합하여 BUN 시약을 준비합니다. 아래 방정식을 사용하여 계산을 지원합니다. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq07.jpg" style="margin: auto;"> BUN 색상 시약 (mL) = 필요한 총 BUN 시약 × 0.333 BUN 산 시약 (mL) = 필요한 총 BUN 시약 × 0.667</li>
	<li>60°C의 오븐 또는 인큐베이터에서 90분 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>540 nm 및 650 nm에서 플레이트 흡광도를 즉시 판독합니다.</li>
	<li>모든 샘플과 표준물질에서 블랭크 흡광도와 배경 흡광도(650nm)를 빼서 표준 곡선을 만듭니다. 선형 회귀 분석을 통해 최적선을 생성합니다.</li>
	<li>표준 곡선에서 알려지지 않은 시료 농도를 측정합니다.</li>
	<li>아래 방정식을 사용하여 부착된 간세포에 대한 샘플 농도를 정규화합니다. <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/65992/65992eq10.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

A Physiologically-Relevant All-Human 2D+ Hepatic System for Drug Discovery

<ol>
	<li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development.">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li><li>Swift, B., Pfeifer, N. D., Brouwer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich-cultured+hepatocytes:+an+in+vitro+model+to+evaluate+hepatobiliary+transporter-based+drug+interactions+and+hepatotoxicity.">Sandwich-cultured hepatocytes: an in vitro model to evaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions and hepatotoxicity.</a> Drug Metabolism Reviews. 42 (3), 446-471 (2010).</li><li>Baudy, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+stress+induced+cell+death+mechanisms+in+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma:+in+vitro+and+in+vivo+study.">Heat stress induced cell death mechanisms in hepatocytes and hepatocellular carcinoma: in vitro and in vivo study.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 46 (4), 290-301 (2014).</li><li>Mooney, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+from+differentiation+to+growth+in+hepatocytes:+control+by+extracellular+matrix.">Switching from differentiation to growth in hepatocytes: control by extracellular matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 151 (3), 497-505 (1992).</li><li>Berthiaume, F., Moghe, P. V., Toner, M., Yarmush, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+morphology+and+cytochrome+P450+expression+in+human+hepatocytes+by+extracellular+matrix+and+cell-cell+interactions.">Regulation of cell morphology and cytochrome P450 expression in human hepatocytes by extracellular matrix and cell-cell interactions.</a> Cell and Tissue Research. 306 (1), 85-99 (2001).</li><li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane.">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li><li>Sivaraman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscale+in+vitro+physiological+model+of+the+liver:+predictive+screens+for+drug+metabolism+and+enzyme+induction.">A microscale in vitro physiological model of the liver: predictive screens for drug metabolism and enzyme induction.</a> Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).</li><li>Goulet, F., Normand, C., Morin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+promote+tissue-specific+function,+biomatrix+deposition+and+junctional+communication+of+primary+cultured+hepatocytes.">Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes.</a> Hepatology. 8 (5), 1010-1018 (1988).</li><li>Odanga, J. J., Breathwaite, E. K., Presnel, S., LeCluyse, E. L., Weaver, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes+from+diseased+and+healthy+livers+in+an+all-human+cell+based+triculture+system.+The+Toxicologist,+a+Supplement+to+Toxicological+Sciences.">Characterization of primary human hepatocytes from diseased and healthy livers in an all-human cell based triculture system. The Toxicologist, a Supplement to Toxicological Sciences.</a> , 4283 (2023).</li></ol>

JO, LW, EG, EL, SP 및 JW는 TV2D+를 제작하는 비영리 단체인 LifeNet Health의 직원입니다.

설명된 간 배양 시스템은 표준 조직 배양 기기를 갖춘 실험실에서 확립될 수 있습니다. 공급 세포로 배양된 PHH로 구성된 이 시스템을 통해 사용자는 안정적인 알부민 생산 및 요소 합성으로 최소 2주 동안 PHH를 배양할 수 있습니다. PHH 공여체 로트 변동성으로 인해 사전 선별되고 자격을 갖춘 PHH만 시스템에서 사용하는 것이 좋습니다. 부착된 PHH의 수는 공여체 로트와 파종 밀도에 따라 다르지만, 상대적인 도금성은 각 공여체 로트 내에서 비슷하게 유지됩니다. 권장되는 파종 밀도가 권장되지만, 위의 데이터는 간세포 파종 밀도가 다양한 실험 요구에 맞게 조정될 수 있음을 시사합니다. 그러나 더 많은 수의 PHH를 시드하면 더 높거나 더 일관된 기능 출력을 제공하지 않을 수 있습니다. 평가된 PHH 로트의 분석은 150,000 PHHs/well 및 200,000 PHHs/well의 더 낮은 파종 밀도를 사용하여 알부민 생산 및 요소 합성에 대한 가장 낮은 CV를 보여주었습니다. 그러나 파종 밀도에서 알부민과 요소 사이에는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. 250,000 PHHs/well 및 300,000 PHHs/well의 더 높은 파종 밀도는 14일 배양 기간 동안 알부민과 요소가 더 많이 감소함을 보여줍니다. 플레이트성의 고유한 공여체 변동성은 테스트된 공여체 로트에 대해 250,000PHH/웰 및 300,000PHH/웰에서 알부민 생산 및 요소 합성의 일관성에 영향을 미칠 수 있습니다. 대형 간세포 스페로이드와 유사하게, TV2D+ 시스템에서 PHH를 과도하게 파종하면 PHH의 장기적인 배양 및 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
해동, 도금 및 유지 관리의 모든 단계는 성공적인 배양 및 데이터 생성에 매우 중요합니다. 그러나 경험이 없는 사용자가 피할 수 있는 몇 가지 일반적인 실수가 있습니다. PHH는 온도 변동, 전단 응력 및 공기 노출에 따른 손상에 매우 취약합니다 9,10. PHH를 해동할 때 장시간의 해동 시간과 과도한 피펫팅을 피하기 위해 예방 조치를 취해야 합니다. 손으로 붓는 방법, 타이머를 사용하고 수조에서 얼음으로 즉시 옮기면 PHH의 생존력과 도금성에 영향을 줄 수 있는 이러한 일반적인 오류를 줄일 수 있습니다. 또한 공급망 문제가 점점 더 보편화됨에 따라 콜라겐 코팅 플레이트를 구하기 어려울 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해 콜라겐 유형 I(5-10μg/cm2)의 상용 용액을 사용하는 조직 배양 처리 플레이트의 수동 코팅을 사용할 수 있습니다. 그러나 최적의 성능과 일관성을 위해서는 사전 코팅된 콜라겐 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 피더 셀 전용 배양에서 PHH 도입으로 전환하는 과정에서 피더 셀 층이 건조되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 피더 셀에 공기가 노출되지 않도록 하십시오. 공기 노출 시간은 공급세포층 품질 저하로 이어질 수 있으며, 이는 PHH의 장기 배양에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 배지 변화 사이에 소량의 잔류 배지가 남아 있도록 하는 것이 가장 좋습니다. 때때로, PHH는 분리로 인한 과도한 파편을 포함할 수 있으며, 이는 형태를 보기 어렵게 만들 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 매체를 교체하기 전에 플레이트를 흔들고 진공 흡입을 사용하십시오. 마지막으로, 배지 교체를 수행할 때 배양된 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 사용한 배지를 조심스럽게 흡입합니다. 피펫팅이 세포층에 직접 닿는 것을 방지하기 위해 웰 측면에 중간 부피의 신선한 피펫팅을 합니다. 또한 사용자는 권장되는 3-웰 교체(섹션 3 및 4)를 사용하여 모든 매체 교체 시 공기 노출을 피해야 합니다. 또한 매일 매체를 바꾸는 것이 이상적이지만 필수는 아니라는 점에 유의해야 합니다.
형광 현미경은 대부분의 실험실에서 보편화되었지만 특정 이미지 분석을 수행하는 데 필요한 소프트웨어에는 추가 비용이 발생할 수 있습니다. ImageJ는 무료로 다운로드할 수 있어 쉽게 액세스할 수 있는 이미지 분석 도구입니다. 프로토콜의 단계는 사용자가 최적화해야 할 수 있는 기반, 특히 DAPI 염색의 입자 분석을 제공합니다. 그러나 형광 이미징 기능이 없는 경우 14일째의 PHH 부착 값은 로트별 분석 인증서에 제공됩니다. 임계값이 잘못되면 DAPI 입자의 계수가 부정확해집니다. 또한 크기 제외를 설정하기 전에 개별 DAPI 입자의 표면적을 확인하는 것이 좋습니다. 이 작업은 타원형 아이콘[그림 2(1), 편집 탭 아래의 원 아이콘]을 사용하고 DAPI 입자를 둘러싸는 원을 그리면 됩니다. 그런 다음 분석 탭을 사용하여 선택한 DAPI 입자의 면적을 측정할 수 있습니다. 특정 측정값은 분석 탭의 측정 설정을 사용하여 선택할 수 있습니다[8.9단계 및 그림 2(4)].
PHH를 배양하기 위한 현재의 방법에는 전통적인 2차원 단일배양에서 세포 부착을 증가시키기 위한 콜라겐-I과 같은 코팅의 사용이 포함되며,11 또는 일반적으로 "샌드위치 배양"12,13,14,15이라고 하는 기술인 쥐 기반 Matrigel과 같은 세포외 기질로 오버레이하는 것이 포함됩니다 . 샌드위치 배양 기법은 전통적인 단일배양에 비해 시간이 지남에 따라 PHH 형태 및 극성을 개선하지만, 두 접근법 모두 대부분의 도금 가능한 PHH 로트에 대한 배양에서 장기적인 표현형 안정성이 여전히 부족합니다. PHH를 배양하는 데 사용되는 또 다른 방법은 3D 스페로이드를 만드는 것입니다. 그러나 이전에 Glicklis et al.4에 의해 언급된 바와 같이, 공여체 변동성으로 인해 스페로이드 크기의 재현성에 기술적 문제가 있을 수 있습니다. 생리학적으로 더 관련성이 높은 간 모델을 만들기 위한 노력의 일환으로 다세포 모델이 개발되었습니다. Ware et al.7에 기술된 바와 같이, 미세패터닝을 사용하여 PHH로 둘러싸인 쥐 섬유아세포와 1차 인간 간 정현파 내피 세포는 시험관 내 배양 시간을 더 길게 할 수 있었습니다. 그러나 마이크로 패터닝은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 과정일 수 있으며, 인간이 아닌 공급 세포는 대사 신호의 배경에 기여할 수 있어 특정 응용 분야에서 이 플랫폼의 유용성을 제한할 수 있습니다. 간세포의 공동 배양을 위한 공급세포로서 인간 및 쥐 진피 섬유아세포 및 소 대동맥 내피세포를 포함한 다양한 비간세포의 사용은 간 기원의 공급세포의 공동배양과 유사한 알부민 분비 및 긴밀한 접합 형성을 보여주었다16. 그러나 이 시스템에서 PHH의 안정성과 기능에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해서는 TV2D+ 비간 공급 세포와 배양 내 PHH 간의 상호 작용 메커니즘을 추가로 조사해야 합니다. 이전에 Weaver et al.8에 의해 기술된 배양 시스템은 최대 42일 동안 간 콜로니에서 PHH를 성공적으로 배양하여 광범위한 담관 네트워크를 형성할 수 있습니다. 이 시스템에서 배양된 PHH는 시토크롬 1A2, 2B6 및 3A4 활성과 Uridine 5′-diphospho-glucuronosyltransferase(UGT) 기반 효소 활성, I상 및 II상 대사산물 형성, 알부민 생성 및 요소 합성을 포함한 주요 간 기능을 Matrigel 없이 시험관 내에서 최소 22일 동안 유지했습니다. 이 배양 시스템은 약리학 및 독성학 응용 분야를 위한 모든 실험실에 쉽게 적용할 수 있는 안정적이고 생리학적으로 적절한 결과를 생성합니다. 주요 PHH 기능은 TV2D+ 시스템에서 유지되지만 3D 스페로이드 모델과 직접적인 비교는 이루어지지 않았습니다. 그러나 배양 시스템 간에 동일한 PHH 공여체를 비교하는 향후 연구는 두 방법의 한계와 이점을 결정하는 데 중요한 것으로 입증될 것입니다.
TV2D+의 잠재적 응용 분야에는 낮은 회전율 화합물의 대사 청소 및 약물 간 상호 작용 평가, 약물 유발 간 손상 및 농약의 위험 평가가 포함됩니다. 신약 및 신약의 간 청소율을 정확하게 예측하려면 주요 간세포 기능을 유지하면서 안정적이고 장기화된 PHH 배양이 필요하며, 이는 회전율이 낮은 화합물을 평가할 때 특히 어렵습니다. 또한 위험 평가 및 화학적 유발 간 독성은 주요 건강 문제이며, 현재 모델은 급성 노출에 이차적일 수 있는 잠재적인 만성 화학 독성을 정확하게 평가하기 위한 배양의 장기적인 안정성과 기능을 제공하지 않습니다. TV2D+에서 배양된 건강한 PHH와 병든 PHH는 시간이 지나도 유지되는 기능 및 지질 성향의 특징적인 차이를 보였다17. 이러한 연구는 TV2D+가 다양한 약리학 및 독성학적 응용 분야를 위한 유망한 도구임을 뒷받침합니다.

치료의 안전성과 효능을 예측하는 것은 전임상 약물 개발의 중요한 부분입니다. 그러나, 종래의 전임상 시험관 내 간 모델은 생체 내 간 세포 미세환경을 정확하게 모방하고 시간이 지남에 따라 간세포 기능 및 형태를 유지하는 능력에 한계가 있습니다. 느린 회전율 화합물을 평가하거나 아급성 또는 만성 노출과 관련된 결과를 조사하기 위해 1주일 이상 안정적인 대사 능력을 제공하는 모델이 필요합니다. In vivo 동물실험은 인간 간 세척 기전의 병진 종 차이로 인해 약물 효능과 위험을 예측하지 못하는 경우가 많다1. 기존의 1차 인간 간세포(PHH) 단일배양 또는 샌드위치 배양과 같은 현재의 시험관 내 2차원(2D) 간 모델은 배양에서 표현형 안정성과 수명이 부족하여 시간이 지남에 따라 주요 간세포 기능과 구조적 무결성이 손실됩니다2. 또 다른 방법은 3차원(3D) 간세포 스페로이드를 형성하는 것으로, 2D 배양에 비해 더 관련성이 높은 미세환경을 제공합니다. 그러나 이 방법은 원료의 가용성, PHH 공여체 로트 선택, 재현성 및 스페로이드 크기 3,4,5,6 증가에 따른 생존력 손실로 인해 제한됩니다. PHH가 고정된 크기의 미세 패턴 플레이트에 공급 셀과 함께 파종되는 다세포 플랫폼이 도입되었습니다. 이러한 모델은 배양 시간을 연장할 수 있지만, 이러한 플랫폼에 사용되는 비인간 공급 세포는 약물 제거 및 대사 프로파일에 대한 타고난 배경 기여로 인해 실험 결과를 변경하고 적용을 제한할 수 있습니다 1,7. 최근 Weaver, etal 8에 설명된 TruVivo all-human 2D+ hepatic system(TV2D+)은 PHH의 전통적, co-culture 및 3D 배양 방법의 일부 한계를 해결하기 위해 개발되었습니다. non liver feeder cell은 신진대사 및 paracrine 생산의 종간 차이를 줄이고 확장, 표현형 및 성능의 제한으로 인해 단일 기증자 로트의 해당 비실질 간세포가 제공할 수 없는 재현 가능하고 강력한 방식으로 원발성 간세포에 필요한 지원을 제공합니다. 선택된 공급 세포는 사용 전에 일관되게 확장할 수 있었고 형질전환 또는 분화가 필요하지 않았습니다. Glicklis et al.4 및 Khetani et al.5에 의해 기술된 바와 같이, 간세포 스페로이드와 같은 3D 배양 모델은 공여체 변동성으로 인한 재현성 및 스페로이드 크기의 일관성 유지에 문제가 있으며, 이는 200μm 이상의 스페로이드에서 영양소 확산에 영향을 미쳐 생존율과 기능을 감소시킵니다. 3D 스페로이드 형성과 마찬가지로 TV2D+ 시스템은 PHH의 자체 조립에 의존합니다. 그러나 형성된 PHH 콜로니는 단일 응집체로 압축되지 않고 단일 셀 깊이에서 유정의 표면적에 분산됩니다. 이 배양 방법은 공여체 변동성을 해결하는 데 유용할 수 있으며, PHH를 도금, 배양 및 다양한 파종 밀도에서 기본 기능을 유지할 수 있습니다. TV2D+ 시스템은 또한 3D 스페로이드에서 확장된 배양을 수행하는 데 필요한 특수 장비 또는 조작 중 손실로 인한 사용자 처리의 견고성을 높일 수 있습니다.

TV2D+ 시스템은 표준 2D 배양과 일반적으로 3D 시스템에 수반되는 수명 및 표현형 안정성을 결합합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 생물 안전 작업대, 원심분리기 및CO2 인큐베이터와 같은 표준 장비를 갖춘 실험실에서 기본 조직 배양 기술을 갖춘 사용자를 위한 단계별 지침을 제공합니다. 공정의 각 단계는 배지 준비, 해동, 도금 및 결과 배양 시스템의 유지 관리를 포함하여 자세히 설명되어 있습니다. 이 프로토콜에는 또한 기본 간세포 기능 출력, 알부민 및 요소를 결정하는 방법과 정상화를 위한 PHH 부착을 결정하기 위한 면역형광 이미지 분석이 포함되어 있습니다. 적절하게 확립되면 TV2D+의 PHH는 본래의 간 형태를 모방하여 간세포 군집으로 조직화되고 최소 2주 동안 확장된 생존력, 구조적 무결성, 생리학적으로 관련된 수준의 알부민 및 요소를 유지합니다8. 이 시스템은 다양한 PHH 파종 밀도를 허용할 수 있기 때문에, 바람직한 공여체 특성을 갖는 도금성이 낮은 PHH 로트의 가용성을 증가시키는 데 유용할 수 있습니다. 이러한 접근성과 기능성의 조합으로 인해 TV2D+는 다양한 약리학 및 독성학 응용 분야에 적합한 간 모델입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m PES&#160; filter unit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>565-0020</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL or 50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>352196 or 352070</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-21428</td>
			<td>Other secondary antibodies can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 18 antibody&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab24561</td>
			<td>Necessary using same dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AOPI&#160;</td>
			<td>Nexcelom&#160;</td>
			<td>CS2-0106-5mL</td>
			<td>Used for Cellometer counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>Labconoco</td>
			<td>3460801</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black-walled, clear bottom, 96-well plate&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>165305</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall X4R</td>
			<td>Capable of speeds up to 400 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen coated plate, 24-well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662950</td>
			<td>Rat tail collagen coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides</td>
			<td>Nexcelom&#160;</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td>Used for Cellometer counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium&#160;</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>MED-TCCM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture supplement&#160;</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>MED-TCSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>Contains mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (-Ca, -Mg)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14190250</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder cell supplement&#160;</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>MED-TCSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder cell thawing medium</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>MED-FCTM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1</td>
			<td>Equipped with user specific filters&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte thawing medium</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>MED-HHTM4C-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human albumin ELISA kit&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab108788</td>
			<td>Necessary if using same dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human feeder cells</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>PHFC24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97025-842</td>
			<td>Capable of 5% CO2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC Fixation buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>00-8222-49</td>
			<td>Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Insitute of Health&#160;</td>
			<td>Version 1.52a&#160;</td>
			<td>1.52a or higher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK40-F100</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-022</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes (various sizes)</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>ErgoOne</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td>Other permeabilization buffers can work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader&#160;</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>CLARIOstar</td>
			<td>Capable of reading absorbance 450-640 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating medium&#160;</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>MED-TCPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating supplement&#160;</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>MED-TCSB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human hepatocytes&#160;</td>
			<td>LifeNet Health&#160;</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>Catalog number may vary based on lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A-21428</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet controller</td>
			<td>Gilson&#160;</td>
			<td>F110120</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage bottle 100&#8211;500 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76311-770</td>
			<td>User preference&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea Nitrogen (BUN) Test&#160;</td>
			<td>Stanbio</td>
			<td>0580-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>PolyScience</td>
			<td>WBE05</td>
			<td>Capable for use at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an all-human hepatic culture system for drug development applications

약리학 및 독성학 연구를 위한 1차 인간 간세포(PHH)에 대한 장기적이고 인간과 관련된 배양 모델을 찾는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 현재의 in vitro 모델 플랫폼은 종종 불편하고 복잡하며, 시간 경과에 따른 표현형 안정성이 부족하고, 여러 PHH 로트를 지원하지 않아 실험 재현성과 유연성이 부족합니다. 여기에서는 일반적으로 더 복잡한 3차원(3D) 시스템에 수반되는 시간 경과에 따른 수명과 표현형 안정성을 유지하면서 표준 2차원(2D) 배양 기술 및 장비를 활용하는 전인 2D+ 간 시스템(TV2D+)의 해동, 도금 및 유지 관리를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 결과는 PHH 파종 밀도의 함수로서 TV2D+의 부착 및 도금성 비율과 배양 시 최소 2주 동안 안정적인 기능을 보여줍니다. 성공적인 장기 배양을 달성하기 위해 다양한 PHH 파종 밀도를 평가합니다. TV2D+의 PHH가 적절하게 확립되면 간세포 군집으로 조직되고, 간 특이적 마커를 발현하며, 생존력, 구조적 무결성, 생리학적으로 관련된 수준의 알부민 및 요소를 유지합니다. 이러한 고유한 특성의 조합으로 인해 TV2D+ 시스템은 다양한 약리학 및 독성학적 응용 분야에 적합한 간 모델입니다.

Predicting therapeutic safety and efficacy is an important part of preclinical drug development. However, conventional preclinical in vitro hepatic models are limited in their ability to accurately mimic the in vivo liver cellular microenvironment and maintain hepatocyte functionality and morphology over time. There is a need for models that provide stable metabolic competence for more than 1 week to assess slow-turnover compounds or investigate outcomes associated with sub-acute or chronic exposure. In vivo animal tests often fail to predict drug efficacy and risk due to translational species differences in human hepatic clearance mechanisms1. Current in vitro 2-dimensional (2D) hepatic models, such as traditional primary human hepatocyte (PHH) monoculture or sandwich cultures, lack phenotypic stability and longevity in culture, leading to loss of key hepatocellular function and architectural integrity over time2. An alternative method involves the formation of 3-dimensional (3D) hepatocyte spheroids, offering a more relevant microenvironment versus 2D culture. However, this method is limited by the availability of raw materials, PHH donor-lot selection, reproducibility, and loss of viability with increasing spheroid size3,4,5,6. Multicellular platforms have been introduced whereby PHHs are seeded with feeder cells onto fixed-sized, micropatterned plates. Though these models may enable longer culture times, non-human feeder cells used in these platforms can alter experimental outcomes and limit their application due to innate background contribution to drug clearance and metabolic profiles1,7. The TruVivo all-human 2D+ hepatic system (TV2D+) recently described in Weaver, et al8, was developed to address some of the limitations of traditional, co-culture, and 3D culture methods of PHHs. The non liver feeder cells reduce the interspecies differences in metabolism and paracrine production and provide the support necessary for primary hepatocytes in a reproducible, robust fashion that cannot be provided by corresponding non-parenchymal liver cells from a single donor lot due to limitations in expansion, phenotype, and performance. The feeder cells chosen were able to be consistently expanded before use and lacked the need for transformation or differentiation. As described by Glicklis et al.4 and Khetani et al.5, 3D culture models like hepatocyte spheroids have challenges with reproducibility due to donor variability and maintaining consistency in spheroid size, which affects nutrient diffusion in spheroids greater than 200 &#181;m, leading to decreased viability and functionality. Like 3D spheroid formation, the TV2D+ system relies on self-assembly of PHHs; however, the PHH colonies formed are dispersed over the surface area of the well at a single-cell depth rather than compacted into a single aggregate. This method of culture may be useful to address donor variability, allowing PHHs to be plated, cultured, and maintain basic functionality at various seeding densities. The TV2D+ system may also increase the robustness of user handling due to loss during manipulation or specialized equipment required to perform extended culture in 3D spheroids.

The TV2D+ system combines standard 2D culture with the longevity and phenotypic stability that typically accompany 3D systems. The protocol described herein provides step-by-step directions for users with basic tissue culture skills in laboratories equipped with standard equipment such as biosafety cabinets, centrifuges, and CO2 incubators. Each step in the process is outlined in detail, including media preparation, thawing, plating, and maintenance of the resulting culture system. The protocol also contains a method for determining basic hepatocyte functionality outputs, albumin, and urea, as well as immunofluorescent image analysis for determining PHH attachment for normalization. When established properly, the PHHs in TV2D+ organize into hepatocyte colonies, mimicking the native hepatic morphology, and maintain extended viability, architectural integrity, and physiologically relevant levels of albumin and urea for at least 2 weeks8. Because the system can allow a range of PHH seeding densities, it may be useful in increasing the availability of less plateable PHH lots that have desirable donor characteristics. This combination of accessibility and functionality makes TV2D+ a suitable hepatic model for a variety of pharmacological and toxicological applications.

Author Spotlight: Developing a Simple and Robust Hepatic Model for Pharmacological and Toxicological Applications 

약물 개발 응용 분야를 위한 모든 인간 간 배양 시스템

간 배양 시스템의 도금, 배양 및 기본 기능 검사의 전반적인 방법에는 그림 1과 같이 일반적인 1차 세포 배양 기술 및 분석이 포함됩니다. 간세포 부착 및 플레이트 용이성 비율은 웰당 최소 5개의 사이토케라틴 18 이미지 및 DAPI 염색에 대한 ImageJ 분석을 사용하여 14일째에 계산되었습니다(그림 2). 피더 세포로 배양된 PHH의 대표 이미지는 그림 3에 나와 있습니다. 다양한 간 파종 밀도는 파종 밀도에 따라 합류점의 시각적 차이를 보였으며 14일 동안 배양 동안 전형적인 간, 직육면체 형태를 유지했습니다. 간세포 기증자 로트 A와 B의 이미지는 테스트된 각 파종 밀도에 대해 캡처되었습니다(그림 4A). 사용된 모든 파종 밀도에서 공여체 B(89.04% ± 3.99%, 198,552 ± 49,885 PHHs)의 평균 판금성 백분율은 공여체 A(66.08% ± 6.67%, 146,128 ± 33,063 PHHs)보다 높았습니다. 기증자 A는 250,000-300,000 PHHs/웰(62.75% ± 9.64%)에 비해 150,000 PHHs/웰(76.07% ± 12.87%)을 사용할 때 훨씬 더 높은 플레이트 가능성 퍼센트를 보였습니다. 기증자 B는 간세포 퍼센트 판금성에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 기증자 B는 가장 높은 파종 밀도인 300,000PHHs/well에서 가장 낮은 간세포 플레이트성(85.78% ± 13.25%)을 보였습니다. 공여 A와 유사하게, 공여 B를 150,000 PHHs/well로 파종한 것은 간세포의 판금성 비율이 가장 높았습니다(94.75% ± 15.07%).
알부민 생산 및 요소 합성은 14일 배양 기간 동안 3개의 시점에서 측정하고 부착된 간세포를 계산하여 정규화했습니다. 전반적으로, 공여자 A는 공여자 B에 비해 알부민 생산이 증가했습니다(41.32 ± 4.58 μg alb/day/106 PHHs vs. 34.66 ± 10.03 μg alb/day/106 PHHs)(그림 5). 공여자 A와 B는 각각 150,000 PHHs/well, 45.91 ± 5.96 μg alb/day/106 PHHs, 48.67 ± 20.44 μg alb/day/106 PHHs에서 가장 높은 알부민 생산을 보였다. 알부민 생산에 있어서의 유의한 차이는 사용된 파종 밀도에서 관찰되지 않았다. Baudy et al.3에 의해 기술된 바와 같이, 간 미세생리학적 시스템은 14일 동안 50% 미만의 변화로 일관된 알부민 생산 및 요소 합성을 유지하는 것이 바람직합니다. 변동 계수(CV)는 평균을 7일, 10일, 14일의 표준 편차로 나누어 계산했습니다. 모든 샘플은 중복으로 실행되었습니다. 150,000 PHHs/well에서 14일 배양 기간 동안 알부민 생산량에 대한 CV는 기증자 A의 경우 12.24%, 기증자 B의 경우 37.97%로 원하는 50% 기준보다 낮았습니다. 알부민 생산의 높은 분산은 250,000 및 300,000 PHHs/well에 파종되었을 때 기증자 A와 기증자 B 모두에서 나타났습니다. 이러한 파종 밀도에서 두 기증자 모두 배양 7일, 10일, 14일 사이에 알부민 생산이 급격히 감소합니다(CV 기증자 A, 22.49%, 기증자 B, 45.07%).
7일, 10일 및 14일 PHH 로트 특이 데이터를 평균화했을 때 공여체 B 요소 합성(95.09 ± 18.91μg 요소/일/106 PHHs)이 공여체 A(64.92 ± 4.66μg 요소/일/106 PHHs)에 비해 증가했습니다. 기증자 B(113.49 ± 37.34μg 요소/일/10 6PHHs)와 기증자 A(69.12 ± 17.06μg 요소/일/106 PHHs)는 각각 150,000 PHHs/well 및 200,000 PHHs/well의 밀도로 파종한 14일 배양 기간 동안 가장 큰 요소 합성을 보였습니다. 두 기증자 로트 모두 300,000PHHs/well에서 가장 낮은 요소 출력과 가장 높은 CV를 가졌습니다. 요소 합성에서 사용된 파종 밀도에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. 공여체 A의 요소 합성에 대한 가장 낮은 CV는 공여체 B의 경우 250,000 PPH/웰(23.11%), 200,000 PHH/웰에서 배양되었을 때 나타났습니다. 이러한 결과에서 강조된 바와 같이, 주어진 PHH 로트에 대한 최적의 파종 밀도는 분석 시 원하는 밀도 수준과 측정되는 결과의 특성에 따라 달라집니다. 시드 밀도가 높을수록 항상 더 높은 신호 또는 동적 범위와 상관 관계가 있는 것은 아닙니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig01.jpg"> 그림 1: 공급 세포를 사용한 간세포의 도금, 배양 및 기능 테스트의 흐름도. (A) 공급 세포는 특정 해동 매체( 재료 표 참조)에서 해동되고, 완전한 도금 매체( 재료 표 참조)에 재현탁되고, 세포가 계수됩니다. 세포를 희석하고, 도금하고, 37°C/5%CO2에서 60분 동안 배양합니다. (B) 간세포는 특정 해동 배지( 재료 표 참조)에서 해동되고, 완전한 도금 배지에 재현탁되고, 세포가 계수됩니다. 간세포는 희석되어 공급세포로 도금됩니다. 세포는 37 °C / 5 % CO2 에서 2-4 시간 동안 배양되며, 배양 첫 60 분 동안 15 분마다 N-S-E-W 운동으로 흔들립니다. 도금 배지는 배양 유지를 위해 예열된 완전 배양 배지로 대체된다( 재료 표 참조). 배양균은 매일 공급됩니다. (C) 7일, 10일, 14일째에 알부민 및 요소 테스트를 위해 중간 샘플을 수집합니다. 14일째에 샘플을 채취한 후, 세포를 고정하고 4°C에서 16-24시간 동안 Cytokeratin 18( 재료 표 참조) 항체로 염색합니다. 또한, 적절한 2차 항체에서 배양하고, 세척하고, 캡처 및 이미지 분석을 위해 DAPI( 재료 표 참조)로 장착합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig02.jpg"> 그림 2: ImageJ 소프트웨어를 사용한 이미지 분석. 캡처된 이미지의 ImageJ 처리. 1단계: 스케일은 현미경별 스케일 바를 기반으로 모든 이미지에 적용됩니다. الخطوة 2 : 이미지 유형이 변경됩니다. 3단계: DAPI 입자를 선택하기 위해 임계값 제한이 적용됩니다. 4단계: 입자 분석이 수행되고 카운트가 기록됩니다. الخطوة 5 : 연결된 피더 셀의 수를 결정하기 위해 다지점 도구를 사용하여 병합된 이미지를 계산합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig03.jpg"> 그림 3: feeder cell로 배양된 다양한 간 파종 밀도의 형태. 150,000, 200,000, 250,000 및 300,000 PHH/well의 간 파종 밀도에서 공급세포(50,000세포/웰)로 배양한 PHH의 7일 및 14일째의 대표 이미지. 이미지는 도립 위상차 현미경에서 10x 대물 렌즈를 사용하여 촬영되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig04.jpg"> 그림 4: Fluorescent Immunocytochemistry of various hepatic seeding densities with feeder cell(공급 세포로 배양된 다양한 간 파종 밀도의 형광 면역세포화학). (A) 150,000, 200,000, 250,000 및 300,000 PHHs/well의 간 파종 밀도에서 14일째에 Cytokeratin 18(빨간색) 염색의 대표 이미지. 각 파종 밀도에 대한 2개의 웰을 4°C에서 30분 동안 고정했습니다. 웰은 4°C에서 16-24시간 동안 1차 항체를 1:1000으로 배양하였다. 2차 항체를 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 1:500에 사용했습니다. DAPI(청색) 핵 염색을 실온에서 15분 동안 웰에 첨가하였다. 이미지는 도립 형광 현미경에서 10X 대물 렌즈를 사용하여 촬영되었습니다. 척도 막대 = 100μm. (B) ImageJ를 사용하여 계산된 다양한 간 파종 밀도의 부착 간세포 및 백분율 판금성 계산. *p ≤ 0.05, 200,000, 250,000 및 300,000 PHHs/well에 대한 판금성 퍼센트. 오차 막대는 표준 편차(조건당 n ≥ 5개 이미지)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig05.jpg"> 그림 5: 공급 세포로 배양된 간세포의 알부민 생산. 150,000, 200,000, 250,000 및 300,000 PHHs/well의 간 파종 밀도에서 알부민 생산. 열은 부착된 총 간세포로 정규화된 14일 평균의 알부민/일 마이크로그램을 나타냅니다. 선은 7일, 10일, 14일 사이의 CV를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차(반복실험이 있는 조건당 n ≥ 2개의 웰)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65992/65992fig06.jpg"> 그림 6: 공급세포로 배양된 간세포의 요소 합성. 150,000, 200,000, 250,000 및 300,000 PHHs/well의 간 파종 밀도에서 요소 합성. 컬럼은 부착된 총 간세포로 정규화된 μg 요소/일의 14일 평균을 나타냅니다. 선은 7일, 10일, 14일 사이의 %CV를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차(반복실험이 있는 조건당 n ≥ 2개의 웰)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65992/65992fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>표준(S) #</td>
			<td>농도(μg/mL)</td>
			<td>요소 용액 (μL)</td>
			<td>완전 배양 (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>100</td>
			<td>53.3 75 mg/dL 재고</td>
			<td>346.7</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>100 (S1 솔루션)</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>25</td>
			<td>100 (S2 솔루션)</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>100 (S3 솔루션)</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>6.26</td>
			<td>100 (S4 솔루션)</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>3.125</td>
			<td>100 (S5 솔루션)</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>1.5625</td>
			<td>100 (S6 솔루션)</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>빈</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 요소 표준물질 시료 전처리. 75mg/dL 원수 요소를 사용하여 100μg/mL 요소 용액을 준비합니다. 표준 곡선에 대한 최종 농도에 도달하기 위해 제안된 부피를 분취합니다.

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최근의 기술 발전으로 약물 대사 및 독성 응용 분야를 위한 체외 플랫폼의 대규모 생산이 가능해졌습니다. 모든 인간 2D+ 간계(TV2D+)는 기존의 2차원 배양 방법을 사용하여 생리학적으로 관련된 결과를 제공합니다. 이 프로토콜은 시스템의 설정, 유지 관리 및 적용에서 최종 사용자를 지원합니다.

Finding a long-term, human-relevant culture model for primary human hepatocytes (PHHs) for pharmacological and toxicological studies remains a challenge. ...

TruVivo는 표현형적으로 안정적이고 기능적인 1차 인간 간세포를 유지하는 편리하면서도 강력한 in vitro 플랫폼에 대한 요구를 충족시키기 위해 개발되었습니다. 이러한 특성으로 인해 이 시스템은 전임상 약물 개발과 관련된 광범위한 질문에 답하기 위한 기본 플랫폼 역할을 합니다. 한 가지 과제는 오늘날의 질문에 답하는 데 필요한 생물학적 복잡성을 가지면서도 사용하기 쉬운 다세포 시스템을 만들어야 한다는 것입니다.현재 시스템은 간세포 형태와 기능을 장기적으로 유지하지 못하거나 일상적이고 재현 가능한 결과를 확립하는 데 기술적 문제를 제기하는 경우가 많습니다. TruVivo를 통해 사용자는 기존 2D 세포 배양 기술의 단순성과 유연성에 계속 의존할 수 있습니다. 또한 특별한 장비가 필요하지 않으며 시스템은 기존 분석 방법을 사용할 수 있습니다.TruVivo를 통해 이제 전임상 평가 전에 긴 반감기로 화합물의 대사 청소율, 주요 대사 산물, 주요 제거 경로 및 기타 약동학적 특성을 보다 정확하게 예측할 수 있습니다.